Name: Author Spotlight: Unveiling Mitochondrial Contact Sites and Architectural Insights
Uploaded: 2023-06-16T14:40:00
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M.E.H.는 재정 지원을 위해 프로젝트 번호 413985647인 DFG(Deutsche Forschungsgemeinschaft)를 인정합니다. 저자들은 뮌헨 루트비히-막시밀리안 대학교의 미하엘 키블러 박사의 관대하고 광범위한 지원에 감사를 표한다. Walter Neupert의 과학적 의견, 유용한 토론 및 지속적인 영감에 감사드립니다. JF는 뮌헨 생명 과학 대학원(LSM)의 지원에 감사드립니다.

1. 완충액과 원액
<ol><li>탈이온수, pH 7.4에서 1M 3-모르폴리노프로판-1-술폰산(MOPS) 용액을 만듭니다. 4 °C에서 보관하십시오.</li>
	<li>탈이온수(pH 8.0)에서 500mM 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)을 준비합니다. 실온에서 보관하십시오.</li>
	<li>탈이온수에 2.4M 소르비톨을 준비합니다. 오토클레이브 후 실온에서 보관하십시오.</li>
	<li>탈이온수에 2.5M 자당을 준비합니다. 오토클레이브 후 ?...

Isolation of Mitochondrial Contact Sites

미토콘드리아 분획은 여러 매우 복잡한 단계를 거쳐야 하는 복잡한 실험입니다. 따라서 우리는 확립된 방법32를 더욱 개선하고 어느 정도 단순화하는 것을 목표로 했습니다. 여기서 문제는 종종 개별 구조인 복잡하고 고도로 전문화된 장비에 대한 요구 사항과 막대한 시간과 에너지 소비였습니다. 이를 위해 선형 그래디언트를 주조 및 수확하는 데 사용되는 펌프와 개별 구조를 ...

미토콘드리아는 진핵생물에서 다양한 기능을 수행하며, 가장 잘 알려진 것은 산화적 인산화를 통한 ATP 생성입니다. 다른 기능으로는 철-황 클러스터의 생성, 지질 합성 및 고등 진핵 생물에서 Ca 2 + 신호 전달 및 세포 사멸유도 1,2,3,4가 있습니다. 이러한 기능은 복잡한 초미세 구조와 불가분의 관계에 있습니다.
미토콘드리아 초미세구조는 전자현미경5에 의해 처음 기술되었다. 미토콘드리아는 미토콘드리아 외막과 미토콘드리아 내막이라는 두 개의 막으로 구성된 다소 복잡한 세포 기관인 것으로 나타났습니다. 따라서 두 개의 수성 구획이 이러한 막에 의해 형성됩니다 : 막간 공간과 매트릭스. 미토콘드리아 내막은 더 많은 부분으로 나눌 수 있습니다. 내경막은 외막에 근접하여 유지되며 크리스타는 침범을 형성합니다. 소위 크리스타 접합부(crista junctions)는 내경막(inner boundary membrane)과 크리스타(cristae)를 연결합니다(그림 1). 또한, 삼투압으로 축소된 미토콘드리아의 전자 현미경 사진은 미토콘드리아 막이 단단히 연결된 부위가 존재한다는 것을 보여줍니다 6,7. 이러한 소위 접촉 부위는 두 막에 걸쳐 있는 단백질 복합체에 의해 형성됩니다(그림 1). 이러한 상호작용 부위는 미토콘드리아 역학 및 유전의 조절뿐만 아니라 세포질과 매트릭스8 사이의 대사 산물 및 신호 전달에 중요하기 때문에 세포 생존력에 필수적인 것으로 생각된다.
미토콘드리아 내막의 MICOS 복합체는 아마도 가장 특징적이고 가장 다재다능한 접촉 부위 형성 복합체일 것입니다. MICOS는 2011년 효모에 기술되어 있으며, Mic60, Mic27, Mic26, Mic19, Mic12 및 Mic10의 6개 소단위 9,10,1 1로 구성됩니다. 이들은 크리스타 접합부 9,10,11에 국한되는 약 1.5 MDa의 복합체를 형성합니다. 핵심 서브유닛인 Mic10 또는 Mic60을 삭제하면 이 복잡한 9,11이 없어지는데, 이는 이 두 서브유닛이 MICOS의 안정성에 필수적이라는 것을 의미합니다. 흥미롭게도, MICOS는 다양한 미토콘드리아 외막 단백질 및 복합체와 하나의 접촉 부위를 형성할 뿐만 아니라 여러 개의 접촉 부위를 형성합니다: TOM 복합체 11,12, TOB/SAM 복합체 9,12,13,14,15,16, Fzo1-Ugo1 복합체 9, Por1 10, OM4510 및 Miro 17. 이는 MICOS 복합체가 단백질 가져오기, 인지질 대사 및 미토콘드리아 초세구조18의 생성과 같은 다양한 미토콘드리아 과정에 관여한다는 것을 강력하게 시사한다. MIC10 또는 MIC60의 결실을 통해 유도된 MICOS 복합체의 부재는 일반 크리스타가 거의 완전히 결여된 비정상적인 미토콘드리아 초세구조로 이어지기 때문에 후자의 기능은 아마도 MICOS의 주요 기능일 것입니다. 대신, 내부 경계막에 연결되지 않은 내부 막 소포는19, 20을 축적합니다. 중요한 것은 MICOS가 효모에서 인간에 이르기까지 형태와 기능이 보존된다는 것입니다21. MICOS 소단위체의 돌연변이와 심각한 인간 질병의 연관성은 또한 더 높은 진핵생물에 대한 중요성을 강조합니다22,23. MICOS는 매우 다재다능하지만 추가 접촉 사이트가 존재해야 합니다(미공개 관찰 결과). 실제로, 미토콘드리아 특이적 인지질 카디올리핀(27)의 생합성에 관여하는 미토콘드리아 융합 기계 Mgm1-Ugo1/Fzo124,25,26 또는 Mdm31-Por1과 같은 몇 가지 다른 접촉 부위가 확인되었습니다. 최근에, 우리는 외막 복합체 Por1-Om1428로 형성된 새로운 접촉 부위의 일부로서 Cqd1을 식별하기 위해 MICOS의 식별로 이어진 방법을 개선했습니다. 흥미롭게도, 이 접촉 부위는 미토콘드리아 막 항상성, 인지질 대사 및 코엔자임 Q28,29의 분포와 같은 여러 과정에도 관여하는 것으로 보입니다.
여기서는 앞서 설명한 미토콘드리아 9,30,31,32,33의 분획의 변형을 사용했습니다. 미토콘드리아의 삼투압 처리는 미토콘드리아 외막의 파괴와 매트릭스 공간의 수축으로 이어져 두 막이 접촉 부위에서만 근접하게 됩니다. 이를 통해 미토콘드리아 외막 또는 미토콘드리아 내막으로만 구성되거나 온화한 초음파 처리를 통해 두 막의 접촉 부위를 포함하는 소포를 생성 할 수 있습니다. 미토콘드리아 내막은 단백질 대 지질 비율이 훨씬 높기 때문에 미토콘드리아 내막 소포는 미토콘드리아 외막 소포에 비해 더 높은 밀도를 나타냅니다. 밀도의 차이는 자당 부력 밀도 구배 원심 분리를 통해 막 소포를 분리하는 데 사용할 수 있습니다. 따라서, 미토콘드리아 외막 소포는 낮은 슈크로스 농도에서 축적되는 반면, 미토콘드리아 내막 소포는 높은 슈크로스 농도에서 농축된다. 접촉 부위를 포함하는 소포는 중간 자당 농도로 농축됩니다(그림 2). 다음의 프로토콜은 이전에 확립된 것에 비해 덜 전문화된 장비, 시간 및 에너지를 필요로 하는 이 개선된 방법을 상세히 설명하고, 가능한 접촉 부위 단백질의 식별을 위한 유용한 도구를 제공한다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>13.2 mL, Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tube, 14 x 89mm</td>
			<td>Beckman Instruments, Germany</td>
			<td>344059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL, Open-Top Thickwall Polycarbonate Open-Top Tube, 29 x 104mm</td>
			<td>Beckman Instruments, Germany</td>
			<td>363647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A-25.50 Fixed-Angle Rotor- Aluminum, 8 x 50 mL, 25,000 rpm, 75,600 x g</td>
			<td>Beckman Instruments, Germany</td>
			<td>363055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Abbe refractometer</td>
			<td>Zeiss, Germany</td>
			<td></td>
			<td>discontinued, 
			any pipet controller will suffice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>accu-jet pro Pipet Controller</td>
			<td>Brandtech, USA</td>
			<td>BR26320</td>
			<td>discontinued, 
			any pipet controller will suffice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beaker 1000 mL</td>
			<td>DWK Life Science, Germany</td>
			<td>C118.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Branson&#160; Digital Sonifier W-250 D</td>
			<td>Branson Ultrasonics, USA</td>
			<td>FIS15-338-125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Branson Ultrasonic 3mm TAPERED MICROTIP</td>
			<td>Branson Ultrasonics, USA</td>
			<td>101-148-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Branson Ultrasonics 200- and 400-Watt Sonifiers: Rosette Cooling Cell</td>
			<td>Branson Ultrasonics, USA</td>
			<td>15-338-70</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Avanti JXN-26</td>
			<td>Beckman Instruments, Germany</td>
			<td>B37912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Optima XPN-100 ultra</td>
			<td>Beckman Instruments, Germany</td>
			<td>8043-30-0031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cOmplete Proteaseinhibtor-Cocktail</td>
			<td>Roche, Switzerland</td>
			<td>11697498001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Sorbit</td>
			<td>Roth, Germany</td>
			<td>6213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA (Ethylendiamin-tetraacetic acid disodium salt dihydrate)</td>
			<td>Roth, Germany</td>
			<td>8043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erlenmeyer flask, 100 mL</td>
			<td>Roth, Germany</td>
			<td>X747.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>graduated pipette, Kl. B, 25:0, 0.1</td>
			<td>Hirschmann, Germany</td>
			<td>1180170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>graduated pipette, Kl. B, 5:0, 0.05</td>
			<td>Hirschmann, Germany</td>
			<td>1180153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ice bath</td>
			<td>neoLab, Germany</td>
			<td>&#160;S12651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stirrer RCT basic</td>
			<td>IKA-Werke GmbH, Germany</td>
			<td>Z645060GB-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS (3-(N-Morpholino)propanesulphonic acid)</td>
			<td>Gerbu, Germany</td>
			<td>1081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MyPipetman Select P1000</td>
			<td>Gilson, USA</td>
			<td>FP10006S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MyPipetman Select P20</td>
			<td>Gilson, USA</td>
			<td>FP10003S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MyPipetman Select P200</td>
			<td>Gilson, USA</td>
			<td>FP10005S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Omnifix 1 mL</td>
			<td>Braun, Germany</td>
			<td>4022495251879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)</td>
			<td>Serva, Germany</td>
			<td>32395.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STERICAN cannula 21 Gx4 4/5 0.8x120 mm</td>
			<td>Braun, Germany</td>
			<td>4022495052414</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stirring bar, 15 mm</td>
			<td>VWR, USA</td>
			<td>442-0366</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Merck, Germany</td>
			<td>S8501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor</td>
			<td>Beckman Instruments, Germany</td>
			<td>331362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Test tubes</td>
			<td>Eppendorf, Germany</td>
			<td>3810X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue grinders, Potter-Elvehjem type, 2 mL glass vessel</td>
			<td>VWR, USA</td>
			<td>432-0200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue grinders, Potter-Elvehjem type, 2 mL plunger with serrated tip</td>
			<td>VWR, USA</td>
			<td>432-0212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichloroacetic acid (TCA)</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td>33731</td>
			<td>discontinued, 
			any TCA will suffice (CAS: 73-03-9)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIS</td>
			<td>Roth, Germany</td>
			<td>4855</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an improved method to isolate mitochondrial contact sites

미토콘드리아는 거의 모든 진핵 세포에 존재하며 철-황 클러스터, 지질 또는 단백질의 합성, Ca2+ 완충 및 세포 사멸 유도와 같은 에너지 생산을 훨씬 능가하는 필수 기능을 수행합니다. 마찬가지로 미토콘드리아 기능 장애는 암, 당뇨병 및 신경 퇴행과 같은 심각한 인간 질병을 초래합니다. 이러한 기능을 수행하기 위해 미토콘드리아는 두 개의 막으로 구성된 외피를 통해 세포의 나머지 부분과 통신해야 합니다. 따라서 이 두 멤브레인은 지속적으로 상호 작용해야 합니다. 미토콘드리아 내막과 외막 사이의 단백질 접촉 부위는 이 점에서 필수적입니다. 지금까지 여러 접촉 사이트가 확인되었습니다. 여기에 설명된 방법에서, 맥주효모균 미 토콘드리아는 접촉 부위를 분리하고, 따라서 접촉 부위 단백질에 적합한 후보를 식별하는 데 사용됩니다. 우리는 이 방법을 사용하여 미토콘드리아 내막의 주요 접촉 부위 형성 복합체 중 하나인 미토콘드리아 접촉 부위 및 크리스타 조직 시스템(MICOS) 복합체를 식별했으며, 이는 효모에서 인간으로 보존됩니다. 최근에는 이 방법을 더욱 개선하여 Cqd1 및 Por1-Om14 복합체로 구성된 새로운 접촉 부위를 식별했습니다.

Mitochondria perform a variety of different functions in eukaryotes, with the most well-known being the production of ATP through oxidative phosphorylation. Other functions include the production of iron-sulfur clusters, lipid synthesis, and in higher eukaryotes, Ca2+ signaling, and the induction of apoptosis1,2,3,4. These functions are inseparably linked to their complex ultrastructure.
The mitochondrial ultrastructure was first described by electron microscopy5. It was shown that mitochondria are rather complex organelles consisting of two membranes: the mitochondrial outer membrane and the mitochondrial inner membrane. Thus, two aqueous compartments are formed by these membranes: the intermembrane space and the matrix. The mitochondrial inner membrane can be even further divided into different sections. The inner boundary membrane stays in close proximity to the outer membrane, and the cristae form invaginations. So-called crista junctions connect the inner boundary membrane and the cristae (Figure 1). Furthermore, electron micrographs of osmotically shrunken mitochondria reveal that sites exist at which the mitochondrial membranes are tightly connected6,7. These so-called contact sites are formed by protein complexes spanning the two membranes (Figure 1). It is thought that these interaction sites are essential for cell viability due to their importance for the regulation of mitochondrial dynamics and inheritance, as well as the transfer of metabolites and signals between the cytosol and the matrix8.
The MICOS complex in the mitochondrial inner membrane is probably the best characterized and the most versatile contact site-forming complex. MICOS was described in yeast in 2011, and it consists of six subunits9,10,11: Mic60, Mic27, Mic26, Mic19, Mic12, and Mic10. These form a complex of approximately 1.5 MDa that localizes to the crista junctions9,10,11. The deletion of either core subunit, Mic10 or Mic60, leads to the absence of this complex9,11, meaning these two subunits are essential for the stability of MICOS. Interestingly, MICOS forms not only one but multiple contact sites with various mitochondrial outer membrane proteins and complexes: the TOM complex11,12, the TOB/SAM complex9,12,13,14,15,16, the Fzo1-Ugo1 complex9, Por110, OM4510, and Miro17. This strongly indicates that the MICOS complex is involved in various mitochondrial processes, such as protein import, phospholipid metabolism, and the generation of the mitochondrial ultrastructure18. The latter function is probably the major function of&#160;MICOS, as the absence of the MICOS complex induced through the deletion of MIC10&#160;or MIC60&#160;leads to an abnormal mitochondrial ultrastructure that virtually completely lacks regular cristae. Instead, internal membrane vesicles without connection to the inner boundary membrane accumulate19, 20. Importantly, MICOS is conserved in form and function from yeast to&#160;human21. The association of mutations in MICOS subunits with severe human diseases also emphasizes its importance for higher eukaryotes22,23. Although MICOS is highly versatile, additional contact sites must exist (based on our unpublished observations). Indeed, several other contact sites have been identified, for instance, the mitochondrial fusion machineries Mgm1-Ugo1/Fzo124,25,26&#160;or Mdm31-Por1, which is involved in the biosynthesis of the mitochondrial-specific phospholipid cardiolipin27. Recently, we improved the method that led us to the identification of MICOS to identify Cqd1 as part of a novel contact site formed with the outer membrane complex Por1-Om1428. Interestingly, this contact site also seems to be involved in multiple processes such as mitochondrial membrane homeostasis, phospholipid metabolism, and the distribution of coenzyme Q28,29.
Here, we used a variation of the previously described fractionation of mitochondria9,30,31,32,33. Osmotic treatment of mitochondria leads to the disruption of the mitochondrial outer membrane and to a shrinkage of the matrix space, leaving the two membranes only in close proximity at contact sites. This allows for the generation of vesicles that consist exclusively of mitochondrial outer membrane or mitochondrial inner membrane or at contain contact sites of both membranes through mild sonication. Due to the mitochondrial inner membrane possessing a much higher protein-to-lipid ratio, mitochondrial inner membrane vesicles exhibit a higher density compared to mitochondrial outer membrane vesicles. The difference in density can be used to separate the membrane vesicles through sucrose buoyant density gradient centrifugation. Thus, the mitochondrial outer membrane vesicles accumulate at low sucrose concentrations, while the mitochondrial inner membrane vesicles are enriched at high sucrose concentrations. The vesicles containing contact sites concentrate at intermediate sucrose concentrations (Figure 2). The following protocol describes this improved method, which requires less specialized equipment, time, and energy compared to our previously established one32, in detail and provides a useful tool for the identification of possible contact site proteins.

Author Spotlight: Unveiling Mitochondrial Contact Sites and Architectural Insights 

미토콘드리아 접촉 부위를 분리하는 개선된 방법

미토콘드리아 내막과 외막을 분리하는 것은 비교적 쉽습니다. 그러나 접촉 부위 함유 소포의 생성 및 분리는 훨씬 더 어렵습니다. 우리의 의견으로는, 두 단계가 중요하고 필수적입니다 : 초음파 처리 조건과 사용 된 기울기.
일반적으로 선형 그래디언트는 스텝 그래디언트에 비해 해상도가 더 좋은 것으로 생각됩니다. 그러나 재현 가능한 생산은 지루하고 특수 장비가 필요?...

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미토콘드리아 접촉 부위는 미토콘드리아 내막 및 외막 단백질과 상호 작용하는 단백질 복합체입니다. 이 부위는 미토콘드리아 막과 세포질과 미토콘드리아 기질 사이의 통신에 필수적입니다. 여기에서는 이 특정 종류의 단백질에 적합한 후보를 식별하는 방법을 설명합니다.

Mitochondria are present in virtually all eukaryotic cells and perform essential functions that go far beyond energy production, for instance, the ...

우리는 미토콘드리아 접촉 부위의 분자 기능을 이해하여 두 미토콘드리아 막 사이의 통신을 가능하게 하는 것을 목표로 합니다. 이것은 실제로 미토콘드리아 생물 발생과 세포 생존력에 대한 기능을 파악하기 위한 전제 조건입니다. 우리는 Cqd1과 Om14-Por1에 의해 생성된 미토콘드리아 내막과 외막 사이의 새로운 접촉 부위를 발견했습니다.우리의 데이터는 이 사이트가 포스파티드산과 같은 지질 가져오기에 도움이 될 수 있음을 시사합니다. MICOS 복합체의 식별을 기반으로 미토콘드리아 막 구조가 어떻게 생성되는지에 대한 더 깊은 이해를 얻는 데 기여했습니다. 이를 통해 우리는 두 가지 형태의 미토콘드리아 크리스타, 라멜라와 세뇨관 크리스타가 어떻게 형성되는지 설명하는 작업 모델을 개발할 수 있었습니다.우리의 연구는 과거에 효모에서 수행되었습니다. 그러나 우리는 올바른 미토콘드리아 구조의 형성이 고등 진핵생물에게도 중요하다고 확신합니다. 따라서 우리 연구의 다음 단계는 일차 뉴런과 같은 더 복잡한 모델에서 미토콘드리아 구조 요소의 역할을 분석하는 것입니다.