Name: Autor em destaque: Detecção de DNA de Leptospira na água para análise ambiental e vigilância de doenças
Uploaded: 2024-06-14T12:30:00
Description: The dot-blot is a simple, fast, sensitive, and versatile technique that enables the identification of minimal quantities of DNA specifically targeted by ...

Estamos em dívida com a coleção Leptospira do Departamento de Microbiologia e Imunologia da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade Nacional Autônoma do México. Agradecemos a generosa doação das cepas de referência de Leptospira ; Leptospira fainei sorovar Hurstbridge cepa BUT6 e Leptospira biflexa sorovar Patoc cepa Patoc I para o Dr. Alejandro de la Peña Moctezuma. Agradecemos ao Dr. José Antonio Ocampo Cervantes, Coordenador do CIBAC, e ao pessoal pelo apoio logístico. A EDT estava no âmbito do programa Terminal Project para alunos de graduação da Universidade Autônoma Metropolitana-Campus Cuajimalpa. Reconhecemos o Biorender.com software para a criação das figuras 1 e 3 a 9.

1. Preparação da amostra
<ol><li>Concentre cada amostra de água em tubos de microcentrífuga de 1,5 mL por centrifugação a 8.000 x g por 10 min a 4 ° C. Repita esta etapa, quantas vezes forem necessárias, para concentrar a amostra em um volume de 250 μL.</li>
	<li>Use o kit de extração de DNA de acordo com as instruções do fabricante (consulte a Tabela de Materiais).</li>
	<li>Realize a PCR específica de acordo com a sonda dot-blot que será utilizada (Ta...

Ensaio de Dot-Blot para Detecção de DNA de Leptospira em Amostras de Água

As etapas críticas da técnica de dot-blot incluem (1) imobilização de DNA, (2) bloqueio dos locais de ligação livres na membrana com DNA não homólogo, (3) a complementaridade entre a sonda e o fragmento alvo sob condições de recozimento, (4) remoção da sonda não hibridizada e (5) a detecção da molécula repórter41.
O PCR-Dot-blot tem certas limitações, como a técnica não fornece informações sobre o tamanho do fragmento hibridizado...

A leptospirose em humanos tem origem principalmente em fontes ambientais 1,2. A presença de Leptospira em lagos, rios e córregos é um indicador de transmissão de leptospirose entre animais silvestres e animais domésticos e de produção que podem eventualmente entrar em contato com esses corpos d'água 1,3,4. Além disso, Leptospira foi identificada em fontes não naturais, incluindo esgoto, água estagnada e água da torneira 5,6.
Leptospira é uma bactéria distribuída mundialmente 7,8, e o papel do ambiente em sua preservação e transmissão tem sido bem reconhecido. Leptospira pode sobreviver em água potável sob pH e minerais variáveis9 e em corpos d'água naturais1. Também pode sobreviver por longos períodos em água destilada10 e, sob pH constante (7,8), pode sobreviver até 152 dias11. Além disso, Leptospira pode interagir em consórcios bacterianos para sobreviver a condições adversas12,13. Pode fazer parte de biofilmes em água doce com Azospirillum e Sphingomonas e é capaz de crescer e suportar temperaturas superiores a 49 °C14,15. Também pode se multiplicar em solo encharcado e permanecer viável por até 379 dias16, preservando sua capacidade de causar a doença por até um ano17,18. No entanto, pouco se sabe sobre a ecologia dentro dos corpos d'água e como ela se distribui dentro deles.
Desde sua descoberta, o estudo do gênero Leptospira foi baseado em testes sorológicos. Não foi até o século atual que as técnicas moleculares se tornaram mais prevalentes no estudo deste espiroqueta. O dot-blot tem sido pouco utilizado para sua identificação usando (1) uma sonda isotópica baseada no 16S rRNA e em uma repetição de sequência inter-simples (ISSR) 19 , 20 , (2) como um imunoensaio baseado em nanoouro para leptospirose humana aplicada à urina21, ou (3) como um ensaio baseado em anticorpos para amostras de urina bovina22. A técnica caiu em desuso porque foi originalmente baseada em sondas isotópicas. No entanto, é uma técnica bem conhecida que, juntamente com a PCR, produz resultados aprimorados, sendo considerada segura devido ao uso de sondas não isotópicas. A PCR desempenha um papel crucial no enriquecimento do DNA de Leptospira, amplificando um fragmento de DNA específico que pode ser encontrado em pequenas quantidades em uma amostra. Durante cada ciclo de PCR, a quantidade do fragmento de DNA alvo é dobrada na reação. No final da reação, o amplicon foi multiplicado por um fator de mais de um milhão23. O produto amplificado por PCR, muitas vezes não visível na eletroforese de agarose, torna-se visível por hibridização específica com uma sonda marcada com DIG no ponto-blot 24,25,26.
A técnica dot-blot é simples, robusta e adequada para inúmeras amostras, tornando-a acessível a laboratórios com recursos limitados. Tem sido empregado em uma variedade de estudos de bactérias, incluindo (1) bactérias orais27, (2) outros tipos de amostras, como alimentos e fezes28, e (3) a identificação de bactérias não cultiváveis29, muitas vezes de acordo com outras técnicas moleculares. Entre as vantagens oferecidas pela técnica dot-blot estão: (1) A membrana possui alta capacidade de ligação, capaz de ligar mais de 200 μg/cm2 de ácidos nucléicos e até 400 μg/cm2; (2) Os resultados do dot-blot podem ser interpretados visualmente sem a necessidade de equipamento especial e (3) podem ser convenientemente armazenados por anos em temperatura ambiente (RT).
O gênero Leptospira foi classificado em clados patogênicos, intermediários e saprófitos30,31. A distinção entre esses clados pode ser alcançada com base em genes específicos, como lipL41, lipL32 e 16S rRNA. LipL32 está presente nos clados patogênicos e exibe alta sensibilidade em várias ferramentas sorológicas e moleculares, enquanto está ausente em espécies saprófitas21. O gene housekeeping lipL41 é conhecido por sua expressão estável e utilizado em técnicas moleculares32, enquanto o gene16 S rRNA é utilizado para sua classificação.
Esta metodologia pode ser aplicada a grandes volumes de água, uma vez que tenham sido concentrados por centrifugação. Ele permite a avaliação de vários pontos e profundidades dentro de um corpo d'água para detectar a presença de DNA leptospira e o clado ao qual ele pertence. Esta ferramenta é valiosa para fins de triagem ecológica e geral e também pode ser empregada para detectar outras bactérias não cultiváveis que possam estar presentes na água.
Além disso, os ensaios de PCR e dot-blot são técnica e economicamente acessíveis a uma ampla gama de laboratórios, mesmo aqueles que não possuem equipamentos sofisticados ou caros. Este estudo tem como objetivo aplicar o dot-blot à base de digoxigenina para a identificação dos três clados de Leptospira em amostras de água coletadas de corpos d'água naturais.
Cepas bacterianas Doze sorovares de Leptospira (Autumnalis, Bataviae, Bratislava, Canicola, Celledoni, Grippothyphosa, Hardjoprajitno, Icterohaemorrhagiae, Pomona, Pyrogenes, Tarassovi e Wolffi) foram incluídos neste estudo. Esses sorovares fazem parte da coleção do Departamento de Microbiologia e Imunologia da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade Nacional Autônoma do México, e atualmente são utilizados no teste de microaglutinação (SAM).
Todos os sorovares de Leptospira foram cultivados em MCEM e seu DNA foi extraído usando um kit comercial de extração de DNA (ver Tabela de Materiais). Uma mistura de DNA genômico dos doze sorovares foi usada como controle positivo para o clado patogênico Leptospira . Como controle positivo do clado intermediário Leptospira , foi incluído o DNA genômico do sorovar Leptospira fainei Hurstbridge cepa BUT6, e como controle positivo para o clado saprófito Leptospira , o DNA genômico do sorovar Leptospira biflexa Patoc cepa Patoc I.
Os controles negativos consistiram em um plasmídeo vazio, DNA de bactérias não relacionadas (Ureaplasma urealyticum, Staphylococcus aureus, Brucella abortus, Salmonella typhimurium, Shigella boydii, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii e Escherichia coli) e água de grau PCR, que serviu como controle não modelo.
Amostras de água Doze amostras experimentais foram coletadas usando um método de amostragem estratificada aleatória do Centro de Pesquisa Biológica e Aquacultural de Cuemanco (CIBAC) (19° 16' 54" N 99° 6' 11" W). Essas amostras foram obtidas em três profundidades: superficial, 10 e 30 cm (Figura 1A, B). Os procedimentos de coleta de água não afetaram nenhuma espécie ameaçada ou protegida. Cada amostra foi coletada em um tubo de microcentrífuga estéril de 15 mL. Para coletar a amostra, cada tubo foi submerso suavemente na água, preenchido na profundidade selecionada e depois selado. As amostras foram mantidas a 22 °C e prontamente transportadas para o laboratório para processamento.
Cada amostra foi concentrada por centrifugação em tubos de microcentrífuga estéreis de 1,5 mL a 8000 x g por 20 min à temperatura ambiente. Essa etapa foi repetida até que todas as amostras estivessem concentradas em um tubo, que foi então usado para extração de DNA (Figura 1C).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65435/65435fig01v2.jpg"> Figura 1: Concentração de amostras de água por centrifugação. (A) Lagoas de amostragem de água e (B) Córregos naturais. (C) Processamento de amostras de água baseado em centrifugação em etapas repetidas quantas vezes forem necessárias (n). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65435/65435fig01largev2.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Extração de DNA O DNA total foi isolado usando um kit comercial de DNA genômico de acordo com as instruções do fabricante (ver Tabela de Materiais). As extrações de DNA foram eluídas em 20 μL de tampão de eluição, e a concentração de DNA foi determinada por um espectrofotômetro UV a 260-280 nm e armazenada a 4 °C até o uso.
amplificação por PCR Os alvos da PCR foram os 16 genesS rRNA, lipL41 e lipL32, que identificam o DNA do gênero Leptospira e permitem a distinção entre os três clados: patogênico, saprófito e intermediário. Tanto os primers quanto os designs de sondas foram baseados nos trabalhos anteriores de Ahmed et al., Azali et al., Bourhy et al., Weiss et al. e Branger et al.33,34,35,36,37. A sequência de cada sonda, primer e fragmento amplificado é descrita na Tabela 1, e seu alinhamento com as sequências de referência é fornecido no Arquivo Suplementar 1, Arquivo Suplementar 2, Arquivo Suplementar 3, Arquivo Suplementar 4 e Arquivo Suplementar 5. Os reagentes de PCR e as condições de termociclagem são descritos na seção de protocolo.
Os produtos de amplificação foram visualizados por separação eletroforética em um gel de agarose a 1% em TAE (40 mM de base Tris, 20 mM de ácido acético e 1 mM de EDTA; pH 8,3), a 60 V por 45 min com detecção de brometo de etídio, conforme mostrado na Figura Suplementar 1. O DNA genômico obtido de cada sorovar foi usado com concentrações variando de 6 x 106 a 1 x 104 cópias equivalentes genômicas (GEq) em cada reação de PCR, com base no tamanho do genoma de L. interrogans (4, 691, 184 pb)38 para Leptospira patogênica, o tamanho do genoma de L. biflexa (3, 956, 088 pb)39 para Leptospira saprófita, e o tamanho do genoma de L. fainei sorovar Hurstbridge cepa BUT6 (4, 267, 324 pb) com número de acesso AKWZ00000000.2.
A sensibilidade das sondas foi avaliada com DNA de cada sorovar patogênico, sorovar L. biflexa Patoc cepa Patoc I e L. fainei sorovar Hurstbridge cepa BUT6 em cada experimento. Para avaliar a especificidade do ensaio de PCR e hibridização dot-blot, foi incluído DNA de bactérias não relacionadas.
Tabela 1: Primers e sondas de PCR para amplificar produtos para identificar os clados patogênicos, saprófitos e intermediários de Leptospira. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65435/TABLE_1_%207th_PR_%20EMCC.xlsx" target="_blank">Clique aqui para baixar esta tabela.</a>
Ensaio de hibridização de ponto-borrão A técnica é chamada de dot-blot porque os orifícios nos quais a amostra de DNA é colocada têm a forma de um ponto e, quando são sugados para serem fixados no lugar por sucção a vácuo, adquirem essa forma. Essa técnica foi desenvolvida por Kafatos et al.40. A técnica permite a semiquantificação de Leptospira em cada amostra positiva para PCR. O protocolo consiste em uma desnaturação com NaOH 0,4 M à temperatura ambiente, amostras com DNA de Leptospira de 30 ng a 0,05 ng, correspondendo a 6 x 106 a 1 x 104 leptospiras, são borradas em uma membrana de náilon com um aparelho de dot-blot de 96 poços. Após a imobilização, o DNA é ligado à membrana por exposição à luz UV de 120 mJ. Cada sonda de DNA é conjugada com digoxigenina-11 dUTP por uma etapa de catálise de transferase terminal na extremidade 3 '(Digoxigenina é um esteróide vegetal obtido de Digitalis purpurea, usado como repórter41). Após a hibridização rigorosa da sonda de DNA marcada (50 pmol) na temperatura específica no DNA alvo, os híbridos de DNA são visualizados pela reação de quimioluminescência com o anticorpo anti-fosfatase alcalina antidigoxigenina conjugado covalentemente com seu substrato CSPD. A luminescência é capturada pela exposição a um filme de raios-X (Figura 2).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65435/65435fig02v2.jpg"> Figura 2: Etapas do procedimento para o ensaio PCR-dot-blot. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65435/65435fig02largev2.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>REAGENTS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purelink DNA extraction kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>K182002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gotaq Flexi DNA Polimerase (End-Point PCR Taq polymerase kit)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M3001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman filter paper, grade 1,</td>
			<td>Merk</td>
			<td>WHA1001325</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon Membranes, positively charged Roll 30cm x 3 m</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11417240001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments Sheep Polyclonal Primary-antibody</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11093274910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium Base EMJH</td>
			<td>Difco</td>
			<td>S1368JAA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leptospira Enrichment EMJH</td>
			<td>Difco</td>
			<td>BD 279510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocking Reagent</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11096176001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CSPD ready to use Disodium 3-(4-methoxyspiro {1,2-dioxetane-3,2&#8242;-(5&#8242;-chloro) tricyclo [3.3.1.13,7] decan}8-4-yl) phenyl phosphate</td>
			<td>Merk</td>
			<td>11755633001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxyribonucleic acid from herring sperm</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D3159</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Developer Carestream</td>
			<td>Carestream Health Inc</td>
			<td>GBX5158621</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digoxigenin-11-ddUTP</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11363905910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA, Disodium Salt (Dihydrate)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>H5032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll 400</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F8016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixer Carestream</td>
			<td>Carestream Health Inc</td>
			<td>GBX 5158605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lauryl sulfate Sodium Salt (Sodium dodecyl sulfate; SDS) C12H2504SNa</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L5750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N- Lauroylsarcosine sodium salt CH3(CH2)10CON(CH3) CH2COONa</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L-9150</td>
			<td>It is an anionic surfactant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polivinylpyrrolidone (PVP-40)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>PVP40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene glycol Sorbitan monolaurate (Tween 20)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>9005-64-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>151-21-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>1310-73-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic (NaH2PO4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>7558-79-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Terminal transferase, recombinant</td>
			<td>Roche</td>
			<td>3289869103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris hydrochloride (Tris HCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1185-53-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SSPE 20X</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2015-1L</td>
			<td>It can be Home-made following Supplementary File 6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primers</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>On demand</td>
			<td>Follow table 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Probes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>On demand</td>
			<td>Follow table 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop&#8482; One Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo-Scientific</td>
			<td>ND-ONE-W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated microcentrifuge Sigma 1-14K, suitable for centrifugation of 1.5 ml microcentrifuge tubes at 14,000 rpm</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1-14K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disinfected adjustable pipettes, range 2-20 &#181;l, 20-200 &#181;l</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>SKU:F167360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable 1.5 ml microcentrifuge tubes (autoclaved)</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-150-SP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable 600 &#181;l microcentrifuge tubes (autoclaved)</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>3208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Pipette tips 1-10 &#181;l</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>T-300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Pipette tips 1-200 &#181;l</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>TR-222-Y</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dot-Blot apparatus Bio-Dot</td>
			<td>BIORAD</td>
			<td>1706545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Portable Hergom Suction</td>
			<td>Hergom</td>
			<td>7E-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scientific Light Box (Visible-light PH90-115V)</td>
			<td>Hoefer</td>
			<td>PH90-115V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV Crosslinker</td>
			<td>Hoefer</td>
			<td>UVC-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Hybaid PCR Express Thermocycler</td>
			<td>Hybaid</td>
			<td>HBPX110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Radiographic cassette with IP Plate14 X 17</td>
			<td>Fuji</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

polymerase chain reaction and dot-blot hybridization for leptospira detection in water samples

O dot-blot é uma técnica simples, rápida, sensível e versátil que permite a identificação de quantidades mínimas de DNA especificamente direcionadas pela hibridização da sonda na presença de DNA transportador. Baseia-se na transferência de uma quantidade conhecida de DNA para um suporte sólido inerte, como uma membrana de náilon, utilizando o aparelho de dot-blot e sem separação eletroforética. As membranas de nylon têm a vantagem de alta capacidade de ligação de ácidos nucleicos (400 μg/cm2), alta resistência e são carregadas positiva ou neutramente. A sonda usada é um fragmento de ssDNA altamente específico de 18 a 20 bases marcadas com digoxigenina (DIG). A sonda se conjugará com o DNA da Leptospira . Uma vez que a sonda tenha hibridizado com o DNA alvo, ela é detectada por um anticorpo anti-digoxigenina, permitindo sua fácil detecção por meio de suas emissões reveladas em um filme de raios-X. Os pontos com uma emissão corresponderão aos fragmentos de DNA de interesse. Este método emprega a marcação não isotópica da sonda, que pode ter uma meia-vida muito longa. A desvantagem deste imunomarcador padrão é uma sensibilidade mais baixa do que as sondas isotópicas. No entanto, é mitigado pelo acoplamento da reação em cadeia da polimerase (PCR) e ensaios de dot-blot. Essa abordagem permite o enriquecimento da sequência alvo e sua detecção. Além disso, pode ser usado como uma aplicação quantitativa quando comparado com uma diluição em série de um padrão bem conhecido. Uma aplicação de dot-blot para detectar Leptospira dos três clados principais em amostras de água é apresentada aqui. Esta metodologia pode ser aplicada a grandes quantidades de água, uma vez que tenham sido concentradas por centrifugação para fornecer evidências da presença de DNA de Leptospira. Esta é uma ferramenta valiosa e satisfatória para fins gerais de triagem, podendo ser utilizada para outras bactérias não cultiváveis que possam estar presentes na água, melhorando a compreensão do ecossistema.

Leptospirosis in humans mainly originates from environmental sources1,2. The presence of Leptospira in lakes, rivers, and streams is an indicator of leptospirosis transmission among wildlife, and domestic and production animals that may eventually come into contact with these bodies of water1,3,4. Furthermore, Leptospira has been identified in non-natural sources, including sewage, stagnant and tap water5,6.
Leptospira is a worldwide distributed bacteria7,8, and the role of the environment in its preservation and transmission has been well recognized. Leptospira can survive in drinking water under variable pH and minerals9, and in natural bodies of water1. It can also survive for long periods in distilled water10, and under constant pH (7.8), it may survive up to 152 days11. Moreover, Leptospira may interact in bacterial consortiums to survive harsh conditions12,13.&#160;It may be part of biofilms in freshwater with Azospirillum and Sphingomonas and is even capable of growing and enduring temperatures exceeding 49 &#176;C14,15. It can also multiply in waterlogged soil and remain viable for up to 379 days16, preserving its ability to cause the disease for as long as a year17,18. However, little is known about the ecology within water bodies and how it is distributed within them.
Since its discovery, the study of the genus Leptospira was based on serological tests. It was not until the current century that molecular techniques became more prevalent in the study of this spirochaete. The dot-blot has been scarcely used for its identification using (1) an isotopic probe based on the 16S rRNA and on an inter-simple sequence repeat (ISSR)19,20, (2) as a nanogold based immunoassay for human leptospirosis applied to urine21, or (3) as an antibody-based assay for bovine urine samples22. The technique fell in disuse because it was originally based on isotopic probes. However, it is a well-known technique that, coupled with PCR, yields enhanced results, and it is considered safe due to the use of non-isotopic probes. PCR plays a crucial role in the enrichment of the Leptospira DNA by amplifying a specific DNA fragment that may be found in trace amounts in a sample. During each PCR cycle, the amount of the targeted DNA fragment is doubled in the reaction. At the end of the reaction, the amplicon has been multiplied by a factor of more than a million23. The product amplified by PCR, often not visible in agarose electrophoresis, becomes visible through specific hybridization with a DIG-labeled probe in the dot-blot24,25,26.
The dot-blot technique is simple, robust, and suitable for numerous samples, making it accessible to laboratories with limited resources. It has been employed in a variety of bacteria studies, including (1) oral bacteria27, (2) other sample types such as food and feces28, and (3) the identification of unculturable bacteria29, often in agreement with other molecular techniques. Among the advantages offered by the dot-blot technique are: (1) The membrane has a high binding capacity, capable of binding over 200 &#956;g/cm2 of nucleic acids and up to 400 &#956;g/cm2; (2) Dot-blot results can be visually interpreted without requiring special equipment, and (3) they can be conveniently stored for years at room temperature (RT).
The genus Leptospira has been classified into pathogenic, intermediate, and saprophytic clades30,31. The distinction among these clades can be achieved based on specific genes such as lipL41, lipL32, and the 16S&#160;rRNA. LipL32 is present in the pathogenic clades and exhibits high sensitivity in various serological and molecular tools, whereas it is absent in saprophyte species21. The housekeeping gene lipL41 is&#160;known for its stable expression and used in molecular techniques32, while the 16S&#160;rRNA gene is utilized for their classification.
This methodology can be applied to large volumes of water once they have been concentrated by centrifugation. It allows the assessment of various points and depths within a water body to detect the presence of leptospiral DNA and the clade to which it belongs. This tool is valuable for both ecological and general screening purposes and can also be employed to detect other non-culturable bacteria that may be present in water.
Additionally, PCR and dot-blot assays are technically and economically affordable to a wide range of laboratories, even those lacking sophisticated or expensive equipment. This study aims to apply the digoxigenin-based dot-blot for the identification of the three Leptospira clades in water samples collected from natural bodies of water.
Bacterial strains 
Twelve Leptospira serovars (Autumnalis, Bataviae, Bratislava, Canicola, Celledoni, Grippothyphosa, Hardjoprajitno, Icterohaemorrhagiae, Pomona, Pyrogenes, Tarassovi, and Wolffi) were included in this study. These serovars are part of the collection at the Department of Microbiology and Immunology, Faculty of Veterinary Medicine and Zootechnics, National Autonomous University of Mexico,&#160;and they are currently used in the microagglutination test (MAT).
All Leptospira serovars were cultured in EMJH, and their DNA was extracted using a commercial DNA extraction kit (see Table of Materials). A genomic DNA mix of the twelve serovars was used as a positive control for the Leptospira pathogenic clade. As a positive control of the Leptospira intermediate clade, genomic DNA from Leptospira fainei serovar Hurstbridge strain BUT6 was included, and as a positive control for the Leptospira saprophyte clade, genomic DNA of Leptospira biflexa serovar Patoc strain Patoc I, was also included.
Negative controls consisted of an empty plasmid, DNA from non-related bacteria (Ureaplasma urealyticum, Staphylococcus aureus, Brucella abortus, Salmonella typhimurium, Shigella boydii, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii, and Escherichia coli), and PCR-grade water, which served as non-template control.
Water samples 
Twelve trial grab samples were collected using a stratified-haphazard sampling method from the Cuemanco Biological and Aquaculture Research Center (CIBAC) (19&#176; 16&#39; 54&#34; N 99&#176; 6&#39; 11&#34; W). These samples were obtained at three depths: superficial, 10, and 30 cm (Figure 1A, B). The water collection procedures did not impact any endangered or protected species. Each sample was collected in a sterile 15 mL microcentrifuge tube. To collect the sample, each tube was gently submerged in the water, filled at the selected depth, and then sealed. The samples were maintained at 22 &#176;C and promptly transported to the laboratory for processing.
Each sample was concentrated by centrifugation in sterile 1.5 mL microcentrifuge tubes at 8000 x g for 20 min at room temperature. This step was repeated until all the samples were concentrated into one tube, which was then used for DNA extraction (Figure 1C).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65435/65435fig01v2.jpg" /> 
Figure 1: Concentration of water samples by centrifugation. (A) Water sampling ponds, and (B) Natural streams. (C) Centrifugation-based water sample processing in repeated steps as many times as needed (n). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65435/65435fig01largev2.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
DNA extraction 
Total DNA was isolated using a commercial Genomic DNA kit according to the manufacturer&#39;s instructions (see Table of Materials). DNA extractions were eluted in 20 &#181;L of elution buffer, and DNA concentration was determined by a UV Spectrophotometer at 260-280 nm, and stored at 4 &#176;C until use.
PCR amplification 
The PCR targets were the 16S rRNA, lipL41, and lipL32 genes, which identify DNA from the genus Leptospira and allow the distinction among the three clades: pathogenic, saprophytic, and intermediate. Both primers and probe designs were based on the previous works by Ahmed et al., Azali et al., Bourhy et al., Weiss et al., and Branger et al.33,34,35,36,37. The sequence of each probe, primer, and amplified fragment are described in Table 1, and their alignment with reference sequences are provided in Supplementary File 1, Supplementary File 2, Supplementary File 3, Supplementary File 4, and Supplementary File 5. The PCR reagents and thermocycling conditions are described in the protocol section.
Amplification products were visualized by electrophoretic separation on a 1% agarose gel in TAE (40 mM Tris base, 20 mM Acetic acid, and 1 mM EDTA; pH 8.3), at 60 V for 45 min with ethidium-bromide detection, as shown in Supplementary Figure 1. Genomic DNA obtained from each serovar was used with concentrations ranging from 6 x 106 to 1 x 104 genomic equivalent copies (GEq) in each PCR reaction, based on the genome size of L. interrogans (4, 691, 184 bp)38 for pathogenic Leptospira, the genome size of L. biflexa (3, 956, 088 bp)39 for saprophytic Leptospira, and the genome size of L. fainei serovar Hurstbridge strain BUT6 (4, 267, 324 bp) with accession number AKWZ00000000.2.
The sensitivity of the probes was assessed with DNA from each pathogenic serovar, L. biflexa serovar Patoc strain Patoc I, and L. fainei serovar Hurstbridge strain BUT6 in each experiment. To assess the specificity of the PCR and dot-blot hybridization assay, DNA from non-related bacteria was included.
Table 1: PCR primers and probes to amplify products for identifying the pathogenic, saprophyte, and intermediate clades of Leptospira. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65435/TABLE_1_ 7th_PR_ EMCC.xlsx" target="_blank">Please click here to download this Table.</a>
Dot-blot hybridization assay 
The technique is called dot-blot because the holes in which the DNA sample is placed have a dot shape, and when they are sucked to be fixed in place by vacuum suction, they acquire this shape. This technique was developed by Kafatos et al.40. The technique allows the semi-quantification of Leptospira in each PCR-positive sample. The protocol consists of a denaturation with NaOH 0.4 M at room temperature, samples with Leptospira DNA from 30 ng to 0.05 ng, corresponding to 6 x 106 to 1 x 104 leptospires, are blotted onto a nylon membrane with a 96-well dot-blot apparatus. After immobilization, the DNA is bound to the membrane by exposure to 120 mJ UV light. Each DNA probe is conjugated with digoxigenin-11 dUTP by a terminal transferase catalysis step at the 3&#39; end (Digoxigenin is a plant steroid obtained from Digitalis purpurea, used&#160;as a reporter41). Following the stringent hybridization of the labeled DNA probe (50 pmol) at the specific temperature onto the target DNA, the DNA hybrids are visualized by the chemiluminescence reaction with the anti-digoxigenin alkaline phosphatase antibody covalently conjugated with its substrate CSPD. The luminescence is captured by exposure to an X-ray film (Figure 2).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65435/65435fig02v2.jpg" /> 
Figure 2: Steps of the procedure for the PCR-dot-blot assay. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65435/65435fig02largev2.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>

Autor em destaque: Detecção de DNA de Leptospira na água para análise ambiental e vigilância de doenças

Reação em cadeia da polimerase e hibridização de ponto-blot para detecção de Leptospira em amostras de água

This protocol is designed to identify the presence of Leptospira DNA in water samples. The dot-blot technique is utilized for this purpose, which enables accurate detection and analysis of the DNA. The dot-blot is an easy and versatile non-isotopic technique and may help to answer key questions about the environmental distribution of Leptospira.This method has the potential to assess huge water bodies and aid in disease surveillance.

Para avaliar a eficácia da técnica, foi utilizado DNA genômico de culturas puras de cada sorovar de Leptospira , juntamente com a sonda específica do clado. As membranas foram preparadas com 100 ng de DNA genômico por reação de PCR para cada sorovar, seguido por oito DNA genômico de bactérias não relacionadas e concentrações variáveis de DNA genômico dos sorovares ad hoc de Leptospira . Cada ensaio incluiu controle positivo, negativo e sem modelo. Esses DNAs genômicos não relacionados n?...

Neste estudo, uma aplicação de dot-blot foi projetada para detectar Leptospira dos três clados principais em amostras de água. Este método permite a identificação de quantidades mínimas de DNA especificamente direcionadas por uma sonda marcada com digoxigenina, facilmente detectada por um anticorpo anti-digoxigenina. Essa abordagem é uma ferramenta valiosa e satisfatória para fins de triagem.

The dot-blot is a simple, fast, sensitive, and versatile technique that enables the identification of minimal quantities of DNA specifically targeted by ...

Este protocolo foi desenvolvido para identificar a presença de DNA de Leptospira em amostras de água. A técnica de dot-blot é utilizada para esse fim, o que permite a detecção e análise precisas do DNA. O dot-blot é uma técnica não isotópica fácil e versátil e pode ajudar a responder a perguntas-chave sobre a distribuição ambiental de Leptospira.Este método tem o potencial de avaliar enormes corpos d'água e auxiliar na vigilância de doenças.

polymerase-chain-reaction-dot-blot-hybridization-for-leptospira

Research

JoVE Journal

Biology

Polymerase Chain Reaction and Dot-Blot Hybridization for Leptospira Detection in Water Samples

The dot-blot is a simple, fast, sensitive, and versatile technique that enables the identification of minimal quantities of DNA specifically targeted by probe hybridization in the presence of carrier DNA. It is based on the transfer of a known amount of DNA onto an inert solid support, such as a nylon membrane, utilizing the dot-blot apparatus and without electrophoretic separation. Nylon membranes have the advantage of high nucleic acid binding capacity (400 &#181;g/cm2), high strength, and are positively or neutrally charged. The probe used is a highly specific ssDNA fragment of 18 to 20 bases long labeled with digoxigenin (DIG). The probe will conjugate with the Leptospira DNA. Once the probe has hybridized with the target DNA, it is detected by an anti-digoxigenin antibody, allowing its easy detection through its emissions revealed in an X-ray film. The dots with an emission will correspond to the DNA fragments of interest. This method employs the non-isotopic labeling of the probe, which may have a very long half-life. The drawback of this standard immuno-label is a lower sensitivity than isotopic probes. Nevertheless, it is mitigated by coupling polymerase chain reaction (PCR) and dot-blot assays. This approach enables the enrichment of the target sequence and its detection. Additionally, it may be used as a quantitative application when compared against a serial dilution of a well-known standard. A dot-blot application to detect Leptospira from the three main clades in water samples is presented here. This methodology can be applied to large amounts of water once they have been concentrated by centrifugation to provide evidence of the presence of Leptospiral DNA. This is a valuable and satisfactory tool for general screening purposes, and may be used for other non-culturable bacteria that may be present in water, enhancing the comprehension of the ecosystem.

In this study, a dot-blot application was designed to detect Leptospira from the three main clades in water samples. This method allows for the identification of minimal DNA quantities specifically targeted by a digoxigenin-labeled probe, easily detected by an anti-digoxigenin antibody. This approach is a valuable and satisfactory tool for screening purposes.