Name: Författare i fokus: Leptospira DNA-detektion i vatten för miljöanalys och sjukdomsövervakning
Uploaded: 2024-06-14T12:30:00
Description: The dot-blot is a simple, fast, sensitive, and versatile technique that enables the identification of minimal quantities of DNA specifically targeted by ...

Vi står i tacksamhetsskuld till Leptospira-samlingen vid Institutionen för mikrobiologi och immunologi, fakulteten för veterinärmedicin och zooteknik, National Autonomous University of Mexico. Vi är tacksamma för den generösa donationen av referensstammarna Leptospira ; Leptospira fainei serovar Hurstbridge stam BUT6 och Leptospira biflexa serovar Patoc stam Patoc I till Dr. Alejandro de la Peña Moctezuma. Vi tackar Dr. José Antonio Ocampo Cervantes, CIBAC-samordnaren, och personalen för deras logistiska stöd. EDT var under Terminal Project-programmet för studenter på grundnivå vid Metropolitan Autonomous University-Campus Cuajimalpa. Vi är medvetna om att det finns Biorender.com programvara för att skapa figurerna 1 och 3 till 9.

1. Beredning av prover
<ol><li>Koncentra varje vattenprov i 1,5 ml mikrocentrifugrör genom centrifugering vid 8 000 x g i 10 minuter vid 4 °C. Upprepa detta steg, så många gånger som krävs, för att koncentrera provet till en volym på 250 μL.</li>
	<li>Använd DNA-extraktionssatsen enligt tillverkarens instruktioner (se materialförteckning).</li>
	<li>Utför den specifika PCR enligt den dot-blot-sond som ska användas (tabell 1).<ol><li>Utför amplif...

Dot-blot-analys för detektion av Leptospira DNA i vattenprover

De kritiska stegen i dot-blot-tekniken inkluderar (1) DNA-immobilisering, (2) blockering av de fria bindningsställena på membranet med icke-homologt DNA, (3) komplementariteten mellan sonden och målfragmentet under glödgningsförhållanden, (4) avlägsnande av den ohybridiserade sonden och (5) detektion av reportermolekylen41.
PCR-Dot-bloten har vissa begränsningar, till exempel att tekniken inte ger information om storleken på det hybridiserade fragmentet<sup cla...

Leptospiros hos människor har huvudsakligen sitt ursprung i miljökällor 1,2. Förekomsten av Leptospira i sjöar, floder och vattendrag är en indikator på överföring av leptospiros bland vilda djur och tamdjur och produktionsdjur som så småningom kan komma i kontakt med dessa vattenförekomster 1,3,4. Dessutom har Leptospira identifierats i icke-naturliga källor, inklusive avloppsvatten, stillastående vatten och kranvatten 5,6.
Leptospira är en bakterie som distribueras över hela världen 7,8, och miljöns roll i dess bevarande och överföring har varit välkänd. Leptospira kan överleva i dricksvatten under varierande pH och mineraler9, och i naturliga vattenförekomster1. Den kan också överleva under långa perioder i destillerat vatten10, och under konstant pH (7,8) kan den överleva upp till 152 dagar11. Dessutom kan Leptospira interagera i bakteriella konsortier för att överleva svåra förhållanden12,13. Det kan ingå i biofilm i sötvatten med Azospirillum och Sphingomonas och kan till och med växa och uthärda temperaturer över 49 °C14,15. Den kan också föröka sig i vattenmättad jord och förbli livskraftig i upp till 379 dagar16, vilket bevarar dess förmåga att orsaka sjukdomen så länge som ett år17,18. Man vet dock inte mycket om ekologin i vattendrag och hur den är fördelad inom dem.
Sedan upptäckten har studiet av släktet Leptospira baserats på serologiska tester. Det var inte förrän under det innevarande århundradet som molekylära tekniker blev mer utbredda i studiet av denna spiroket. Dot-bloten har knappast använts för att identifiera den med hjälp av (1) en isotopsond baserad på 16S rRNA och på en inter-simple sequence repeat (ISSR)19,20, (2) som en nanoguldbaserad immunanalys för human leptospiros applicerad på urin21, eller (3) som en antikroppsbaserad analys för urinprover från nötkreatur22. Tekniken föll ur bruk eftersom den ursprungligen var baserad på isotopsonder. Det är dock en välkänd teknik som, tillsammans med PCR, ger förbättrade resultat, och den anses vara säker på grund av användningen av icke-isotopiska sonder. PCR spelar en avgörande roll i anrikningen av Leptospira DNA genom att amplifiera ett specifikt DNA-fragment som kan hittas i spårmängder i ett prov. Under varje PCR-cykel fördubblas mängden av det riktade DNA-fragmentet i reaktionen. I slutet av reaktionen har amplikonet multiplicerats med en faktor på mer än en miljon23. Produkten amplifierad med PCR, som ofta inte syns i agaroselektrofores, blir synlig genom specifik hybridisering med en DIG-märkt sond i dot-blot 24,25,26.
Dot-blot-tekniken är enkel, robust och lämplig för många prover, vilket gör den tillgänglig för laboratorier med begränsade resurser. Det har använts i en mängd olika bakteriestudier, inklusive (1) orala bakterier27, (2) andra provtyper som mat och avföring28, och (3) identifiering av icke-odlingsbara bakterier29, ofta i överensstämmelse med andra molekylära tekniker. Bland fördelarna med dot-blot-tekniken är: (1) Membranet har en hög bindningskapacitet, som kan binda över 200 μg/cm2 nukleinsyror och upp till 400 μg/cm2; (2) Dot-blot-resultat kan tolkas visuellt utan att det krävs specialutrustning, och (3) de kan bekvämt förvaras i åratal i rumstemperatur (RT).
Släktet Leptospira har klassificerats i patogena, intermediära och saprofytiska klader30,31. Skillnaden mellan dessa klader kan uppnås baserat på specifika gener som lipL41, lipL32 och 16S rRNA. LipL32 finns i de patogena kladerna och uppvisar hög känslighet i olika serologiska och molekylära verktyg, medan det saknas hos saprofytarter21. Hushållningsgenen lipL41 är känd för sitt stabila uttryck och används i molekylära tekniker32, medan 16S rRNA-genen används för deras klassificering.
Denna metod kan tillämpas på stora volymer vatten när de har koncentrerats genom centrifugering. Det gör det möjligt att bedöma olika punkter och djup i en vattenförekomst för att upptäcka förekomsten av leptospiral-DNA och den klad som den tillhör. Detta verktyg är värdefullt för både ekologiska och allmänna screeningändamål och kan också användas för att upptäcka andra icke-odlingsbara bakterier som kan finnas i vatten.
Dessutom är PCR- och dot-blot-analyser tekniskt och ekonomiskt överkomliga för ett brett spektrum av laboratorier, även de som saknar sofistikerad eller dyr utrustning. Denna studie syftar till att tillämpa den digoxigeninbaserade dot-bloten för att identifiera de tre Leptospira-kladerna i vattenprover insamlade från naturliga vattenförekomster.
Bakteriella stammar Tolv Leptospira serovarer (Autumnalis, Bataviae, Bratislava, Canicola, Celledoni, Grippothyphosa, Hardjoprajitno, Icterohaemorrhagiae, Pomona, Pyrogenes, Tarassoven och Wolffi) inkluderades i denna studie. Dessa serovarer är en del av samlingen vid institutionen för mikrobiologi och immunologi, fakulteten för veterinärmedicin och zooteknik, National Autonomous University of Mexico, och de används för närvarande i mikroagglutinationstestet (MAT).
Alla Leptospira serovarer odlades i EMJH och deras DNA extraherades med hjälp av ett kommersiellt DNA-extraktionskit (se Materialtabell). En genomisk DNA-blandning av de tolv serovarerna användes som en positiv kontroll för den patogena kladen Leptospira . Som en positiv kontroll av Leptospira intermediär klad inkluderades genomiskt DNA från Leptospira fainei serovar Hurstbridge stam BUT6, och som en positiv kontroll för Leptospira saprofytkladen inkluderades även genomiskt DNA från Leptospira biflexa serovar Patoc stam Patoc I.
Negativa kontroller bestod av en tom plasmid, DNA från icke-besläktade bakterier (Ureaplasma urealyticum, Staphylococcus aureus, Brucella abortus, Salmonella typhimurium, Shigella boydii, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumanii och Escherichia coli) och PCR-klassat vatten, som fungerade som icke-mallkontroll.
Vattenprover Tolv provprover samlades in med hjälp av en stratifierad-slumpmässig provtagningsmetod från Cuemanco Biological and Aquaculture Research Center (CIBAC) (19° 16' 54" N 99° 6' 11" W). Dessa prover togs på tre djup: ytliga, 10 och 30 cm (Figur 1A, B). Rutinerna för att samla in vatten påverkade inte några utrotningshotade eller skyddade arter. Varje prov samlades in i ett sterilt 15 ml mikrocentrifugrör. För att samla in provet sänktes varje rör försiktigt ner i vattnet, fylldes på det valda djupet och förseglades sedan. Proverna hölls vid 22 °C och transporterades omedelbart till laboratoriet för bearbetning.
Varje prov koncentrerades genom centrifugering i sterila 1,5 ml mikrocentrifugrör vid 8000 x g i 20 minuter vid rumstemperatur. Detta steg upprepades tills alla prover koncentrerades till ett rör, som sedan användes för DNA-extraktion (Figur 1C).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65435/65435fig01v2.jpg"> Figur 1: Koncentration av vattenprover genom centrifugering. A) Vattenprovtagningsdammar och B) Naturliga vattendrag. C) Centrifugeringsbaserad bearbetning av vattenprover i upprepade steg så många gånger som behövs (n). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65435/65435fig01largev2.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>
DNA-extraktion Totalt DNA isolerades med hjälp av ett kommersiellt genomiskt DNA-kit enligt tillverkarens instruktioner (se materialtabell). DNA-extraktioner eluerades i 20 μL elueringsbuffert och DNA-koncentrationen bestämdes av en UV-spektrofotometer vid 260-280 nm och förvarades vid 4 °C tills användning.
PCR-amplifiering PCR-målen var de 16S rRNA-, lipL41- och lipL32-generna, som identifierar DNA från släktet Leptospira och gör det möjligt att skilja mellan de tre kladerna: patogen, saprofytisk och intermediär. Både primers och sonddesign baserades på tidigare arbeten av Ahmed et al., Azali et al., Bourhy et al., Weiss et al. och Branger et al.33,34,35,36,37. Sekvensen för varje sond, primer och amplifierat fragment beskrivs i tabell 1, och deras anpassning till referenssekvenser finns i Supplementary File 1, Supplementary File 2, Supplementary File 3, Supplementary File 4 och Supplementary File 5. PCR-reagenserna och termocykliska förhållanden beskrivs i protokollavsnittet.
Amplifieringsprodukter visualiserades genom elektroforetisk separation på en 1 % agarosgel i TAE (40 mM Tris-bas, 20 mM ättiksyra och 1 mM EDTA; pH 8,3), vid 60 V i 45 minuter med etidium-bromiddetektion, som visas i kompletterande figur 1. Genomiskt DNA erhållet från varje serovar användes med koncentrationer från 6 x 106 till 1 x 104 genomekvivalenta kopior (GEq) i varje PCR-reaktion, baserat på genomstorleken för L. interrogans (4, 691, 184 bp)38 för patogen Leptospira, genomstorleken för L. biflexa (3, 956, 088 bp)39 för saprofytisk Leptospira, och genomstorleken för L. fainei serovar Hurstbridge stam BUT6 (4, 267, 324 bp) med accessionsnummer AKWZ00000000.2.
Sondernas känslighet bedömdes med DNA från varje patogen serovar, L. biflexa serovar Patoc strain Patoc I och L. fainei serovar Hurstbridge strain BUT6 i varje experiment. För att bedöma specificiteten hos PCR- och dot-blot-hybridiseringsanalysen inkluderades DNA från icke-besläktade bakterier.
Tabell 1: PCR-primrar och sonder för att amplifiera produkter för identifiering av patogena, saprofyt- och intermediära klader av Leptospira. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65435/TABLE_1_%207th_PR_%20EMCC.xlsx" target="_blank">Klicka här för att ladda ner denna tabell.</a>
Analys av dot-blot-hybridisering Tekniken kallas dot-blot eftersom hålen som DNA-provet placeras i har en prickform, och när de sugs in för att fixeras på plats genom vakuumsugning får de denna form. Denna teknik utvecklades av Kafatos et al.40. Tekniken gör det möjligt att göra en semikvantifiering av Leptospira i varje PCR-positivt prov. Protokollet består av en denaturering med NaOH 0,4 M vid rumstemperatur, prover med Leptospira DNA från 30 ng till 0,05 ng, motsvarande 6 x 106 till 1 x 104 leptospirer, torkas på ett nylonmembran med en 96-brunnars dot-blot-apparat. Efter immobilisering binds DNA:t till membranet genom exponering för 120 mJ UV-ljus. Varje DNA-sond konjugeras med digoxigenin-11 dUTP genom ett terminalt överföringskatalyssteg i 3'-änden (Digoxigenin är en växtsteroid erhållen från Digitalis purpurea, som används som en reporter41). Efter den stränga hybridiseringen av den märkta DNA-sonden (50 pmol) vid den specifika temperaturen på mål-DNA, visualiseras DNA-hybriderna genom kemiluminiscensreaktionen med den anti-digoxigenin alkaliska fosfatasantikroppen kovalent konjugerad med dess substrat CSPD. Luminiscensen fångas genom exponering för en röntgenfilm (figur 2).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65435/65435fig02v2.jpg"> Figur 2: Steg i proceduren för PCR-dot-blot-analysen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65435/65435fig02largev2.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>REAGENTS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purelink DNA extraction kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>K182002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gotaq Flexi DNA Polimerase (End-Point PCR Taq polymerase kit)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M3001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman filter paper, grade 1,</td>
			<td>Merk</td>
			<td>WHA1001325</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon Membranes, positively charged Roll 30cm x 3 m</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11417240001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments Sheep Polyclonal Primary-antibody</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11093274910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium Base EMJH</td>
			<td>Difco</td>
			<td>S1368JAA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leptospira Enrichment EMJH</td>
			<td>Difco</td>
			<td>BD 279510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocking Reagent</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11096176001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CSPD ready to use Disodium 3-(4-methoxyspiro {1,2-dioxetane-3,2&#8242;-(5&#8242;-chloro) tricyclo [3.3.1.13,7] decan}8-4-yl) phenyl phosphate</td>
			<td>Merk</td>
			<td>11755633001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxyribonucleic acid from herring sperm</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D3159</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Developer Carestream</td>
			<td>Carestream Health Inc</td>
			<td>GBX5158621</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digoxigenin-11-ddUTP</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11363905910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA, Disodium Salt (Dihydrate)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>H5032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll 400</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F8016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixer Carestream</td>
			<td>Carestream Health Inc</td>
			<td>GBX 5158605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lauryl sulfate Sodium Salt (Sodium dodecyl sulfate; SDS) C12H2504SNa</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L5750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N- Lauroylsarcosine sodium salt CH3(CH2)10CON(CH3) CH2COONa</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L-9150</td>
			<td>It is an anionic surfactant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polivinylpyrrolidone (PVP-40)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>PVP40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene glycol Sorbitan monolaurate (Tween 20)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>9005-64-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>151-21-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>1310-73-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic (NaH2PO4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>7558-79-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Terminal transferase, recombinant</td>
			<td>Roche</td>
			<td>3289869103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris hydrochloride (Tris HCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1185-53-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SSPE 20X</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2015-1L</td>
			<td>It can be Home-made following Supplementary File 6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primers</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>On demand</td>
			<td>Follow table 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Probes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>On demand</td>
			<td>Follow table 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop&#8482; One Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo-Scientific</td>
			<td>ND-ONE-W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated microcentrifuge Sigma 1-14K, suitable for centrifugation of 1.5 ml microcentrifuge tubes at 14,000 rpm</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1-14K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disinfected adjustable pipettes, range 2-20 &#181;l, 20-200 &#181;l</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>SKU:F167360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable 1.5 ml microcentrifuge tubes (autoclaved)</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-150-SP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable 600 &#181;l microcentrifuge tubes (autoclaved)</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>3208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Pipette tips 1-10 &#181;l</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>T-300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Pipette tips 1-200 &#181;l</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>TR-222-Y</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dot-Blot apparatus Bio-Dot</td>
			<td>BIORAD</td>
			<td>1706545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Portable Hergom Suction</td>
			<td>Hergom</td>
			<td>7E-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scientific Light Box (Visible-light PH90-115V)</td>
			<td>Hoefer</td>
			<td>PH90-115V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV Crosslinker</td>
			<td>Hoefer</td>
			<td>UVC-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Hybaid PCR Express Thermocycler</td>
			<td>Hybaid</td>
			<td>HBPX110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Radiographic cassette with IP Plate14 X 17</td>
			<td>Fuji</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

polymerase chain reaction and dot-blot hybridization for leptospira detection in water samples

Dot-blot är en enkel, snabb, känslig och mångsidig teknik som gör det möjligt att identifiera minimala mängder DNA som specifikt är måltavla för sondhybridisering i närvaro av bärar-DNA. Den är baserad på överföring av en känd mängd DNA till ett inert fast stöd, såsom ett nylonmembran, med hjälp av dot-blot-apparaten och utan elektroforetisk separation. Nylonmembran har fördelen av hög nukleinsyrabindningskapacitet (400 μg/cm2), hög hållfasthet och är positivt eller neutralt laddade. Sonden som används är ett mycket specifikt ssDNA-fragment av 18 till 20 baser som är märkta med digoxigenin (DIG). Sonden kommer att konjugera med Leptospiras DNA. När sonden har hybridiserats med mål-DNA:t detekteras den av en anti-digoxigeninantikropp, vilket gör det lätt att upptäcka den genom dess utsläpp som avslöjas i en röntgenfilm. Prickarna med en emission kommer att motsvara de DNA-fragment som är av intresse. Denna metod använder icke-isotopisk märkning av sonden, som kan ha en mycket lång halveringstid. Nackdelen med denna standardimmunetikett är en lägre känslighet än isotopsonder. Icke desto mindre mildras det genom att koppla polymeraskedjereaktion (PCR) och dot-blot-analyser. Den här metoden gör det möjligt att berika målsekvensen och identifiera den. Dessutom kan det användas som en kvantitativ applikation jämfört med en seriell utspädning av en välkänd standard. En dot-blot-applikation för att detektera Leptospira från de tre huvudkladerna i vattenprover presenteras här. Denna metod kan tillämpas på stora mängder vatten när de har koncentrerats genom centrifugering för att ge bevis på närvaron av Leptospiral-DNA. Detta är ett värdefullt och tillfredsställande verktyg för allmänna screeningändamål och kan användas för andra icke-odlingsbara bakterier som kan finnas i vatten, vilket förbättrar förståelsen av ekosystemet.

Leptospirosis in humans mainly originates from environmental sources1,2. The presence of Leptospira in lakes, rivers, and streams is an indicator of leptospirosis transmission among wildlife, and domestic and production animals that may eventually come into contact with these bodies of water1,3,4. Furthermore, Leptospira has been identified in non-natural sources, including sewage, stagnant and tap water5,6.
Leptospira is a worldwide distributed bacteria7,8, and the role of the environment in its preservation and transmission has been well recognized. Leptospira can survive in drinking water under variable pH and minerals9, and in natural bodies of water1. It can also survive for long periods in distilled water10, and under constant pH (7.8), it may survive up to 152 days11. Moreover, Leptospira may interact in bacterial consortiums to survive harsh conditions12,13.&#160;It may be part of biofilms in freshwater with Azospirillum and Sphingomonas and is even capable of growing and enduring temperatures exceeding 49 &#176;C14,15. It can also multiply in waterlogged soil and remain viable for up to 379 days16, preserving its ability to cause the disease for as long as a year17,18. However, little is known about the ecology within water bodies and how it is distributed within them.
Since its discovery, the study of the genus Leptospira was based on serological tests. It was not until the current century that molecular techniques became more prevalent in the study of this spirochaete. The dot-blot has been scarcely used for its identification using (1) an isotopic probe based on the 16S rRNA and on an inter-simple sequence repeat (ISSR)19,20, (2) as a nanogold based immunoassay for human leptospirosis applied to urine21, or (3) as an antibody-based assay for bovine urine samples22. The technique fell in disuse because it was originally based on isotopic probes. However, it is a well-known technique that, coupled with PCR, yields enhanced results, and it is considered safe due to the use of non-isotopic probes. PCR plays a crucial role in the enrichment of the Leptospira DNA by amplifying a specific DNA fragment that may be found in trace amounts in a sample. During each PCR cycle, the amount of the targeted DNA fragment is doubled in the reaction. At the end of the reaction, the amplicon has been multiplied by a factor of more than a million23. The product amplified by PCR, often not visible in agarose electrophoresis, becomes visible through specific hybridization with a DIG-labeled probe in the dot-blot24,25,26.
The dot-blot technique is simple, robust, and suitable for numerous samples, making it accessible to laboratories with limited resources. It has been employed in a variety of bacteria studies, including (1) oral bacteria27, (2) other sample types such as food and feces28, and (3) the identification of unculturable bacteria29, often in agreement with other molecular techniques. Among the advantages offered by the dot-blot technique are: (1) The membrane has a high binding capacity, capable of binding over 200 &#956;g/cm2 of nucleic acids and up to 400 &#956;g/cm2; (2) Dot-blot results can be visually interpreted without requiring special equipment, and (3) they can be conveniently stored for years at room temperature (RT).
The genus Leptospira has been classified into pathogenic, intermediate, and saprophytic clades30,31. The distinction among these clades can be achieved based on specific genes such as lipL41, lipL32, and the 16S&#160;rRNA. LipL32 is present in the pathogenic clades and exhibits high sensitivity in various serological and molecular tools, whereas it is absent in saprophyte species21. The housekeeping gene lipL41 is&#160;known for its stable expression and used in molecular techniques32, while the 16S&#160;rRNA gene is utilized for their classification.
This methodology can be applied to large volumes of water once they have been concentrated by centrifugation. It allows the assessment of various points and depths within a water body to detect the presence of leptospiral DNA and the clade to which it belongs. This tool is valuable for both ecological and general screening purposes and can also be employed to detect other non-culturable bacteria that may be present in water.
Additionally, PCR and dot-blot assays are technically and economically affordable to a wide range of laboratories, even those lacking sophisticated or expensive equipment. This study aims to apply the digoxigenin-based dot-blot for the identification of the three Leptospira clades in water samples collected from natural bodies of water.
Bacterial strains 
Twelve Leptospira serovars (Autumnalis, Bataviae, Bratislava, Canicola, Celledoni, Grippothyphosa, Hardjoprajitno, Icterohaemorrhagiae, Pomona, Pyrogenes, Tarassovi, and Wolffi) were included in this study. These serovars are part of the collection at the Department of Microbiology and Immunology, Faculty of Veterinary Medicine and Zootechnics, National Autonomous University of Mexico,&#160;and they are currently used in the microagglutination test (MAT).
All Leptospira serovars were cultured in EMJH, and their DNA was extracted using a commercial DNA extraction kit (see Table of Materials). A genomic DNA mix of the twelve serovars was used as a positive control for the Leptospira pathogenic clade. As a positive control of the Leptospira intermediate clade, genomic DNA from Leptospira fainei serovar Hurstbridge strain BUT6 was included, and as a positive control for the Leptospira saprophyte clade, genomic DNA of Leptospira biflexa serovar Patoc strain Patoc I, was also included.
Negative controls consisted of an empty plasmid, DNA from non-related bacteria (Ureaplasma urealyticum, Staphylococcus aureus, Brucella abortus, Salmonella typhimurium, Shigella boydii, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii, and Escherichia coli), and PCR-grade water, which served as non-template control.
Water samples 
Twelve trial grab samples were collected using a stratified-haphazard sampling method from the Cuemanco Biological and Aquaculture Research Center (CIBAC) (19&#176; 16&#39; 54&#34; N 99&#176; 6&#39; 11&#34; W). These samples were obtained at three depths: superficial, 10, and 30 cm (Figure 1A, B). The water collection procedures did not impact any endangered or protected species. Each sample was collected in a sterile 15 mL microcentrifuge tube. To collect the sample, each tube was gently submerged in the water, filled at the selected depth, and then sealed. The samples were maintained at 22 &#176;C and promptly transported to the laboratory for processing.
Each sample was concentrated by centrifugation in sterile 1.5 mL microcentrifuge tubes at 8000 x g for 20 min at room temperature. This step was repeated until all the samples were concentrated into one tube, which was then used for DNA extraction (Figure 1C).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65435/65435fig01v2.jpg" /> 
Figure 1: Concentration of water samples by centrifugation. (A) Water sampling ponds, and (B) Natural streams. (C) Centrifugation-based water sample processing in repeated steps as many times as needed (n). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65435/65435fig01largev2.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
DNA extraction 
Total DNA was isolated using a commercial Genomic DNA kit according to the manufacturer&#39;s instructions (see Table of Materials). DNA extractions were eluted in 20 &#181;L of elution buffer, and DNA concentration was determined by a UV Spectrophotometer at 260-280 nm, and stored at 4 &#176;C until use.
PCR amplification 
The PCR targets were the 16S rRNA, lipL41, and lipL32 genes, which identify DNA from the genus Leptospira and allow the distinction among the three clades: pathogenic, saprophytic, and intermediate. Both primers and probe designs were based on the previous works by Ahmed et al., Azali et al., Bourhy et al., Weiss et al., and Branger et al.33,34,35,36,37. The sequence of each probe, primer, and amplified fragment are described in Table 1, and their alignment with reference sequences are provided in Supplementary File 1, Supplementary File 2, Supplementary File 3, Supplementary File 4, and Supplementary File 5. The PCR reagents and thermocycling conditions are described in the protocol section.
Amplification products were visualized by electrophoretic separation on a 1% agarose gel in TAE (40 mM Tris base, 20 mM Acetic acid, and 1 mM EDTA; pH 8.3), at 60 V for 45 min with ethidium-bromide detection, as shown in Supplementary Figure 1. Genomic DNA obtained from each serovar was used with concentrations ranging from 6 x 106 to 1 x 104 genomic equivalent copies (GEq) in each PCR reaction, based on the genome size of L. interrogans (4, 691, 184 bp)38 for pathogenic Leptospira, the genome size of L. biflexa (3, 956, 088 bp)39 for saprophytic Leptospira, and the genome size of L. fainei serovar Hurstbridge strain BUT6 (4, 267, 324 bp) with accession number AKWZ00000000.2.
The sensitivity of the probes was assessed with DNA from each pathogenic serovar, L. biflexa serovar Patoc strain Patoc I, and L. fainei serovar Hurstbridge strain BUT6 in each experiment. To assess the specificity of the PCR and dot-blot hybridization assay, DNA from non-related bacteria was included.
Table 1: PCR primers and probes to amplify products for identifying the pathogenic, saprophyte, and intermediate clades of Leptospira. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65435/TABLE_1_ 7th_PR_ EMCC.xlsx" target="_blank">Please click here to download this Table.</a>
Dot-blot hybridization assay 
The technique is called dot-blot because the holes in which the DNA sample is placed have a dot shape, and when they are sucked to be fixed in place by vacuum suction, they acquire this shape. This technique was developed by Kafatos et al.40. The technique allows the semi-quantification of Leptospira in each PCR-positive sample. The protocol consists of a denaturation with NaOH 0.4 M at room temperature, samples with Leptospira DNA from 30 ng to 0.05 ng, corresponding to 6 x 106 to 1 x 104 leptospires, are blotted onto a nylon membrane with a 96-well dot-blot apparatus. After immobilization, the DNA is bound to the membrane by exposure to 120 mJ UV light. Each DNA probe is conjugated with digoxigenin-11 dUTP by a terminal transferase catalysis step at the 3&#39; end (Digoxigenin is a plant steroid obtained from Digitalis purpurea, used&#160;as a reporter41). Following the stringent hybridization of the labeled DNA probe (50 pmol) at the specific temperature onto the target DNA, the DNA hybrids are visualized by the chemiluminescence reaction with the anti-digoxigenin alkaline phosphatase antibody covalently conjugated with its substrate CSPD. The luminescence is captured by exposure to an X-ray film (Figure 2).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65435/65435fig02v2.jpg" /> 
Figure 2: Steps of the procedure for the PCR-dot-blot assay. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65435/65435fig02largev2.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>

Författare i fokus: Leptospira DNA-detektion i vatten för miljöanalys och sjukdomsövervakning

Polymeraskedjereaktion och dot-blot-hybridisering för Leptospira-detektion i vattenprover

This protocol is designed to identify the presence of Leptospira DNA in water samples. The dot-blot technique is utilized for this purpose, which enables accurate detection and analysis of the DNA. The dot-blot is an easy and versatile non-isotopic technique and may help to answer key questions about the environmental distribution of Leptospira.This method has the potential to assess huge water bodies and aid in disease surveillance.

För att bedöma teknikens effektivitet användes genomiskt DNA från rena kulturer av varje Leptospira serovar, tillsammans med den kladspecifika sonden. Membran preparerades med 100 ng genomiskt DNA per PCR-reaktion för varje serovar, följt av åtta genomiskt DNA från icke-besläktade bakterier och variabla koncentrationer av genomiskt DNA från ad hoc Leptospira-serovarerna. Varje analys inkluderade positiv, negativ och icke-mallkontroll. Detta icke-besläktade genomiska DNA visade ingen affinitet...

I denna studie utformades en dot-blot-applikation för att detektera Leptospira från de tre huvudkladerna i vattenprover. Denna metod gör det möjligt att identifiera minimala DNA-mängder som specifikt angrips av en digoxigeninmärkt sond, som lätt detekteras av en anti-digoxigenin-antikropp. Detta tillvägagångssätt är ett värdefullt och tillfredsställande verktyg för screeningändamål.

The dot-blot is a simple, fast, sensitive, and versatile technique that enables the identification of minimal quantities of DNA specifically targeted by ...

Detta protokoll är utformat för att identifiera förekomsten av Leptospira DNA i vattenprover. Dot-blot-tekniken används för detta ändamål, vilket möjliggör noggrann upptäckt och analys av DNA. Dot-blot är en enkel och mångsidig icke-isotopisk teknik som kan hjälpa till att besvara viktiga frågor om miljödistributionen av Leptospira.Denna metod har potential att bedöma enorma vattenförekomster och hjälpa till med sjukdomsövervakning.

polymerase-chain-reaction-dot-blot-hybridization-for-leptospira

Research

JoVE Journal

Biology

Polymerase Chain Reaction and Dot-Blot Hybridization for Leptospira Detection in Water Samples

The dot-blot is a simple, fast, sensitive, and versatile technique that enables the identification of minimal quantities of DNA specifically targeted by probe hybridization in the presence of carrier DNA. It is based on the transfer of a known amount of DNA onto an inert solid support, such as a nylon membrane, utilizing the dot-blot apparatus and without electrophoretic separation. Nylon membranes have the advantage of high nucleic acid binding capacity (400 &#181;g/cm2), high strength, and are positively or neutrally charged. The probe used is a highly specific ssDNA fragment of 18 to 20 bases long labeled with digoxigenin (DIG). The probe will conjugate with the Leptospira DNA. Once the probe has hybridized with the target DNA, it is detected by an anti-digoxigenin antibody, allowing its easy detection through its emissions revealed in an X-ray film. The dots with an emission will correspond to the DNA fragments of interest. This method employs the non-isotopic labeling of the probe, which may have a very long half-life. The drawback of this standard immuno-label is a lower sensitivity than isotopic probes. Nevertheless, it is mitigated by coupling polymerase chain reaction (PCR) and dot-blot assays. This approach enables the enrichment of the target sequence and its detection. Additionally, it may be used as a quantitative application when compared against a serial dilution of a well-known standard. A dot-blot application to detect Leptospira from the three main clades in water samples is presented here. This methodology can be applied to large amounts of water once they have been concentrated by centrifugation to provide evidence of the presence of Leptospiral DNA. This is a valuable and satisfactory tool for general screening purposes, and may be used for other non-culturable bacteria that may be present in water, enhancing the comprehension of the ecosystem.

In this study, a dot-blot application was designed to detect Leptospira from the three main clades in water samples. This method allows for the identification of minimal DNA quantities specifically targeted by a digoxigenin-labeled probe, easily detected by an anti-digoxigenin antibody. This approach is a valuable and satisfactory tool for screening purposes.