Name: Autor destacado: Detección de ADN de Leptospira en el agua para análisis ambiental y vigilancia de enfermedades
Uploaded: 2024-06-14T12:30:00
Description: The dot-blot is a simple, fast, sensitive, and versatile technique that enables the identification of minimal quantities of DNA specifically targeted by ...

Estamos en deuda con la colección Leptospira del Departamento de Microbiología e Inmunología de la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia de la Universidad Nacional Autónoma de México. Agradecemos la generosa donación de las cepas de referencia de Leptuspira ; Leptospira fainei serovar Hurstbridge cepa BUT6 y Leptospira biflexa serovar Patoc cepa Patoc I al Dr. Alejandro de la Peña Moctezuma. Agradecemos al Dr. José Antonio Ocampo Cervantes, Coordinador del CIBAC, y al personal por su apoyo logístico. EDT se enmarcó en el programa Proyecto Terminal para estudiantes de pregrado de la Universidad Autónoma Metropolitana-Campus Cuajimalpa. Reconocemos el software Biorender.com para la creación de las figuras 1 y 3 a 9.

1. Preparación de la muestra
<ol><li>Concentrar cada muestra de agua en tubos de microcentrífuga de 1,5 mL por centrifugación a 8.000 x g durante 10 min a 4 °C. Repita este paso, tantas veces como sea necesario, para concentrar la muestra en un volumen de 250 μL.</li>
	<li>Utilice el kit de extracción de ADN de acuerdo con las instrucciones del fabricante (consulte la tabla de materiales).</li>
	<li>Realizar la PCR específica según la sonda dot-blot que se vaya a util...

Ensayo de transferencia de puntos para la detección de ADN de Leptospira en muestras de agua

Los pasos críticos de la técnica de dot-blot incluyen (1) la inmovilización del ADN, (2) el bloqueo de los sitios de unión libres en la membrana con ADN no homólogo, (3) la complementariedad entre la sonda y el fragmento objetivo en condiciones de recocido, (4) la eliminación de la sonda no hibridada y (5) la detección de la molécula reportera41.
El PCR-Dot-blot tiene ciertas limitaciones, como que la técnica no proporciona información sobre el tamaño del fra...

La leptospirosis en humanos se origina principalmente en fuentes ambientales 1,2. La presencia de Leptospira en lagos, ríos y arroyos es un indicador de transmisión de leptospirosis entre la fauna silvestre y los animales domésticos y de producción que eventualmente pueden entrar en contacto con estos cuerpos de agua 1,3,4. Además, se ha identificado Leptospira en fuentes no naturales, como aguas residuales, estancadas y del grifo 5,6.
Leptospira es una bacteria distribuida en todo el mundo 7,8, y el papel del medio ambiente en su preservación y transmisión ha sido bien reconocido. Leptospira puede sobrevivir en agua potable bajo pH variable y minerales9, y en cuerpos de agua naturales1. También puede sobrevivir por largos períodos en agua destilada10, y bajo pH constante (7.8), puede sobrevivir hasta 152 días11. Además, Leptospira puede interactuar en consorcios bacterianos para sobrevivir a condiciones adversas12,13. Puede formar parte de biofilms en agua dulce con Azospirillum y Sphingomonas e incluso es capaz de crecer y soportar temperaturas superiores a los 49 °C14,15. También puede multiplicarse en suelos anegados y permanecer viable hasta 379 días16, conservando su capacidad de causar la enfermedad hasta por un año17,18. Sin embargo, se sabe poco sobre la ecología dentro de los cuerpos de agua y cómo se distribuye dentro de ellos.
Desde su descubrimiento, el estudio del género Leptospira se basó en pruebas serológicas. No fue hasta el siglo actual cuando las técnicas moleculares se generalizaron en el estudio de esta espiroqueta. El dot-blot ha sido escasamente utilizado para su identificación utilizando (1) una sonda isotópica basada en el ARNr 16S y en una repetición de secuencia inter-simple (ISSR)19,20, (2) como un inmunoensayo basado en nanooro para la leptospirosis humana aplicada a la orina21, o (3) como un ensayo basado en anticuerpos para muestras de orina bovina22. La técnica cayó en desuso porque originalmente se basaba en sondas isotópicas. Sin embargo, es una técnica bien conocida que, junto con la PCR, produce mejores resultados, y se considera segura debido al uso de sondas no isotópicas. La PCR desempeña un papel crucial en el enriquecimiento del ADN de Leptospira al amplificar un fragmento de ADN específico que se puede encontrar en trazas en una muestra. Durante cada ciclo de PCR, la cantidad del fragmento de ADN objetivo se duplica en la reacción. Al final de la reacción, el amplicón se ha multiplicado por un factor de más de un millón23. El producto amplificado por PCR, a menudo no visible en la electroforesis de agarosa, se hace visible a través de la hibridación específica con una sonda marcada con DIG en el dot-blot 24,25,26.
La técnica de dot-blot es sencilla, robusta y adecuada para numerosas muestras, lo que la hace accesible a laboratorios con recursos limitados. Se ha empleado en una variedad de estudios de bacterias, incluyendo (1) bacterias orales27, (2) otros tipos de muestras como alimentos y heces28, y (3) la identificación de bacterias no cultivables29, a menudo de acuerdo con otras técnicas moleculares. Entre las ventajas que ofrece la técnica de dot-blot se encuentran: (1) La membrana tiene una alta capacidad de unión, capaz de unir más de 200 μg/cm2 de ácidos nucleicos y hasta 400 μg/cm2; (2) Los resultados de la mancha se pueden interpretar visualmente sin necesidad de equipo especial, y (3) se pueden almacenar convenientemente durante años a temperatura ambiente (RT).
El género Leptospira ha sido clasificado en clados patógenos, intermedios y saprófitos30,31. La distinción entre estos clados se puede lograr en función de genes específicos como lipL41, lipL32 y el ARNr 16S. LipL32 está presente en los clados patógenos y exhibe una alta sensibilidad en diversas herramientas serológicas y moleculares, mientras que está ausente en las especies de saprófitos21. El gen de mantenimiento lipL41 es conocido por su expresión estable y se utiliza en técnicas moleculares32, mientras que el gen 16S rRNA se utiliza para su clasificación.
Esta metodología se puede aplicar a grandes volúmenes de agua una vez que se han concentrado por centrifugación. Permite la evaluación de diversos puntos y profundidades dentro de un cuerpo de agua para detectar la presencia de ADN leptoespiral y el clado al que pertenece. Esta herramienta es valiosa tanto para fines ecológicos como para fines generales de detección y también se puede emplear para detectar otras bacterias no cultivables que pueden estar presentes en el agua.
Además, los ensayos de PCR y dot-blot son técnica y económicamente asequibles para una amplia gama de laboratorios, incluso para aquellos que carecen de equipos sofisticados o costosos. Este estudio tiene como objetivo aplicar el dot-blot basado en digoxigenina para la identificación de los tres clados de Leptospira en muestras de agua recolectadas de cuerpos de agua naturales.
Cepas bacterianas Se incluyeron en este estudio doce serovares de Leptospira (Autumnalis, Bataviae, Bratislava, Canicola, Celledoni, Grippothyphosa, Hardjoprajitno, Icterohaemorrhagiae, Pomona, Pyrogenes, Tarassovi y Wolffi). Estos serovares forman parte de la colección del Departamento de Microbiología e Inmunología de la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia de la Universidad Nacional Autónoma de México, y actualmente se utilizan en el ensayo de microaglutinación (MAT).
Todos los serovares de Leptospira se cultivaron en EMJH y su ADN se extrajo utilizando un kit comercial de extracción de ADN (ver Tabla de Materiales). Se utilizó una mezcla de ADN genómico de los doce serovares como control positivo para el clado patógeno de Leptostpira . Como control positivo del clado intermedio de Leptospira , se incluyó ADN genómico de Leptospira fainei serovar cepa BUT6 de Hurstbridge, y como control positivo para el clado de saprófitos de Leptospira , también se incluyó ADN genómico de Leptospira biflexa serovar cepa Patoc Patoc I.
Los controles negativos consistieron en un plásmido vacío, ADN de bacterias no relacionadas (Ureaplasma urealyticum, Staphylococcus aureus, Brucella abortus, Salmonella typhimurium, Shigella boydii, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii y Escherichia coli) y agua de grado PCR, que sirvió como control no molde.
Muestras de agua Se recolectaron doce muestras de prueba utilizando un método de muestreo estratificado-aleatorio del Centro de Investigación Biológica y Acuícola de Cuemanco (CIBAC) (19° 16' 54" N 99° 6' 11" W). Estas muestras se obtuvieron a tres profundidades: superficial, 10 y 30 cm (Figura 1A, B). Los procedimientos de recolección de agua no afectaron a ninguna especie en peligro de extinción o protegida. Cada muestra se recogió en un tubo de microcentrífuga estéril de 15 mL. Para recolectar la muestra, cada tubo se sumergió suavemente en el agua, se llenó a la profundidad seleccionada y luego se selló. Las muestras se mantuvieron a 22 °C y se transportaron rápidamente al laboratorio para su procesamiento.
Cada muestra se concentró por centrifugación en tubos de microcentrífuga estériles de 1,5 mL a 8000 x g durante 20 min a temperatura ambiente. Este paso se repitió hasta que todas las muestras se concentraron en un tubo, que luego se utilizó para la extracción de ADN (Figura 1C).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65435/65435fig01v2.jpg"> Figura 1: Concentración de muestras de agua por centrifugación. (A) Estanques de muestreo de agua, y (B) Arroyos naturales. (C) Procesamiento de muestras de agua basado en centrifugación en pasos repetidos tantas veces como sea necesario (n). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65435/65435fig01largev2.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Extracción de ADN El ADN total se aisló utilizando un kit comercial de ADN genómico de acuerdo con las instrucciones del fabricante (ver Tabla de Materiales). Las extracciones de ADN se eluyeron en 20 μL de tampón de elución, y la concentración de ADN se determinó mediante un espectrofotómetro UV a 260-280 nm, y se almacenó a 4 °C hasta su uso.
Amplificación por PCR Los objetivos de PCR fueron los genes 16S rRNA, lipL41 y lipL32, que identifican el ADN del género Leptospira y permiten distinguir entre los tres clados: patógeno, saprófito e intermedio. Tanto los cebadores como los diseños de las sondas se basaron en los trabajos previos de Ahmed et al., Azali et al., Bourhy et al., Weiss et al. y Branger et al.33,34,35,36,37. La secuencia de cada sonda, cebador y fragmento amplificado se describe en la Tabla 1, y su alineación con las secuencias de referencia se proporciona en el Archivo Suplementario 1, el Archivo Suplementario 2, el Archivo Suplementario 3, el Archivo Suplementario 4 y el Archivo Suplementario 5. Los reactivos de PCR y las condiciones de termociclado se describen en la sección de protocolo.
Los productos de amplificación se visualizaron por separación electroforética en un gel de agarosa al 1% en TAE (40 mM de base Tris, 20 mM de ácido acético y 1 mM de EDTA; pH 8,3), a 60 V durante 45 min con detección de bromuro de etidio, como se muestra en la Figura suplementaria 1. El ADN genómico obtenido de cada serovar se utilizó con concentraciones que oscilaron entre 6 x 106 y 1 x 104 copias genómicas equivalentes (GEq) en cada reacción de PCR, basándose en el tamaño del genoma de L. interrogans (4, 691, 184 pb)38 para Leptospira patógena, el tamaño del genoma de L. biflexa (3, 956, 088 pb)39 para Leptospira saprófita, y el tamaño del genoma de L. fainei serovar Hurstbridge cepa BUT6 (4, 267, 324 pb) con número de acceso AKWZ00000000.2.
La sensibilidad de las sondas se evaluó con ADN de cada serovar patógeno, L. biflexa serovar, cepa Patoc I, y L. fainei serovar, cepa BUT6 de Hurstbridge. Para evaluar la especificidad del ensayo de PCR e hibridación dot-blot, se incluyó ADN de bacterias no relacionadas.
Tabla 1: Cebadores y sondas de PCR para amplificar productos para la identificación de los clados patógenos, saprófitos e intermedios de Leptospira. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65435/TABLE_1_%207th_PR_%20EMCC.xlsx" target="_blank">Haga clic aquí para descargar esta tabla.</a>
Ensayo de hibridación dot-blot La técnica se denomina dot-blot porque los orificios en los que se coloca la muestra de ADN tienen forma de punto, y cuando se succionan para ser fijados en su lugar por succión al vacío, adquieren esta forma. Esta técnica fue desarrollada por Kafatos et al.40. La técnica permite la semicuantificación de Leptospira en cada muestra PCR positiva. El protocolo consiste en una desnaturalización con NaOH 0,4 M a temperatura ambiente, muestras con ADN de Leptospira de 30 ng a 0,05 ng, correspondientes a 6 x 106 a 1 x 104 leptospiras, se secan en una membrana de nailon con un aparato de puntos de 96 pocillos. Después de la inmovilización, el ADN se une a la membrana mediante la exposición a 120 mJ de luz ultravioleta. Cada sonda de ADN se conjuga con digoxigenina-11 dUTP mediante una etapa de catálisis de transferasa terminal en el extremo 3' (la digoxigenina es un esteroide vegetal obtenido de Digitalis purpurea, utilizado como reportero41). Tras la hibridación rigurosa de la sonda de ADN marcada (50 pmol) a la temperatura específica en el ADN objetivo, los híbridos de ADN se visualizan mediante la reacción de quimioluminiscencia con el anticuerpo anti-digoxigenina fosfatasa alcalina conjugado covalentemente con su sustrato CSPD. La luminiscencia se captura mediante la exposición a una película de rayos X (Figura 2).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65435/65435fig02v2.jpg"> Figura 2: Pasos del procedimiento para el ensayo PCR-dot-blot. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65435/65435fig02largev2.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>REAGENTS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purelink DNA extraction kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>K182002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gotaq Flexi DNA Polimerase (End-Point PCR Taq polymerase kit)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M3001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman filter paper, grade 1,</td>
			<td>Merk</td>
			<td>WHA1001325</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon Membranes, positively charged Roll 30cm x 3 m</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11417240001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments Sheep Polyclonal Primary-antibody</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11093274910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium Base EMJH</td>
			<td>Difco</td>
			<td>S1368JAA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leptospira Enrichment EMJH</td>
			<td>Difco</td>
			<td>BD 279510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocking Reagent</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11096176001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CSPD ready to use Disodium 3-(4-methoxyspiro {1,2-dioxetane-3,2&#8242;-(5&#8242;-chloro) tricyclo [3.3.1.13,7] decan}8-4-yl) phenyl phosphate</td>
			<td>Merk</td>
			<td>11755633001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxyribonucleic acid from herring sperm</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D3159</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Developer Carestream</td>
			<td>Carestream Health Inc</td>
			<td>GBX5158621</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digoxigenin-11-ddUTP</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11363905910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA, Disodium Salt (Dihydrate)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>H5032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll 400</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F8016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixer Carestream</td>
			<td>Carestream Health Inc</td>
			<td>GBX 5158605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lauryl sulfate Sodium Salt (Sodium dodecyl sulfate; SDS) C12H2504SNa</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L5750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N- Lauroylsarcosine sodium salt CH3(CH2)10CON(CH3) CH2COONa</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L-9150</td>
			<td>It is an anionic surfactant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polivinylpyrrolidone (PVP-40)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>PVP40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene glycol Sorbitan monolaurate (Tween 20)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>9005-64-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>151-21-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>1310-73-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic (NaH2PO4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>7558-79-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Terminal transferase, recombinant</td>
			<td>Roche</td>
			<td>3289869103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris hydrochloride (Tris HCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1185-53-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SSPE 20X</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2015-1L</td>
			<td>It can be Home-made following Supplementary File 6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primers</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>On demand</td>
			<td>Follow table 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Probes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>On demand</td>
			<td>Follow table 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop&#8482; One Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo-Scientific</td>
			<td>ND-ONE-W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated microcentrifuge Sigma 1-14K, suitable for centrifugation of 1.5 ml microcentrifuge tubes at 14,000 rpm</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1-14K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disinfected adjustable pipettes, range 2-20 &#181;l, 20-200 &#181;l</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>SKU:F167360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable 1.5 ml microcentrifuge tubes (autoclaved)</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-150-SP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable 600 &#181;l microcentrifuge tubes (autoclaved)</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>3208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Pipette tips 1-10 &#181;l</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>T-300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Pipette tips 1-200 &#181;l</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>TR-222-Y</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dot-Blot apparatus Bio-Dot</td>
			<td>BIORAD</td>
			<td>1706545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Portable Hergom Suction</td>
			<td>Hergom</td>
			<td>7E-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scientific Light Box (Visible-light PH90-115V)</td>
			<td>Hoefer</td>
			<td>PH90-115V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV Crosslinker</td>
			<td>Hoefer</td>
			<td>UVC-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Hybaid PCR Express Thermocycler</td>
			<td>Hybaid</td>
			<td>HBPX110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Radiographic cassette with IP Plate14 X 17</td>
			<td>Fuji</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

polymerase chain reaction and dot-blot hybridization for leptospira detection in water samples

El dot-blot es una técnica sencilla, rápida, sensible y versátil que permite la identificación de cantidades mínimas de ADN específicamente objetivo de la hibridación de sonda en presencia de ADN portador. Se basa en la transferencia de una cantidad conocida de ADN a un soporte sólido inerte, como una membrana de nailon, utilizando el aparato de mancha y sin separación electroforética. Las membranas de nailon tienen la ventaja de una alta capacidad de unión a ácidos nucleicos (400 μg / cm2), alta resistencia y están cargadas positiva o neutramente. La sonda utilizada es un fragmento de ssDNA altamente específico de 18 a 20 bases de largo marcadas con digoxigenina (DIG). La sonda se conjugará con el ADN de Leptospira . Una vez que la sonda se ha hibridado con el ADN objetivo, es detectada por un anticuerpo anti-digoxigenina, lo que permite su fácil detección a través de sus emisiones reveladas en una película de rayos X. Los puntos con una emisión corresponderán a los fragmentos de ADN de interés. Este método emplea el marcaje no isotópico de la sonda, que puede tener una vida media muy larga. El inconveniente de este marcador inmunológico estándar es una menor sensibilidad que las sondas isotópicas. Sin embargo, se mitiga mediante el acoplamiento de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y los ensayos de dot-blot. Este enfoque permite el enriquecimiento de la secuencia objetivo y su detección. Además, se puede utilizar como una aplicación cuantitativa cuando se compara con una dilución en serie de un patrón conocido. Aquí se presenta una aplicación de mancha de puntos para detectar Leptospira de los tres clados principales en muestras de agua. Esta metodología se puede aplicar a grandes cantidades de agua una vez que se han concentrado por centrifugación para proporcionar evidencia de la presencia de ADN de Leptospiral. Se trata de una herramienta valiosa y satisfactoria para fines generales de cribado, y puede utilizarse para otras bacterias no cultivables que puedan estar presentes en el agua, mejorando la comprensión del ecosistema.

Leptospirosis in humans mainly originates from environmental sources1,2. The presence of Leptospira in lakes, rivers, and streams is an indicator of leptospirosis transmission among wildlife, and domestic and production animals that may eventually come into contact with these bodies of water1,3,4. Furthermore, Leptospira has been identified in non-natural sources, including sewage, stagnant and tap water5,6.
Leptospira is a worldwide distributed bacteria7,8, and the role of the environment in its preservation and transmission has been well recognized. Leptospira can survive in drinking water under variable pH and minerals9, and in natural bodies of water1. It can also survive for long periods in distilled water10, and under constant pH (7.8), it may survive up to 152 days11. Moreover, Leptospira may interact in bacterial consortiums to survive harsh conditions12,13.&#160;It may be part of biofilms in freshwater with Azospirillum and Sphingomonas and is even capable of growing and enduring temperatures exceeding 49 &#176;C14,15. It can also multiply in waterlogged soil and remain viable for up to 379 days16, preserving its ability to cause the disease for as long as a year17,18. However, little is known about the ecology within water bodies and how it is distributed within them.
Since its discovery, the study of the genus Leptospira was based on serological tests. It was not until the current century that molecular techniques became more prevalent in the study of this spirochaete. The dot-blot has been scarcely used for its identification using (1) an isotopic probe based on the 16S rRNA and on an inter-simple sequence repeat (ISSR)19,20, (2) as a nanogold based immunoassay for human leptospirosis applied to urine21, or (3) as an antibody-based assay for bovine urine samples22. The technique fell in disuse because it was originally based on isotopic probes. However, it is a well-known technique that, coupled with PCR, yields enhanced results, and it is considered safe due to the use of non-isotopic probes. PCR plays a crucial role in the enrichment of the Leptospira DNA by amplifying a specific DNA fragment that may be found in trace amounts in a sample. During each PCR cycle, the amount of the targeted DNA fragment is doubled in the reaction. At the end of the reaction, the amplicon has been multiplied by a factor of more than a million23. The product amplified by PCR, often not visible in agarose electrophoresis, becomes visible through specific hybridization with a DIG-labeled probe in the dot-blot24,25,26.
The dot-blot technique is simple, robust, and suitable for numerous samples, making it accessible to laboratories with limited resources. It has been employed in a variety of bacteria studies, including (1) oral bacteria27, (2) other sample types such as food and feces28, and (3) the identification of unculturable bacteria29, often in agreement with other molecular techniques. Among the advantages offered by the dot-blot technique are: (1) The membrane has a high binding capacity, capable of binding over 200 &#956;g/cm2 of nucleic acids and up to 400 &#956;g/cm2; (2) Dot-blot results can be visually interpreted without requiring special equipment, and (3) they can be conveniently stored for years at room temperature (RT).
The genus Leptospira has been classified into pathogenic, intermediate, and saprophytic clades30,31. The distinction among these clades can be achieved based on specific genes such as lipL41, lipL32, and the 16S&#160;rRNA. LipL32 is present in the pathogenic clades and exhibits high sensitivity in various serological and molecular tools, whereas it is absent in saprophyte species21. The housekeeping gene lipL41 is&#160;known for its stable expression and used in molecular techniques32, while the 16S&#160;rRNA gene is utilized for their classification.
This methodology can be applied to large volumes of water once they have been concentrated by centrifugation. It allows the assessment of various points and depths within a water body to detect the presence of leptospiral DNA and the clade to which it belongs. This tool is valuable for both ecological and general screening purposes and can also be employed to detect other non-culturable bacteria that may be present in water.
Additionally, PCR and dot-blot assays are technically and economically affordable to a wide range of laboratories, even those lacking sophisticated or expensive equipment. This study aims to apply the digoxigenin-based dot-blot for the identification of the three Leptospira clades in water samples collected from natural bodies of water.
Bacterial strains 
Twelve Leptospira serovars (Autumnalis, Bataviae, Bratislava, Canicola, Celledoni, Grippothyphosa, Hardjoprajitno, Icterohaemorrhagiae, Pomona, Pyrogenes, Tarassovi, and Wolffi) were included in this study. These serovars are part of the collection at the Department of Microbiology and Immunology, Faculty of Veterinary Medicine and Zootechnics, National Autonomous University of Mexico,&#160;and they are currently used in the microagglutination test (MAT).
All Leptospira serovars were cultured in EMJH, and their DNA was extracted using a commercial DNA extraction kit (see Table of Materials). A genomic DNA mix of the twelve serovars was used as a positive control for the Leptospira pathogenic clade. As a positive control of the Leptospira intermediate clade, genomic DNA from Leptospira fainei serovar Hurstbridge strain BUT6 was included, and as a positive control for the Leptospira saprophyte clade, genomic DNA of Leptospira biflexa serovar Patoc strain Patoc I, was also included.
Negative controls consisted of an empty plasmid, DNA from non-related bacteria (Ureaplasma urealyticum, Staphylococcus aureus, Brucella abortus, Salmonella typhimurium, Shigella boydii, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii, and Escherichia coli), and PCR-grade water, which served as non-template control.
Water samples 
Twelve trial grab samples were collected using a stratified-haphazard sampling method from the Cuemanco Biological and Aquaculture Research Center (CIBAC) (19&#176; 16&#39; 54&#34; N 99&#176; 6&#39; 11&#34; W). These samples were obtained at three depths: superficial, 10, and 30 cm (Figure 1A, B). The water collection procedures did not impact any endangered or protected species. Each sample was collected in a sterile 15 mL microcentrifuge tube. To collect the sample, each tube was gently submerged in the water, filled at the selected depth, and then sealed. The samples were maintained at 22 &#176;C and promptly transported to the laboratory for processing.
Each sample was concentrated by centrifugation in sterile 1.5 mL microcentrifuge tubes at 8000 x g for 20 min at room temperature. This step was repeated until all the samples were concentrated into one tube, which was then used for DNA extraction (Figure 1C).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65435/65435fig01v2.jpg" /> 
Figure 1: Concentration of water samples by centrifugation. (A) Water sampling ponds, and (B) Natural streams. (C) Centrifugation-based water sample processing in repeated steps as many times as needed (n). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65435/65435fig01largev2.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
DNA extraction 
Total DNA was isolated using a commercial Genomic DNA kit according to the manufacturer&#39;s instructions (see Table of Materials). DNA extractions were eluted in 20 &#181;L of elution buffer, and DNA concentration was determined by a UV Spectrophotometer at 260-280 nm, and stored at 4 &#176;C until use.
PCR amplification 
The PCR targets were the 16S rRNA, lipL41, and lipL32 genes, which identify DNA from the genus Leptospira and allow the distinction among the three clades: pathogenic, saprophytic, and intermediate. Both primers and probe designs were based on the previous works by Ahmed et al., Azali et al., Bourhy et al., Weiss et al., and Branger et al.33,34,35,36,37. The sequence of each probe, primer, and amplified fragment are described in Table 1, and their alignment with reference sequences are provided in Supplementary File 1, Supplementary File 2, Supplementary File 3, Supplementary File 4, and Supplementary File 5. The PCR reagents and thermocycling conditions are described in the protocol section.
Amplification products were visualized by electrophoretic separation on a 1% agarose gel in TAE (40 mM Tris base, 20 mM Acetic acid, and 1 mM EDTA; pH 8.3), at 60 V for 45 min with ethidium-bromide detection, as shown in Supplementary Figure 1. Genomic DNA obtained from each serovar was used with concentrations ranging from 6 x 106 to 1 x 104 genomic equivalent copies (GEq) in each PCR reaction, based on the genome size of L. interrogans (4, 691, 184 bp)38 for pathogenic Leptospira, the genome size of L. biflexa (3, 956, 088 bp)39 for saprophytic Leptospira, and the genome size of L. fainei serovar Hurstbridge strain BUT6 (4, 267, 324 bp) with accession number AKWZ00000000.2.
The sensitivity of the probes was assessed with DNA from each pathogenic serovar, L. biflexa serovar Patoc strain Patoc I, and L. fainei serovar Hurstbridge strain BUT6 in each experiment. To assess the specificity of the PCR and dot-blot hybridization assay, DNA from non-related bacteria was included.
Table 1: PCR primers and probes to amplify products for identifying the pathogenic, saprophyte, and intermediate clades of Leptospira. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65435/TABLE_1_ 7th_PR_ EMCC.xlsx" target="_blank">Please click here to download this Table.</a>
Dot-blot hybridization assay 
The technique is called dot-blot because the holes in which the DNA sample is placed have a dot shape, and when they are sucked to be fixed in place by vacuum suction, they acquire this shape. This technique was developed by Kafatos et al.40. The technique allows the semi-quantification of Leptospira in each PCR-positive sample. The protocol consists of a denaturation with NaOH 0.4 M at room temperature, samples with Leptospira DNA from 30 ng to 0.05 ng, corresponding to 6 x 106 to 1 x 104 leptospires, are blotted onto a nylon membrane with a 96-well dot-blot apparatus. After immobilization, the DNA is bound to the membrane by exposure to 120 mJ UV light. Each DNA probe is conjugated with digoxigenin-11 dUTP by a terminal transferase catalysis step at the 3&#39; end (Digoxigenin is a plant steroid obtained from Digitalis purpurea, used&#160;as a reporter41). Following the stringent hybridization of the labeled DNA probe (50 pmol) at the specific temperature onto the target DNA, the DNA hybrids are visualized by the chemiluminescence reaction with the anti-digoxigenin alkaline phosphatase antibody covalently conjugated with its substrate CSPD. The luminescence is captured by exposure to an X-ray film (Figure 2).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65435/65435fig02v2.jpg" /> 
Figure 2: Steps of the procedure for the PCR-dot-blot assay. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65435/65435fig02largev2.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>

Autor destacado: Detección de ADN de Leptospira en el agua para análisis ambiental y vigilancia de enfermedades

Reacción en cadena de la polimerasa e hibridación dot-blot para la detección de leptospira en muestras de agua

This protocol is designed to identify the presence of Leptospira DNA in water samples. The dot-blot technique is utilized for this purpose, which enables accurate detection and analysis of the DNA. The dot-blot is an easy and versatile non-isotopic technique and may help to answer key questions about the environmental distribution of Leptospira.This method has the potential to assess huge water bodies and aid in disease surveillance.

Para evaluar la efectividad de la técnica, se utilizó ADN genómico de cultivos puros de cada Leptospira serovar, junto con la sonda específica del clado. Las membranas se prepararon con 100 ng de ADN genómico por reacción de PCR para cada serovar, seguido de ocho ADN genómico de bacterias no relacionadas y concentraciones variables de ADN genómico de los serovares ad hoc de Leptospira. Cada ensayo incluyó control positivo, negativo y no especial. Este ADN genómico no relacionado no mostró afi...

En este estudio, se diseñó una aplicación de mancha de puntos para detectar Leptospira de los tres clados principales en muestras de agua. Este método permite la identificación de cantidades mínimas de ADN específicamente dirigidas por una sonda marcada con digoxigenina, fácilmente detectables por un anticuerpo anti-digoxigenina. Este enfoque es una herramienta valiosa y satisfactoria para fines de detección.

The dot-blot is a simple, fast, sensitive, and versatile technique that enables the identification of minimal quantities of DNA specifically targeted by ...

Este protocolo está diseñado para identificar la presencia de ADN de Leptospira en muestras de agua. Para este propósito se utiliza la técnica de mancha de puntos, que permite una detección y análisis precisos del ADN. El dot-blot es una técnica no isotópica fácil y versátil y puede ayudar a responder preguntas clave sobre la distribución ambiental de Leptospira.Este método tiene el potencial de evaluar grandes masas de agua y ayudar en la vigilancia de enfermedades.

polymerase-chain-reaction-dot-blot-hybridization-for-leptospira

Research

JoVE Journal

Biology

Polymerase Chain Reaction and Dot-Blot Hybridization for Leptospira Detection in Water Samples

The dot-blot is a simple, fast, sensitive, and versatile technique that enables the identification of minimal quantities of DNA specifically targeted by probe hybridization in the presence of carrier DNA. It is based on the transfer of a known amount of DNA onto an inert solid support, such as a nylon membrane, utilizing the dot-blot apparatus and without electrophoretic separation. Nylon membranes have the advantage of high nucleic acid binding capacity (400 &#181;g/cm2), high strength, and are positively or neutrally charged. The probe used is a highly specific ssDNA fragment of 18 to 20 bases long labeled with digoxigenin (DIG). The probe will conjugate with the Leptospira DNA. Once the probe has hybridized with the target DNA, it is detected by an anti-digoxigenin antibody, allowing its easy detection through its emissions revealed in an X-ray film. The dots with an emission will correspond to the DNA fragments of interest. This method employs the non-isotopic labeling of the probe, which may have a very long half-life. The drawback of this standard immuno-label is a lower sensitivity than isotopic probes. Nevertheless, it is mitigated by coupling polymerase chain reaction (PCR) and dot-blot assays. This approach enables the enrichment of the target sequence and its detection. Additionally, it may be used as a quantitative application when compared against a serial dilution of a well-known standard. A dot-blot application to detect Leptospira from the three main clades in water samples is presented here. This methodology can be applied to large amounts of water once they have been concentrated by centrifugation to provide evidence of the presence of Leptospiral DNA. This is a valuable and satisfactory tool for general screening purposes, and may be used for other non-culturable bacteria that may be present in water, enhancing the comprehension of the ecosystem.

In this study, a dot-blot application was designed to detect Leptospira from the three main clades in water samples. This method allows for the identification of minimal DNA quantities specifically targeted by a digoxigenin-labeled probe, easily detected by an anti-digoxigenin antibody. This approach is a valuable and satisfactory tool for screening purposes.