Name: Author Spotlight: A Selective Luciferase-Based Assay for Monitoring ATG4B 27 Activity in Cells
Uploaded: 2023-06-30T12:10:00
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Este trabalho foi apoiado pelo financiamento principal do Conselho de Pesquisa Médica do Reino Unido para o MRC-UCL University Unit Grant Ref MC_U12266B, MRC Dementia Platform Grant UK MR/M02492X/1, Pancreatic Cancer UK (referência de concessão 2018RIF_15), e o esquema de Apoio à Aceleração Terapêutica da UCL, apoiado pelo financiamento do MRC Confidence in Concept 2020 UCL MC/PC/19054. O plasmídeo que codifica o ActinLC3dNGLUC (pMOWS-ActinLC3dNGLUC) foi obtido do Dr. Robin Ketteler (Departamento de Medicina Humana, Faculdade de Medicina de Berlim).

NOTA: O processo de ensaio é descrito na Figura 1. Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes relacionados a todos os materiais, reagentes e equipamentos usados neste protocolo.
1. Produção de retrovírus
NOTA: O plasmídeo que codifica o ActinLC3dNGLUC é pMOWS-ActinLC3dNGLUC20. Use um número baixo de células para a produção de vírus de alto título (idealmente men...

High-Throughput Screening Analysis for 4B Cysteine Peptidase Autophagy Inhibitor

<ol>
	<li>Kocaturk, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+as+a+molecular+target+for+cancer+treatment.">Autophagy as a molecular target for cancer treatment.</a> European Journal of Pharmaceutical Sciences. 134, 116-137 (2019).</li><li>Fu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+ATG4+in+cancer+therapy.">Targeting ATG4 in cancer therapy.</a> Cancers. 11 (5), 649 (2019).</li><li>Towers, C. G., Thorburn, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+targeting+of+autophagy.">Therapeutic targeting of autophagy.</a> EBioMedicine. 14, 15-23 (2016).</li><li>Agrotis, A., Ketteler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+ATG4B+as+drug+target+for+treatment+of+solid+tumours-the+knowns+and+the+unknowns.">On ATG4B as drug target for treatment of solid tumours-the knowns and the unknowns.</a> Cells. 9 (1), 53 (2019).</li><li>Levy, J. M. M., Towers, C. G., Thorburn, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+autophagy+in+cancer.">Targeting autophagy in cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 17 (9), 528-542 (2017).</li><li>Kimmelman, A. C., White, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+and+tumor+metabolism.">Autophagy and tumor metabolism.</a> Cell Metabolism. 25 (5), 1037-1043 (2017).</li><li>Tran, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Context-dependent+role+of+ATG4B+as+target+for+autophagy+inhibition+in+prostate+cancer+therapy.">Context-dependent role of ATG4B as target for autophagy inhibition in prostate cancer therapy.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 441 (4), 726-731 (2013).</li><li>Pengo, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+kinases+and+phosphatases+that+regulate+ATG4B+activity+by+siRNA+and+small+molecule+screening+in+cells.">Identification of kinases and phosphatases that regulate ATG4B activity by siRNA and small molecule screening in cells.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6, 148 (2018).</li><li>Kauffman, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delipidation+of+mammalian+Atg8-family+proteins+by+each+of+the+four+ATG4+proteases.">Delipidation of mammalian Atg8-family proteins by each of the four ATG4 proteases.</a> Autophagy. 14 (6), 992-1010 (2018).</li><li>Tanida, I., Sou, Y. -. S., Minematsu-Ikeguchi, N., Ueno, T., Kominami, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atg8L/Apg8L+is+the+fourth+mammalian+modifier+of+mammalian+Atg8+conjugation+mediated+by+human+Atg4B,+Atg7+and+Atg3.">Atg8L/Apg8L is the fourth mammalian modifier of mammalian Atg8 conjugation mediated by human Atg4B, Atg7 and Atg3.</a> The FEBS Journal. 273 (11), 2553-2562 (2006).</li><li>Agrotis, A., Pengo, N., Burden, J. J., Ketteler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redundancy+of+human+ATG4+protease+isoforms+in+autophagy+and+LC3/GABARAP+processing+revealed+in+cells.">Redundancy of human ATG4 protease isoforms in autophagy and LC3/GABARAP processing revealed in cells.</a> Autophagy. 15 (6), 976-997 (2019).</li><li>Nguyen, T. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atg8+family+LC3/GABARAP+proteins+are+crucial+for+autophagosome-lysosome+fusion+but+not+autophagosome+formation+during+PINK1/Parkin+mitophagy+and+starvation.">Atg8 family LC3/GABARAP proteins are crucial for autophagosome-lysosome fusion but not autophagosome formation during PINK1/Parkin mitophagy and starvation.</a> The Journal of Cell Biology. 215 (6), 857-874 (2016).</li><li>Ketteler, R., Tooze, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATG4:+More+than+a+protease.">ATG4: More than a protease.</a> Trends in Cell Biology. 31 (7), 515-516 (2021).</li><li>Zhang, L., Li, J., Ouyang, L., Liu, B., Cheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unraveling+the+roles+of+Atg4+proteases+from+autophagy+modulation+to+targeted+cancer+therapy.">Unraveling the roles of Atg4 proteases from autophagy modulation to targeted cancer therapy.</a> Cancer Letters. 373 (1), 19-26 (2016).</li><li>Fern&#225;ndez, &. #. 1. 9. 3. ;. F., L&#243;pez-Ot&#237;n, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+functional+and+pathologic+relevance+of+autophagy+proteases.">The functional and pathologic relevance of autophagy proteases.</a> The Journal of Clinical Investigation. 125 (1), 33-41 (2015).</li><li>Maruyama, T., Noda, N. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy-regulating+protease+Atg4:+structure,+function,+regulation+and+inhibition.">Autophagy-regulating protease Atg4: structure, function, regulation and inhibition.</a> The Journal of Antibiotics. 71 (1), 72-78 (2017).</li><li>Ketteler, R., Seed, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+of+autophagy+by+luciferase+release+assay.">Quantitation of autophagy by luciferase release assay.</a> Autophagy. 4 (6), 801-806 (2008).</li><li>Ketteler, R., Sun, Z., Kovacs, K. F., He, W. -. W., Seed, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pathway+sensor+for+genome-wide+screens+of+intracellular+proteolytic+cleavage.">A pathway sensor for genome-wide screens of intracellular proteolytic cleavage.</a> Genome Biology. 9 (4), 64 (2008).</li><li>Luft, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+Gaussia+luciferase+in+bicistronic+and+non-conventional+secretion+reporter+constructs.">Application of Gaussia luciferase in bicistronic and non-conventional secretion reporter constructs.</a> BMC Biochemistry. 15, 14 (2014).</li><li>Ketteler, R., Glaser, S., Sandra, O., Martens, U. M., Klingm&#252;ller, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+transgene+expression+in+primitive+hematopoietic+progenitor+cells+and+embryonic+stem+cells+efficiently+transduced+by+optimized+retroviral+hybrid+vectors.">Enhanced transgene expression in primitive hematopoietic progenitor cells and embryonic stem cells efficiently transduced by optimized retroviral hybrid vectors.</a> Gene Therapy. 9 (8), 477-487 (2002).</li></ol>

Este protocolo descreve um ensaio genético-repórter baseado em células para a identificação de inibidores de ATG4B. A identificação de hits primários é baseada na atividade da luciferase no tratamento de células que expressam o quadro de leitura aberto de comprimento total da LC3B entre β-actina e dNGLUC. Algumas vantagens deste ensaio são que ele é sensível, altamente quantitativo e não invasivo, pois pode detectar dNGLUC sem lisar as células. Este trabalho apresenta um protocolo detalhado para geração...

A autofagia é um processo metabólico conservado que permite às células manter a homeostase intracelular e responder ao estresse degradando conteúdos celulares envelhecidos, defeituosos ou desnecessários através dos lisossomos 1,2,3. Em algumas condições fisiopatológicas, esse processo atua como uma resposta celular crucial à privação de nutrientes e oxigênio, resultando em nutrientes e lipídios reciclados, permitindo que as células se adaptem às suas necessidades metabólicas 2,3,4. A autofagia também tem sido identificada como uma resposta celular ao estresse relacionada a diversas doenças, como doenças neurodegenerativas, infecção por patógenos e vários tipos de câncer. A função da autofagia no câncer é complexa e dependente do tipo, estágio e status do tumor. Pode suprimir a tumorigênese por degradação autofágica das células lesadas, mas também pode promover a sobrevivência de tumores avançados por melhorar a sobrevivência celular durante condições estressantes, como hipóxia, privação de nutrientes e dano citotóxico2,4,5,6.
Vários estudos têm demonstrado que a inibição da autofagia proporciona um benefício como estratégia antineoplásica. Assim, a inibição de etapas críticas, como a formação do autofagossomo ou sua fusão com o lisossomo, poderia ser um método eficaz para o controle do câncer2,4,5,6. Evidências crescentes têm mostrado que a ATG4B está envolvida em certas condições patológicas, e tem ganhado atenção como um potencial alvo anticâncer2,3,4. Por exemplo, observou-se que células de câncer colorretal e células de câncer de mama positivas para receptor 2 do fator de crescimento epidérmico humano (HER2) apresentaram níveis de expressão de ATG4B significativamente mais elevados do que células normais adjacentes 2,4. Em células de câncer de próstata, a inibição da ATG4B resultou em suscetibilidade específica de linhagem celular à quimioterapia e radioterapia7. Recentemente, surgiram fortes evidências de que o adenocarcinoma ductal pancreático (ADP) é particularmente vulnerável à inibição da ATG4B. Por exemplo, em um modelo de camundongo geneticamente modificado, demonstrou-se que a perda intermitente da função ATG4B reduz o crescimento tumoral de ADP e aumenta a sobrevida 3,4. Em geral, a ATG4B é altamente superexpressa em alguns tipos de câncer, está relacionada à progressão do tumor e está ligada à resistência à terapia do câncer 2,4,8.
As ATG4 cisteína proteases em mamíferos possuem quatro membros da família, ATG4A-ATG4D. Essas proteínas exibem alguma seletividade alvo para a família de proteínas LC3/GABARAP (ATG8) 9,10,11 e podem ter funções adicionais não ligadas à sua atividade proteásica12,13. Além disso, a ATG4 atua na regulação de um novo tipo de modificação pós-traducional, a ATG8-ilação de proteínas11,12. Embora a ATG4B e seu principal substrato LC3B sejam os mais estudados, um quadro está emergindo que sugere um papel complexo para cada membro da subfamília na regulação de processos autofágicos e não autofágicos. Isso é corroborado por uma complexa rede de modificações pós-traducionais que regulam a atividade da ATG4B via fosforilação, acetilação, glicosilação e nitrosilação 9,10,11,12,13.
Vários inibidores conhecidos de ATG4B foram publicados2,4,14,15. Embora sejam adequados como ferramentas de pesquisa, seu perfil farmacodinâmico, seletividade ou potência ainda os impedem de se desenvolver como candidatos pré-clínicos 4,16. Em geral, há uma necessidade urgente de identificar compostos mais potentes e seletivos. Muitas vezes, os compostos são bons inibidores bioquímicos da função proteica, mas sua eficácia em ensaios baseados em células é pobre. Existem vários ensaios para monitorar a atividade de ATG4B, incluindo métodos bioquímicos e ensaios baseados em células4. Desenvolvemos previamente um ensaio simples, baseado em luminescência e de alto rendimento para monitorar a atividade de ATG4B em células 8,17. Este ensaio utiliza uma proteína luciferase de Gaussia princeps (GLUC) que é estável e ativa no meio extracelular e pode ser liberada inducivelmente das células em resposta à atividade proteolítica ATG4B18,19.
Nesta construção do repórter, a dNGLUC está ligada ao citoesqueleto de actina das células. Um ligante protease-específico pode ser introduzido entre a âncora de β-actina e a dNGLUC, tornando a secreção dependente da clivagem do ligante. Utilizou-se o quadro de leitura aberta de comprimento total da CL3B entre β-actina e dNGLUC, para poder monitorar a clivagem da CL3B17,18,19. Embora o mecanismo de secreção da dNGLUC seja pouco compreendido, ele é específico para monitorar a atividade de ATG4B, não depende da autofagia global como ocorre em células knockout de ATG5 e é mediado por mecanismos não convencionais que não requerem um peptídeo sinal clássico 4,18,19. Usamos com sucesso este repórter para selecionar pequenas moléculas e bibliotecas de siRNA, e identificamos novos reguladores da atividade de ATG4B, como as quinases da proteína Akt8. Este artigo descreve um protocolo detalhado para o uso deste repórter de luciferase em um formato de triagem semi-automatizado e de alto rendimento.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>50 &#181;L Disposable Tips - Non-filtered, Pure, Nested 8 Stack (Passive Stack)</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>30038609</td>
			<td>Disposable 96-tip rack</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioTek MultiFlo</td>
			<td>BioTek</td>
			<td></td>
			<td>bulk dispenser</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coelenterazine</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-205904</td>
			<td>substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Columbus Image analysis software</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>Version 2.9.1</td>
			<td>image analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS (1x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Echo Qualified 384-Well Polypropylene Microplate, Clear, Non-sterile</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>001-14555</td>
			<td>384PP plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EnVision II</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td></td>
			<td>luminescence plate reader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Express pick Library (96-well)-L3600-Z369949-100&#181;L</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>L3600</td>
			<td>Selleckchem</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FMK9A</td>
			<td>MedChemExpress</td>
			<td>HY-100522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Greiner FLUOTRAC 200 384 well plates</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>781076</td>
			<td>solid-black 384-well plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Harmony Imaging software</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>Version 5.1</td>
			<td>imaging software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate - 10 mg/mL Solution in Water</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>H3570</td>
			<td>Hoechst 33342</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labcyte Echo 550 series with Echo Cherry Pick software</td>
			<td>Labcyte/Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td>nanoscale acoustic liquid dispenser</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milli-Q water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>deionized water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opera Phenix High-Content Screening System</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td></td>
			<td>automated microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde solution 4% in PBS</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-281692</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PhenoPlate 384-well, black, optically clear flat-bottom, tissue-culture treated, lids</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>6057300</td>
			<td>CellCarrier-384 Ultra PN</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMOWS-ActinLC3dNGLUC</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Obtained from Dr. Robin Ketteler (Department of Human Medicine, Medical School Berlin)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybrene Infection / Transfection Reagent</td>
			<td>Merck</td>
			<td>TR-1003-G</td>
			<td>polybrene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin dihydrochloride, 98%, Thermo Scientific Chemicals</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>J61278.ME</td>
			<td>Puromycin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tecan Freedom EVO 200 robot</td>
			<td>Tecan</td>
			<td></td>
			<td>liquid handling robotic platform</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent Roche</td>
			<td>Merck</td>
			<td>6366244001</td>
			<td>DNA transfection reagent</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cell-based drug screening for inhibitors of autophagy related 4b cysteine peptidase

Evidências crescentes têm mostrado que o alto fluxo autofágico está relacionado à progressão tumoral e à resistência à terapia do câncer. A dosagem de proteínas individuais de autofagia é um pré-requisito para estratégias terapêuticas direcionadas a essa via. Demonstrou-se que a inibição da protease autofágica ATG4B aumenta a sobrevida global, sugerindo que a ATG4B pode ser um potencial alvo de drogas para a terapia do câncer. Nosso laboratório desenvolveu um ensaio seletivo baseado em luciferase para monitorar a atividade de ATG4B em células. Para este ensaio, o substrato de ATG4B, LC3B, é marcado no término C com uma luciferase secretável do copépode marinho Gaussia princeps (GLUC). Este repórter está ligado ao citoesqueleto da actina, mantendo-o assim no citoplasma das células quando tido. A clivagem mediada por ATG4B resulta na liberação de GLUC por secreção não convencional, que pode ser monitorada pela coleta de sobrenadantes de cultura celular como um correlato da atividade celular de ATG4B. Este artigo apresenta a adaptação deste ensaio baseado em luciferase para triagem automatizada de alto rendimento. Descrevemos o fluxo de trabalho e a otimização para uma análise exemplar de alto rendimento da atividade ATG4B celular.

Autophagy is a conserved metabolic process that allows cells to keep intracellular homeostasis and respond to stress by degrading aged, defective, or unnecessary cellular contents via the lysosomes1,2,3. Under some pathophysiologic conditions, this process acts as a crucial cellular response to nutrient and oxygen deprivation, resulting in recycled nutrients and lipids, allowing the cells to adapt to their metabolic needs2,3,4. Autophagy has also been identified as a cellular stress response related to several diseases, such as neurodegenerative disorders, pathogen infection, and various types of cancer. The function of autophagy in cancer is complex and dependent on the type, stage, and status of the tumor. It can suppress tumorigenesis through autophagic degradation of damaged cells, but can also promote the survival of advanced tumors by improving cell survival during stressful conditions, such as hypoxia, nutrient deprivation, and cytotoxic damage2,4,5,6.
Several studies have shown that autophagy inhibition provides a benefit as an anticancer strategy. Thus, the inhibition of critical steps, such as autophagosome formation or its fusion with the lysosome, could be an effective method for cancer control2,4,5,6. Growing evidence has shown that ATG4B is involved in certain pathological conditions, and it has gained attention as a potential anticancer target2,3,4. For instance, it was observed that colorectal cancer cells and human epidermal growth factor receptor 2 (HER2)-positive breast cancer cells had significantly higher ATG4B expression levels than adjacent normal cells2,4. In prostate cancer cells, inhibition of ATG4B resulted in a cell line-specific susceptibility to chemotherapy and radiotherapy7. Recently, strong evidence has emerged that pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) is particularly vulnerable to ATG4B inhibition. For instance, in a genetically engineered mouse model, it was shown that intermittent loss of ATG4B function reduces PDAC tumor growth and increases survival3,4. Overall, ATG4B is highly overexpressed in some cancer types, is related to the progression of tumor, and is linked to cancer therapy resistance2,4,8.
The ATG4 cysteine proteases in mammals have four family members, ATG4A-ATG4D. These proteins exhibit some target selectivity toward the LC3/GABARAP (ATG8) family of proteins9,10,11 and may have additional functions not linked to their protease activity12,13. Furthermore, ATG4 functions in regulating a novel type of post-translational modification, the ATG8-ylation of proteins11,12. While ATG4B and its main substrate LC3B are the most widely studied, a picture is emerging that suggests a complex role for each subfamily member in the regulation of autophagic and non-autophagic processes. This is further corroborated by a complex network of post-translational modifications that regulate ATG4B activity via phosphorylation, acetylation, glycosylation, and nitrosylation9,10,11,12,13.
Several known ATG4B inhibitors have been published2,4,14,15. While these are suitable as research tools, their pharmacodynamic profile, selectivity, or potency have yet precluded them from development as preclinical candidates4,16. Overall, there is an urgent need to identify more potent and selective compounds. Often, the compounds are good biochemical inhibitors of protein function, yet their efficacy in cell-based assays is poor. There are multiple assays to monitor ATG4B activity, including biochemical methods and cell-based assays4. We have previously developed a simple, luminescence-based, high-throughput assay for monitoring ATG4B activity in cells8,17. This assay utilizes a luciferase protein from Gaussia princeps (GLUC) that is stable and active in the extracellular milieu and can be inducibly released from cells in response to ATG4B proteolytic activity18,19.
In this reporter construct, dNGLUC is linked to the actin cytoskeleton of cells. A protease-specific linker can be introduced between the &#946;-actin anchor and dNGLUC, turning the secretion dependent on cleavage of the linker. We used the full-length open reading frame of LC3B between &#946;-actin and dNGLUC, to be able to monitor LC3B cleavage17,18,19. Although the secretion mechanism of dNGLUC is poorly understood, it is specific for monitoring ATG4B activity, does not depend on overall autophagy as it occurs in ATG5 knockout cells, and is mediated by non-conventional mechanisms that do not require a classical signal peptide4,18,19. We have successfully used this reporter to screen small molecules and siRNA libraries, and have identified novel regulators of ATG4B activity, such as the Akt protein kinases8. This paper describes a detailed protocol for the use of this luciferase reporter in a semi-automated, high-throughput screening format.

Author Spotlight: A Selective Luciferase-Based Assay for Monitoring ATG4B 27 Activity in Cells 

Triagem de Drogas Baseadas em Células para Inibidores da Autofagia 4B Cisteína Peptidase Relacionada

Em uma publicação anterior8, usamos com sucesso este ensaio para selecionar pequenas bibliotecas de moléculas e siRNA e identificamos novos reguladores de ATG4B. Aqui, descrevemos o protocolo e os resultados representativos deste repórter de luciferase em um formato de triagem semi-automatizado e de alto rendimento. A Figura 8 mostra um exemplo da análise dos dados brutos tanto para os núcleos celulares quanto para a luminescência. Um resultado típico de uma m...

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Aqui, descrevemos um protocolo detalhado para o uso de um ensaio de repórter baseado em luciferase em um formato de triagem semi-automatizado e de alto rendimento.

Growing evidence has shown that high autophagic flux is related to tumor progression and cancer therapy resistance. Assaying individual autophagy proteins ...

O principal objetivo da pesquisa em meu laboratório é entender a regulação da autofagia e, em particular, da proteína cisteína ATG4 e usar esse conhecimento para desenvolver inibidores de pequenas moléculas que visam essa via em particular para doenças como o câncer de pâncreas. Usamos tecnologias de triagem de alto conteúdo e alto rendimento para identificar alvos de drogas, bem como candidatos a medicamentos, e nos concentramos na família de proteases de cisteína ATG4 porque achamos que é um alvo de drogas muito bom para várias formas de câncer. Temos estudado os membros da família ATG4 há algum tempo.Fizemos descobertas significativas sobre a disfunção dessa família de proteínas e células. Também identificamos novos mecanismos pós-traducionais de regulação dos membros da família ATG4 e atualmente estamos desenvolvendo inibidores de pequenas moléculas e também ativadores das famílias ATG4 para doenças como câncer e neurodegeneração. Não há muitos ensaios para monitorar a atividade da protease ATG4 em células.Então, fomos um dos primeiros a desenvolver um ensaio baseado em luciferase para monitorar essa atividade. E nosso ensaio é bastante incomum porque usa segredo, digamos frase, portanto, não precisamos licenciar as células e podemos adaptar esse protocolo facilmente a métodos de triagem de alto rendimento e automação de laboratório. Temos nos concentrado na protease da proteína ATG4 B há algum tempo.Geramos linhagens celulares nocaute dos membros da família ATG4. Identificamos novos mecanismos de regulação pós-traducional do ATG4 e, finalmente, também identificamos vários novos compostos de pequenas moléculas que poderiam inibir e até ativar a protease ATG4 B. No futuro, gostaríamos de continuar nosso trabalho nos membros da família ATG4.Achamos que é muita coisa que é atualmente desconhecida e ainda precisa ser descoberta. Por exemplo, como essas proteínas regulam a autofagia em neurônios atualmente não é completamente compreendido. Também gostaríamos de focar nosso trabalho na validação desses compostos de pequenas moléculas que identificamos e potencialmente usar ativadores em doenças neurodegenerativas.