Name: dual immunofluorescence of &#947;h2ax and 53bp1 in human peripheral lymphocytes
Uploaded: 2023-07-14T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Dual Immunofluorescence of Î³H2AX and 53BP1 in Human Peripheral Lymphocytes at JoVE.com

Wir danken den Vollblutspendern und dem gesamten Gesundheitspersonal, das die Blutproben entnommen hat.

Die Studie wurde von der Ethikkommission der Universität Pisa genehmigt, und von jedem Spender wurde eine informierte und unterschriebene Zustimmung eingeholt.
1. Bildung von γH2AX- und 53BP1-Foci
<ol><li>Probenvorbereitung und erbgutverändernde Behandlung<ol><li>Entnahme von Vollblutproben durch Venenpunktion von gesunden erwachsenen Personen in Blutentnahmeröhrchen (z. B. Vacutainer), die Lithiumheparin als Antikoagulans enthalten.</li>
		<li>Um eine ordnungsg...

<ol>
	<li>Chatterjee, N., Walker, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+DNA+damage,+repair+and+mutagenesis.">Mechanisms of DNA damage, repair and mutagenesis.</a> Environmental and Molecular Mutagenesis. 58 (5), 235-263 (2017).</li><li>Aleksandrov, R., Hristova, R., Stoynov, S., Gospodinov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chromatin+response+to+double-strand+DNA+breaks+and+their+repair.">The chromatin response to double-strand DNA breaks and their repair.</a> Cells. 9 (8), 1853 (2020).</li><li>Jackson, S. P., Bartek, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+DNA-damage+response+in+human+biology+and+disease.">The DNA-damage response in human biology and disease.</a> Nature. 461 (7267), 1071-1078 (2009).</li><li>Dickey, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=H2AX:+functional+roles+and+potential+applications.">H2AX: functional roles and potential applications.</a> Chromosoma. 118 (6), 683-692 (2009).</li><li>Her, J., Bunting, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+cells+ensure+correct+repair+of+DNA+double-strand+break.">How cells ensure correct repair of DNA double-strand break.</a> Journal of Biological Chemistry, Thematic Minireview. 293 (27), 10502-10511 (2018).</li><li>Kuo, L. K., Yang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#947;-H2AX+-+A+novel+biomarker+for+DNA+double-strand+breaks.">&#947;-H2AX - A novel biomarker for DNA double-strand breaks.</a> In Vivo. 22 (3), 305-310 (2008).</li><li>B&#225;rtov&#225;, E., Legartova, S., Dundr, M., Such&#225;nkov&#225;, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+of+the+53BP1+protein+in+genome+protection:+structural+and+functional+characteristics+of+53BP1-dependent+DNA+repair.">A role of the 53BP1 protein in genome protection: structural and functional characteristics of 53BP1-dependent DNA repair.</a> Aging. 11 (8), 2488-2511 (2019).</li><li>Popp, H. D., Brendel, S., Hofman, W., Fabarius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunofluorescence+microscopy+of+&#947;H2AX+and+53BP1+for+analyzing+the+formation+and+repair+of+DNA+double-strand+breaks.">Immunofluorescence microscopy of &#947;H2AX and 53BP1 for analyzing the formation and repair of DNA double-strand breaks.</a> Journal of Visualized Experiments. (129), 56617 (2017).</li><li>Jezkova, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Particles+with+similar+LET+values+generate+DNA+breaks+of+different+complexity+and+reparability:+a+high-resolution+microscopy+analysis+of+&#947;H2AX/53BP1+foci.">Particles with similar LET values generate DNA breaks of different complexity and reparability: a high-resolution microscopy analysis of &#947;H2AX/53BP1 foci.</a> Nanoscale. 10, 1162-1179 (2018).</li><li>Scarpato, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+of+nuclear+phosphorylation+(&#947;-H2AX)+in+human+lymphocytes+treated+in+vitro+with+UVB,+bleomycin+and+mitomycin+C.">Kinetics of nuclear phosphorylation (&#947;-H2AX) in human lymphocytes treated in vitro with UVB, bleomycin and mitomycin C.</a> Mutagenesis. 28 (4), 465-473 (2013).</li><li>Im, K., Mareninov, S., Diaz, M. F. P., Yong, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+introduction+to+performing+immunofluorescence+staining.">An introduction to performing immunofluorescence staining.</a> Methods in Molecular Biology. 1897, 299-311 (2019).</li><li>Sanderson, M. J., Smith, I., Parker, I., Bootman, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fluorescence microscopy. 10, (2014).</li><li>Jamur, M. C., Oliver, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+fixatives+for+immunostaining.">Cell fixatives for immunostaining.</a> Methods in Molecular Biology. , 55-61 (2010).</li><li>Jamur, M. C., Oliver, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Permeabilization+of+the+cell+membrane.">Permeabilization of the cell membrane.</a> Methods in Molecular Biology. 588, 63-66 (2010).</li><li>Hecht, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bleomycin:+New+perspectives+on+the+mechanism+of+action.">Bleomycin: New perspectives on the mechanism of action.</a> Journal of Natural Products. 63, 158-168 (2000).</li><li>Fei, P., El-Deiry, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P53+and+radiation+responses.">P53 and radiation responses.</a> Oncogene. 22, 5774-5783 (2003).</li><li>Mahaney, B. L., Meek, K., Lees-Miller, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repair+of+ionizing+radiation-induced+DNA+double-strand+breaks+by+non-homologous+end-joining.">Repair of ionizing radiation-induced DNA double-strand breaks by non-homologous end-joining.</a> Biochemical Journal. 417 (3), 639-650 (2009).</li><li>Palla, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gamma-H2AX:+Can+it+be+established+as+a+classical+cancer+prognostic+factor.">Gamma-H2AX: Can it be established as a classical cancer prognostic factor.</a> Tumor Biology. 39 (3), 1010428317695931 (2017).</li><li>Markov&#224;, E., Hillert, L., Malmgren, L., Persson, B. R. R., Belyaev, I. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microwaves+from+GSM+mobile+telephones+affect+53BP1+and+gamma-H2AX+foci+in+human+lymphocytes+from+hypersensitive+and+healthy+persons.">Microwaves from GSM mobile telephones affect 53BP1 and gamma-H2AX foci in human lymphocytes from hypersensitive and healthy persons.</a> Environmental Health Perspectives. 113 (9), 1172-1177 (2005).</li><li>Scarpato, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+damage+in+peripheral+lymphocytes+of+obese+and+overweight+Italian+children+as+evaluated+by+the+&#947;-H2AX+focus+assay+and+micronucleus+test.">Nuclear damage in peripheral lymphocytes of obese and overweight Italian children as evaluated by the &#947;-H2AX focus assay and micronucleus test.</a> The FASEB Journal. 25 (2), 685-693 (2018).</li><li>Shanbhag, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+neuronal+accumulation+of+DNA+double-strand+breaks+in+Alzheimer's+disease.">Early neuronal accumulation of DNA double-strand breaks in Alzheimer's disease.</a> Acta Neuropathologica Communication. 7 (1), 77 (2019).</li><li>Lassmann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+formation+of+gamma-H2AX+and+53BP1+DNA+repair+foci+in+blood+cells+after+radioiodine+therapy+of+differentiated+thyroid+cancer.">In vivo formation of gamma-H2AX and 53BP1 DNA repair foci in blood cells after radioiodine therapy of differentiated thyroid cancer.</a> Journal of Nuclear Medicine. 51 (8), 1318-1325 (2010).</li><li>Derlin, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+&#947;-H2AX+and+53BP1+foci+in+peripheral+blood+lymphocytes+to+predict+subclinical+hematotoxicity+and+response+in+somatostatin+receptor-targeted+radionuclide+therapy+for+advanced+gastroenteropancreatic+neuroendocrine+tumors.">Assessment of &#947;-H2AX and 53BP1 foci in peripheral blood lymphocytes to predict subclinical hematotoxicity and response in somatostatin receptor-targeted radionuclide therapy for advanced gastroenteropancreatic neuroendocrine tumors.</a> Cancers (Basel). 13 (7), 1516 (2021).</li><li>Djuzenova, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radiosensitivity+in+breast+cancer+assessed+by+the+histone+&#947;-H2AX+and+53BP1+foci.">Radiosensitivity in breast cancer assessed by the histone &#947;-H2AX and 53BP1 foci.</a> Radiation Oncology. 24, 8-98 (2013).</li><li>Atkinson, J., Bezak, E., Kempson, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+DNA+double-strand+breaks+-+are+we+there+yet.">Imaging DNA double-strand breaks - are we there yet.</a> Nature Reviews in Molecular Cell Biology. 23, 579-580 (2022).</li></ol>

Die Immunfluoreszenzanalyse von γH2AX- und 53BP1-Foci ist eine geeignete Methode zur Beurteilung genomischer Schäden in Interphasenkernen eines Zellsystems. Dieses Verfahren weist mehrere kritische Punkte auf, die das Ergebnis der Experimente beeinflussen können, vor allem die bei der Fixierung und Permeabilisierung verwendeten Wirkstoffe, die Art der Antikörper und ihre Verdünnungsfaktoren sowie die Konzentration des Mutagens.
Die Aufrechterhaltung der Proteinintegrität ist von grundleg...

DNA-Schäden werden kontinuierlich durch Substanzen induziert, die endogen sein können, wie z. B. ROS, die durch den zellulären oxidativen Stoffwechsel erzeugt werden, oder durch exogene, sowohl chemische als auch physikalische Stoffe1. Zu den schädlichsten Läsionen gehören Doppelstrangbrüche (DSBs), die eine grundlegende Rolle bei der genomischen Instabilität spielen, da sie Chromosomenaberrationen verursachen, die wiederum den Prozess der Krebsentstehung in Gang setzen können. Auf diese Weise werden Zellen mit komplexen und effizienten Mechanismen der Reparatur von DSBs ausgestattet2.
Wenn ein DSB auftritt, löst die Zelle die DNA-Schadensantwort (DDR) aus, bei der zusammen mit dem MRE11/RAD50/NBS1-Komplex ATM- oder ATR-Kinasen rekrutiert werden, um andere Proteine zu aktivieren, die den Zellzyklus verlangsamen oder stoppen3. Ein wesentliches Ziel dieser Kinasen ist das Histon H2AX, das auf Ser-139 innerhalb weniger Megabasen aus den DSBs phosphoryliert ist (nämlich γH2AX), wodurch die Rekrutierung verschiedener Reparaturfaktoren wie u.a. BRCA1 und p53-bindendes Protein 1 (53BP1)3 ermöglicht wird. Später wird ein Weg zwischen homologer Rekombination (HR), nicht-homologem Endverknüpfen (NHEJ) oder Single-Strang-Annealing (SSA) ausgelöst, um die DSBs zu reparieren 4,5. Daher ist 53BP1 an der Wahl zwischen HR und NHEJ beteiligt und fördert hauptsächlich die Aktivierung von NHEJ anstelle von HR6. Darüber hinaus können sowohl die phosphorylierte Form des H2AX-Histons als auch von 53BP1 Foci an den Stellen von DSBs bilden. Da diese Foci so lange bestehen bleiben, bis die Integrität des Doppelstrangs wiederhergestellt ist, wird die Beurteilung des Auftretens/Verschwindens von γH2AX- oder 53BP1-Foci innerhalb eines Zeitintervalls als nützliche Methode angesehen, um das Auftreten und die Reparatur von DSBs in einem Zellsystem zu beurteilen 6,7. Da jedoch nach den oben beschriebenen molekularen Prozessen davon auszugehen ist, dass γH2AX- und 53BP1-Foci während DDR 8,9 in der Nähe der DSBs kolokalisiert werden, kann es sinnvoll sein, gleichzeitig das Vorhandensein dieser Marker in einer dualen Immunfluoreszenz nachzuweisen.
Ziel dieses Manuskripts war es daher, die Eignung der simultanen Quantifizierung von γH2AX- und 53BP1-Foci zu evaluieren, um die genomische Schädigung zu untersuchen, die in humanen peripheren Lymphozyten durch den radiomimetischen Wirkstoff Bleomycin induziert wird. Mit der gleichen Methodik versuchten wir auch, die Reparaturkinetik von Bleomycin-induzierten DSBs gemäß einem zuvor aufgebauten experimentellen Verfahren10 zu beschreiben.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>AlexaFluor 568 goat anti-mouse IgG (&#947;1)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21124</td>
			<td>53BP1 secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleoprim</td>
			<td>Sanofi</td>
			<td></td>
			<td>bleomycin sulfate (mutagen)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin solution 100X</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ECB3001D</td>
			<td>antibiotics for culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 10X</td>
			<td>Termofisher</td>
			<td>14200075</td>
			<td>Phosphate-buffered saline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>EC20180L</td>
			<td>Fetal Bovine Serum for immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit IgG (H+L) DyLight 488 Coniugated</td>
			<td>Termofisher</td>
			<td>#35552</td>
			<td>&#947;H2AX secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-53BP1 monoclonal antibody</td>
			<td>Merck</td>
			<td>MAB 3802</td>
			<td>53BP1 primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labophot 2</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Fluorescence microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P-histone H2AX (Ser139) rabbit antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>#2577</td>
			<td>&#947;H2AX primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phytohemoagglutinin</td>
			<td>Termofisher</td>
			<td>R30852801</td>
			<td>component of culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong gold antifade reagent with DAPI</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>#8961</td>
			<td>Antifade solution with DAPI for counterstaining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ECB9006L</td>
			<td>Culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T9284</td>
			<td>Nonionic detergent for permeabilization</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dual immunofluorescence of &#947;h2ax and 53bp1 in human peripheral lymphocytes

Doppelstrangbrüche (DSBs) sind eine der schwersten Läsionen, die in Zellkernen auftreten können, und wenn sie nicht repariert werden, können sie zu schweren Folgen, einschließlich Krebs, führen. Die Zelle ist daher mit komplexen Mechanismen zur Reparatur von DSBs ausgestattet, und diese Signalwege beinhalten Histon H2AX in seiner phosphorylierten Form an Ser-139 (nämlich γH2AX) und das p53-bindende Protein 1 (53BP1). Da beide Proteine an den Stellen von DSBs Herde bilden können, wird die Identifizierung dieser Marker als geeignete Methode angesehen, um beide DSBs und ihre Reparaturkinetik zu untersuchen. Entsprechend den molekularen Prozessen, die zur Bildung von γH2AX- und 53BP1-Foci führen, könnte es sinnvoller sein, ihre Kolokalisation in der Nähe der DSBs zu untersuchen, um einen alternativen Ansatz zu etablieren, der die Quantifizierung von DSBs durch die gleichzeitige Detektion von zwei DNA-Schadensmarkern ermöglicht. Daher zielt dieses Protokoll darauf ab, die genomische Schädigung in humanen Lymphozyten durch den radiomimetischen Wirkstoff Bleomycin durch die Anwesenheit von γH2AX- und 53BP1-Foci in einer dualen Immunfluoreszenz zu untersuchen. Mit dieser Methodik haben wir auch die Variation in der Anzahl der γH2AX- und 53BP1-Foci im Laufe der Zeit beschrieben, als vorläufigen Versuch, die Reparaturkinetik von Bleomycin-induzierten DSBs zu untersuchen.

Die durch die fluoreszenzmikroskopische Analyse peripherer Lymphozyten gewonnenen Daten ermöglichen es uns, drei Hauptaspekte zu bewerten: die Wirksamkeit der Bleomycin-Behandlung bei der Erhöhung der Anzahl der γH2AX- und 53BP1-Foci (und damit der DSBs) aufgrund ihrer mutagenen Wirkung, das Ausmaß, in dem beide Foci am Ort der DSBs kolokalisiert sind, und der zeitliche Verlauf von γH2AX- und 53BP1-Foci, um die Reparaturkinetik von Bleomycin-induzierten DSBs abzugrenzen. Erwartungsgemäß wurde eine sehr höhere Hä...

Watch this Scientific Journal Video about Dual Immunofluorescence of Î³H2AX and 53BP1 in Human Peripheral Lymphocytes at JoVE.com

Dual Immunofluorescence of &#947;H2AX and 53BP1 in Human Peripheral Lymphocytes

Dieses Protokoll stellt eine Methode zur Beurteilung der Bildung und Reparatur von DNA-Doppelstrangbrüchen durch den gleichzeitigen Nachweis von γH2AX- und 53BP1-Foci in Interphasenkernen von Bleomycin-behandelten humanen peripheren Lymphozyten dar.

Duale Immunfluoreszenz von γH2AX und 53BP1 in humanen peripheren Lymphozyten

Double strand breaks (DSBs) are one of the most severe lesions that can occur in cell nuclei, and, if not repaired, they can lead to severe outcomes, ...

Das Ziel dieses Manuskripts war es, die Eignung der simultanen Quantifizierung von Gamma H2AX und 53BP1 Foci zu evaluieren, um die genomische Schädigung zu beurteilen, die in humanen peripheren Lymphozyten durch Bleomycin induziert wird. Mehrere Faktoren können Doppelstrangbrüche verursachen. Die Zellen verfügen somit über mehrere Reparaturmechanismen, an denen sowohl Gamma H2AX als auch das 53 Binding Protein 1 beteiligt sind, die in der Nähe des Doppelstrangbruchs kolokalisieren können.Nach der Entnahme von Vollblutproben werden 300 Mikroliter der Probe in ein Röhrchen mit 4,7 Millilitern Komplettmedium gegeben. Fügen Sie dann fünf Mikrogramm pro Milliliter Bleomycinsulfat-Endkonzentration hinzu. Richten Sie für jede Probe eine Negativkontrolle ein.Stecken Sie das Röhrchen für zwei Stunden in einen Thermostat bei 37 Grad Celsius. Zentrifugieren Sie die Proben bei 540 G für fünf Minuten. Fügen Sie dann fünf Milliliter hypotone Lösung zum Pellet hinzu.Fügen Sie dann 400 Mikroliter präfixative Lösung hinzu, um eine Hämolyse zu bewirken. Zentrifugieren Sie die Proben fünf Minuten lang bei 540 g und resuspendieren Sie dann das Pellet in fünf Millilitern Methanol bei Raumtemperatur für mindestens 30 Minuten, um die Zellen zu fixieren. Zentrifugieren Sie die Proben fünf Minuten lang bei 540 g und resuspendieren Sie das Pellet dann in fünf Millilitern Fixierlösung.Wiederholen Sie diesen Schritt noch einmal. Zentrifugieren Sie erneut fünf Minuten lang bei 540 g und saugen Sie dann den Überstand an, so dass genügend Lösung übrig bleibt, um das Pellet zu resuspendieren. Lassen Sie das resuspendierte Zellpellet auf die Objektträger fallen.Bereiten Sie die beiden Lösungen vor, die die in Blockierlösung gelösten Anti-Gamma-H2AX- und Anti-53BP1-Primärantikörper enthalten. Waschen Sie dann die Objektträger zweimal in PBS 1X. Bewahren Sie die Objektträger dann 30 Minuten lang in Blockierlösung auf.Fügen Sie jedem Objektträger 10 Mikroliter jeder der beiden Lösungen hinzu, die die in der Blockierungslösung gelösten Primärantikörper enthalten. Decken Sie die Dias mit Parafilm ab. Über Nacht bei vier Grad Celsius inkubieren.Führen Sie nach der Inkubation drei Waschgänge in PBS 1X für fünf Minuten durch. Bereiten Sie die beiden Lösungen vor, die die in Blockierlösung gelösten Sekundärantikörper DyLight 488 und Alexa Fluor 568 enthalten. Fügen Sie dann zu jedem Objektträger 10 Mikroliter jeder der beiden Lösungen hinzu, die die in Blockierlösung gelösten Sekundärantikörper enthalten.Decken Sie die Objektträger mit Parafilm ab und inkubieren Sie sie zwei Stunden lang bei Raumtemperatur. Nach dieser zweiten Inkubation führen Sie drei Waschgänge in PBS 1X für fünf Minuten durch. Fügen Sie vor dem Zusammenbau 2,5 Mikroliter Antifade-Lösung mit DAPI auf die Deckgläser hinzu, um der Verfärbung der Kerne entgegenzuwirken.Um die Herdkinetik beurteilen zu können, ist die Vorgehensweise die gleiche wie jetzt beschrieben. Die letzte Phase ist die Beobachtung und Quantifizierung der Herde. Humane Lymphozyten ohne Gamma-H2AX- und 53BP1-Herd sind in A, in B und in C sind humane Lymphozyten mit unterschiedlichen Mengen an Gamma-H2AX- und 53BP1-Foci dargestellt.Es wird eine geringe Kolokalisation der Herde beobachtet. Erwartungsgemäß wird eine sehr höhere Häufigkeit von Gamma H2AX- und 53BP1-Foci zwischen unbehandelten unbehandelten Zellen beobachtet. Auch in der Anzahl der Brennpunkte der beiden Marker ist ein großer Unterschied zu beobachten.Der zeitliche Verlauf von Gamma H2AX und 53BP1 Foci über die Zeit zeigte ein unterschiedliches Verhalten, obwohl sie zur gleichen Funktion beitragen. Die Gamma-H2AX- und 53BP1-Foci-Analyse ist in der Lage, die zelluläre Reaktion entweder in Expositions- oder pathologischen Kontexten zu bewerten. Die duale Immunfluoreszenz von Gamma H2AX und 53BP1 kann jedoch dazu führen, dass die tatsächliche Häufigkeit des Ereignisses unterschätzt wird.

Research

JoVE Journal

Genetics

siRNA Transfection and EMSA Analyses on Freshly Isolated Human Villous Cytotrophoblasts

siRNA-Transfektion und EMSA-Analysen auf frisch isolierten menschlichen Villöse Cytotrophoblasten

Human primary villous cytotrophoblasts are a very useful source of primary cells to study placental functions and regulatory mechanisms, and to comprehend ...

Forschung

Genetik

Parallel Measurement of Circadian Clock Gene Expression and Hormone Secretion in Human Primary Cell Cultures

Parallel Messung von Circadian Clock Genexpression und Hormon-Sekretion in primären humanen Zellkulturen

Circadian clocks are functional in all light-sensitive organisms, allowing for an adaptation to the external world by anticipating daily environmental ...

Analysis of Cap-binding Proteins in Human Cells Exposed to Physiological Oxygen Conditions

Analyse von Cap-bindende Proteine ​​in menschlichen Zellen zu Physiologische Sauerstoffbedingungen ausgesetzt

Translational control is a focal point of gene regulation, especially during periods of cellular stress. Cap-dependent translation via the eIF4F complex ...

Genome Editing and Directed Differentiation of hPSCs for Interrogating Lineage Determinants in Human Pancreatic Development

Genome Editing und gerichteten Differenzierung von hPSCs zur Abfrage Lineage Bestimmungsfaktoren im Bereich Human Pancreatic Entwicklung

Interrogating gene function in self-renewing or differentiating human pluripotent stem cells (hPSCs) offers a valuable platform towards understanding ...

Mapping Genome-wide Accessible Chromatin in Primary Human T Lymphocytes by ATAC-Seq

Mapping genomweite zugänglich Chromatin in primären menschlichen T-Lymphozyten durch ATAC-Seq

Assay for Transposase-Accessible Chromatin with high-throughput sequencing (ATAC-seq) is a method used for the identification of open (accessible) regions ...

Determining Genome-wide Transcript Decay Rates in Proliferating and Quiescent Human Fibroblasts

Bestimmung genomweite Transkript Verfall Tarife im wuchernden und ruhenden menschlichen Fibroblasten

Quiescence is a temporary, reversible state in which cells have ceased cell division, but retain the capacity to proliferate. Multiple studies, including ...

ATAC-seq Assay with Low Mitochondrial DNA Contamination from Primary Human CD4+ T Lymphocytes

ATAC-Seq-Assay mit niedrigen mitochondriale DNA Kontamination von primären menschlichen CD4 + T-Lymphozyten

ATAC-seq has become a widely used methodology in the study of epigenetics due to its rapid and simple approach to mapping genome-wide accessible ...

Navigating MARRVEL, a Web-Based Tool that Integrates Human Genomics and Model Organism Genetics Information

Navigieren in MARRVEL, einem webbasierten Tool, das Informationen zur Humangenomik und Modellgenetik integriert

Through whole-exome/genome sequencing, human geneticists identify rare variants that segregate with disease phenotypes. To assess if a specific variant is ...

In Vivo Functional Study of Disease-associated Rare Human Variants Using Drosophila

In Vivo Functional Study of Disease-associated Rare Human Variants Using Drosophila

In Vivo Funktionelle Studie von krankheitsassoziierten seltenen menschlichen Varianten mit Drosophila

Advances in sequencing technology have made whole-genome and whole-exome datasets more accessible for both clinical diagnosis and cutting-edge human ...

Generation of Defined Genomic Modifications Using CRISPR-CAS9 in Human Pluripotent Stem Cells

Generierung definierter genomischer Modifikationen mit CRISPR-CAS9 in humanen pluripotenten Stammzellen

Human pluripotent stem cells offer a powerful system to study gene function and model specific mutations relevant to disease. The generation of precise ...