Name: dual immunofluorescence of &#947;h2ax and 53bp1 in human peripheral lymphocytes
Uploaded: 2023-07-14T12:00:00
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हम पूरे रक्तदाताओं और सभी स्वास्थ्य कर्मियों के आभारी हैं जिन्होंने रक्त के नमूने लिए।

अध्ययन को पीसा विश्वविद्यालय की नैतिक समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था, और प्रत्येक दाता से सूचित और हस्ताक्षरित सहमति प्राप्त की गई थी।
1. 3H2AX और 53BP1 फॉसी का गठन
<ol><li>नमूने और म्यूटाजेनि?...

<ol>
	<li>Chatterjee, N., Walker, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+DNA+damage,+repair+and+mutagenesis.">Mechanisms of DNA damage, repair and mutagenesis.</a> Environmental and Molecular Mutagenesis. 58 (5), 235-263 (2017).</li><li>Aleksandrov, R., Hristova, R., Stoynov, S., Gospodinov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chromatin+response+to+double-strand+DNA+breaks+and+their+repair.">The chromatin response to double-strand DNA breaks and their repair.</a> Cells. 9 (8), 1853 (2020).</li><li>Jackson, S. P., Bartek, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+DNA-damage+response+in+human+biology+and+disease.">The DNA-damage response in human biology and disease.</a> Nature. 461 (7267), 1071-1078 (2009).</li><li>Dickey, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=H2AX:+functional+roles+and+potential+applications.">H2AX: functional roles and potential applications.</a> Chromosoma. 118 (6), 683-692 (2009).</li><li>Her, J., Bunting, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+cells+ensure+correct+repair+of+DNA+double-strand+break.">How cells ensure correct repair of DNA double-strand break.</a> Journal of Biological Chemistry, Thematic Minireview. 293 (27), 10502-10511 (2018).</li><li>Kuo, L. 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D., Brendel, S., Hofman, W., Fabarius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunofluorescence+microscopy+of+&#947;H2AX+and+53BP1+for+analyzing+the+formation+and+repair+of+DNA+double-strand+breaks.">Immunofluorescence microscopy of &#947;H2AX and 53BP1 for analyzing the formation and repair of DNA double-strand breaks.</a> Journal of Visualized Experiments. (129), 56617 (2017).</li><li>Jezkova, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Particles+with+similar+LET+values+generate+DNA+breaks+of+different+complexity+and+reparability:+a+high-resolution+microscopy+analysis+of+&#947;H2AX/53BP1+foci.">Particles with similar LET values generate DNA breaks of different complexity and reparability: a high-resolution microscopy analysis of &#947;H2AX/53BP1 foci.</a> Nanoscale. 10, 1162-1179 (2018).</li><li>Scarpato, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+of+nuclear+phosphorylation+(&#947;-H2AX)+in+human+lymphocytes+treated+in+vitro+with+UVB,+bleomycin+and+mitomycin+C.">Kinetics of nuclear phosphorylation (&#947;-H2AX) in human lymphocytes treated in vitro with UVB, bleomycin and mitomycin C.</a> Mutagenesis. 28 (4), 465-473 (2013).</li><li>Im, K., Mareninov, S., Diaz, M. F. P., Yong, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+introduction+to+performing+immunofluorescence+staining.">An introduction to performing immunofluorescence staining.</a> Methods in Molecular Biology. 1897, 299-311 (2019).</li><li>Sanderson, M. J., Smith, I., Parker, I., Bootman, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fluorescence microscopy. 10, (2014).</li><li>Jamur, M. C., Oliver, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+fixatives+for+immunostaining.">Cell fixatives for immunostaining.</a> Methods in Molecular Biology. , 55-61 (2010).</li><li>Jamur, M. C., Oliver, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Permeabilization+of+the+cell+membrane.">Permeabilization of the cell membrane.</a> Methods in Molecular Biology. 588, 63-66 (2010).</li><li>Hecht, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bleomycin:+New+perspectives+on+the+mechanism+of+action.">Bleomycin: New perspectives on the mechanism of action.</a> Journal of Natural Products. 63, 158-168 (2000).</li><li>Fei, P., El-Deiry, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P53+and+radiation+responses.">P53 and radiation responses.</a> Oncogene. 22, 5774-5783 (2003).</li><li>Mahaney, B. L., Meek, K., Lees-Miller, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repair+of+ionizing+radiation-induced+DNA+double-strand+breaks+by+non-homologous+end-joining.">Repair of ionizing radiation-induced DNA double-strand breaks by non-homologous end-joining.</a> Biochemical Journal. 417 (3), 639-650 (2009).</li><li>Palla, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gamma-H2AX:+Can+it+be+established+as+a+classical+cancer+prognostic+factor.">Gamma-H2AX: Can it be established as a classical cancer prognostic factor.</a> Tumor Biology. 39 (3), 1010428317695931 (2017).</li><li>Markov&#224;, E., Hillert, L., Malmgren, L., Persson, B. R. R., Belyaev, I. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microwaves+from+GSM+mobile+telephones+affect+53BP1+and+gamma-H2AX+foci+in+human+lymphocytes+from+hypersensitive+and+healthy+persons.">Microwaves from GSM mobile telephones affect 53BP1 and gamma-H2AX foci in human lymphocytes from hypersensitive and healthy persons.</a> Environmental Health Perspectives. 113 (9), 1172-1177 (2005).</li><li>Scarpato, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+damage+in+peripheral+lymphocytes+of+obese+and+overweight+Italian+children+as+evaluated+by+the+&#947;-H2AX+focus+assay+and+micronucleus+test.">Nuclear damage in peripheral lymphocytes of obese and overweight Italian children as evaluated by the &#947;-H2AX focus assay and micronucleus test.</a> The FASEB Journal. 25 (2), 685-693 (2018).</li><li>Shanbhag, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+neuronal+accumulation+of+DNA+double-strand+breaks+in+Alzheimer's+disease.">Early neuronal accumulation of DNA double-strand breaks in Alzheimer's disease.</a> Acta Neuropathologica Communication. 7 (1), 77 (2019).</li><li>Lassmann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+formation+of+gamma-H2AX+and+53BP1+DNA+repair+foci+in+blood+cells+after+radioiodine+therapy+of+differentiated+thyroid+cancer.">In vivo formation of gamma-H2AX and 53BP1 DNA repair foci in blood cells after radioiodine therapy of differentiated thyroid cancer.</a> Journal of Nuclear Medicine. 51 (8), 1318-1325 (2010).</li><li>Derlin, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+&#947;-H2AX+and+53BP1+foci+in+peripheral+blood+lymphocytes+to+predict+subclinical+hematotoxicity+and+response+in+somatostatin+receptor-targeted+radionuclide+therapy+for+advanced+gastroenteropancreatic+neuroendocrine+tumors.">Assessment of &#947;-H2AX and 53BP1 foci in peripheral blood lymphocytes to predict subclinical hematotoxicity and response in somatostatin receptor-targeted radionuclide therapy for advanced gastroenteropancreatic neuroendocrine tumors.</a> Cancers (Basel). 13 (7), 1516 (2021).</li><li>Djuzenova, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radiosensitivity+in+breast+cancer+assessed+by+the+histone+&#947;-H2AX+and+53BP1+foci.">Radiosensitivity in breast cancer assessed by the histone &#947;-H2AX and 53BP1 foci.</a> Radiation Oncology. 24, 8-98 (2013).</li><li>Atkinson, J., Bezak, E., Kempson, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+DNA+double-strand+breaks+-+are+we+there+yet.">Imaging DNA double-strand breaks - are we there yet.</a> Nature Reviews in Molecular Cell Biology. 23, 579-580 (2022).</li></ol>

एक सेल सिस्टम के इंटरफेज नाभिक में जीनोमिक क्षति का आकलन करने के लिए एक उपयुक्त विधि है। इस प्रक्रिया में कई महत्वपूर्ण बिंदु हैं जो प्रयोगों के परिणाम को प्रभावित कर सकते हैं, मुख्य रूप से, निर्धारण और...

डीएनए क्षति लगातार एजेंटों द्वारा प्रेरित होती है जो अंतर्जात हो सकते हैं, जैसे कि सेलुलर ऑक्सीडेटिव चयापचय द्वारा उत्पन्न आरओएस, या बहिर्जात, रसायन और भौतिकदोनों 1। सबसे हानिकारक घावों में, डबल-स्ट्रैंड ब्रेक (डीएसबी) जीनोमिक अस्थिरता में योगदान करने में एक मौलिक भूमिका निभाते हैं, क्योंकि वे क्रोमोसोम विपथन का कारण बनते हैं जो बदले में कार्सिनोजेनेसिस प्रक्रिया शुरू कर सकते हैं। इस प्रकार, कोशिकाओं को डीएसबी मरम्मत के जटिल और कुशल तंत्रप्रदान किए जाते हैं।
जब डीएसबी होता है, तो कोशिका डीएनए क्षति प्रतिक्रिया (डीडीआर) को ट्रिगर करती है, जहां एमआरई 11 / आरएडी 50 / एनबीएस 1 कॉम्प्लेक्स के साथ, एटीएम या एटीआर किनेसेस को अन्य प्रोटीनों को सक्रिय करने के लिए भर्ती किया जाता है जो सेल चक्र3 को धीमा या रोकते हैं। इन किनेसेस का एक आवश्यक लक्ष्य हिस्टोन एच 2 ए एक्स है, जो डीएसबी से कुछ मेगाबेस के भीतर सेर -139 पर फॉस्फोराइलेटेड है (अर्थात् एच 2 एएक्स), जिससे कई मरम्मत कारकों की भर्ती की अनुमति मिलती है, जैसे कि दूसरों के बीच, बीआरसीए 1 और पी 53 बाइंडिंग प्रोटीन 1 (53 बीपी 1)3। बाद में, डीएसबी 4,5 की मरम्मत के लिए होमोलोगस पुनर्संयोजन (एचआर), गैर-होमोलोगस एंड जॉइनिंग (एनएचईजे), या सिंगल-स्ट्रैंड एनीलिंग (एसएसए) के बीच एक मार्ग शुरू किया जाता है। इसलिए, 53BP1 HR या NHEJ के बीच चयन को निर्धारित करने में शामिल है, मुख्य रूप से HR6 के बजाय NHEJ के सक्रियण को बढ़ावा देता है। इसके अलावा, एच 2 ए एक्स हिस्टोन और 53 बीपी 1 के फॉस्फोराइलेटेड रूप दोनों डीएसबी की साइटों पर फॉसी बना सकते हैं। चूंकि ये फॉसी तब तक बनी रहती हैं जब तक कि डबल स्ट्रैंड की अखंडता बहाल नहीं हो जाती है, एक समय अंतराल के भीतर 3H2AX या 53BP1 फॉसी की उपस्थिति / गायब होने का आकलन करना सेल सिस्टम 6,7 में DSB की घटना और मरम्मत का मूल्यांकन करने के लिए एक उपयोगी तरीका माना जाता है। हालांकि, ऊपर वर्णित आणविक प्रक्रियाओं के अनुसार, चूंकि डीडीआर8,9 के दौरान डीएसबी के पास 5एच2एएक्स और 53बीपी1 फॉसी के सह-स्थानीयकरण की उम्मीद है, इसलिए दोहरे इम्यूनोफ्लोरेसेंस में इन मार्करों की उपस्थिति का समवर्ती रूप से पता लगाना उपयोगी हो सकता है।
इस प्रकार, इस पांडुलिपि का उद्देश्य रेडियोमिमेटिक एजेंट ब्लीमाइसिन द्वारा मानव परिधीय लिम्फोसाइटों में प्रेरित जीनोमिक क्षति का आकलन करने के लिए एक साथ परिमाणीकरण की उपयुक्तता का मूल्यांकन करना था। उसी पद्धति का उपयोग करते हुए, हमने पहले से स्थापित प्रयोगात्मक प्रक्रिया10 के अनुसार ब्लीमाइसिन-प्रेरित डीएसबी की मरम्मत कैनेटीक्स को चित्रित करने का भी प्रयास किया।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>AlexaFluor 568 goat anti-mouse IgG (&#947;1)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21124</td>
			<td>53BP1 secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleoprim</td>
			<td>Sanofi</td>
			<td></td>
			<td>bleomycin sulfate (mutagen)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin solution 100X</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ECB3001D</td>
			<td>antibiotics for culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 10X</td>
			<td>Termofisher</td>
			<td>14200075</td>
			<td>Phosphate-buffered saline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>EC20180L</td>
			<td>Fetal Bovine Serum for immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit IgG (H+L) DyLight 488 Coniugated</td>
			<td>Termofisher</td>
			<td>#35552</td>
			<td>&#947;H2AX secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-53BP1 monoclonal antibody</td>
			<td>Merck</td>
			<td>MAB 3802</td>
			<td>53BP1 primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labophot 2</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Fluorescence microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P-histone H2AX (Ser139) rabbit antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>#2577</td>
			<td>&#947;H2AX primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phytohemoagglutinin</td>
			<td>Termofisher</td>
			<td>R30852801</td>
			<td>component of culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong gold antifade reagent with DAPI</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>#8961</td>
			<td>Antifade solution with DAPI for counterstaining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ECB9006L</td>
			<td>Culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T9284</td>
			<td>Nonionic detergent for permeabilization</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dual immunofluorescence of &#947;h2ax and 53bp1 in human peripheral lymphocytes

डबल स्ट्रैंड ब्रेक (डीएसबी) सबसे गंभीर घावों में से एक है जो सेल नाभिक में हो सकता है, और, यदि मरम्मत नहीं की जाती है, तो वे कैंसर सहित गंभीर परिणामों का कारण बन सकते हैं। इसलिए, सेल को डीएसबी की मरम्मत के लिए जटिल तंत्र प्रदान किया जाता है, और इन मार्गों में हिस्टोन एच 2 ए एक्स को सेर -139 (अर्थात् एच 2 एएक्स) और पी 53 बाइंडिंग प्रोटीन 1 (53 बीपी 1) में फॉस्फोराइलेटेड रूप में शामिल किया जाता है। चूंकि दोनों प्रोटीन डीएसबी की साइटों पर फॉसी बना सकते हैं, इन मार्करों की पहचान को डीएसबी और मरम्मत के उनके कैनेटीक्स दोनों का अध्ययन करने के लिए एक उपयुक्त तरीका माना जाता है। आणविक प्रक्रियाओं के अनुसार जो कि H2AX और 53BP1 फॉसी के गठन की ओर ले जाती हैं, एक वैकल्पिक दृष्टिकोण स्थापित करने के लिए DSB के पास उनके सह-स्थानीयकरण की जांच करना अधिक उपयोगी हो सकता है जो दो डीएनए क्षति मार्करों का एक साथ पता लगाकर DSB को निर्धारित करने की अनुमति देता है। इस प्रकार, इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य दोहरे इम्यूनोफ्लोरेसेंस में 3H2AX और 53BP1 फॉसी की उपस्थिति के माध्यम से रेडियोमिमेटिक एजेंट ब्लीमाइसिन द्वारा मानव लिम्फोसाइटों में प्रेरित जीनोमिक क्षति का आकलन करना है। इस पद्धति का उपयोग करते हुए, हमने ब्लीमाइसिन-प्रेरित डीएसबी की मरम्मत कैनेटीक्स का अध्ययन करने के प्रारंभिक प्रयास के रूप में, समय के साथ 3H2AX और 53BP1 फॉसी की संख्या में भिन्नता को भी चित्रित किया।

परिधीय लिम्फोसाइटों के प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप विश्लेषण द्वारा प्राप्त डेटा हमें तीन मुख्य पहलुओं का मूल्यांकन करने की अनुमति देता है: इसके म्यूटाजेनिक प्रभाव के कारण 5एच2एएक्स और 53बीपी1 फॉसी (और इस...

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Dual Immunofluorescence of &#947;H2AX and 53BP1 in Human Peripheral Lymphocytes

यह प्रोटोकॉल ब्लीमाइसिन-उपचारित मानव परिधीय लिम्फोसाइटों के इंटरफेज नाभिक में डीएनए डबल-स्ट्रैंड ब्रेक के गठन और मरम्मत का आकलन करने के लिए एक विधि प्रस्तुत करता है।

मानव परिधीय लिम्फोसाइटों में 53बीपी1 और 1 के दोहरे इम्यूनोफ्लोरेसेंस

Double strand breaks (DSBs) are one of the most severe lesions that can occur in cell nuclei, and, if not repaired, they can lead to severe outcomes, ...

इस पांडुलिपि का उद्देश्य ब्लीमाइसिन द्वारा मानव परिधीय लिम्फोसाइटों में प्रेरित जीनोमिक क्षति का आकलन करने के लिए गामा एच 2 ए एक्स और 53 बीपी 1 फॉसी के एक साथ परिमाणीकरण की उपयुक्तता का मूल्यांकन करना था। कई कारक डबल स्ट्रैंड ब्रेक का कारण बन सकते हैं। इस प्रकार कोशिकाओं को कई मरम्मत तंत्र प्रदान किए जाते हैं, जिसमें गामा एच 2 ए एक्स और 53 बाइंडिंग प्रोटीन 1 दोनों शामिल होते हैं, जो डबल स्ट्रैंड ब्रेक के पास सह-स्थानीयकरण कर सकते हैं।पूरे रक्त के नमूने एकत्र करने के बाद, 4.7 मिलीलीटर पूर्ण माध्यम युक्त ट्यूब में 300 माइक्रोलीटर नमूना जोड़ें। फिर पांच माइक्रोग्राम प्रति मिलीलीटर ब्लीमाइसिन सल्फेट अंतिम एकाग्रता जोड़ें। प्रत्येक नमूने के लिए, एक नकारात्मक नियंत्रण सेट करें।ट्यूब को दो घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर थर्मोस्टेट में रखें। सेंट्रीफ्यूज नमूने पांच मिनट के लिए 540 ग्राम पर। फिर गोली में पांच मिलीलीटर हाइपोटोनिक घोल जोड़ें।फिर हेमोलिसिस का कारण बनने के लिए 400 माइक्रोलीटर प्री फिक्सेटिव समाधान जोड़ें। सेंट्रीफ्यूज नमूने को पांच मिनट के लिए 540 ग्राम पर रखें, फिर कोशिकाओं को ठीक करने के लिए कम से कम 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर मेथनॉल के पांच मिलीलीटर में गोली को फिर से निलंबित करें। सेंट्रीफ्यूज नमूने को पांच मिनट के लिए 540 ग्राम पर रखें, फिर पांच मिलीलीटर फिक्सेटिव घोल में गोली को फिर से निलंबित करें।इस चरण को एक बार और दोहराएं। सेंट्रीफ्यूज फिर से पांच मिनट के लिए 540 जी पर करें, फिर सतह पर तैरने वाले को गोली को फिर से निलंबित करने के लिए पर्याप्त समाधान छोड़ दें। पुन: निलंबित सेल गोली को स्लाइड्स पर छोड़ दें।एंटी-गामा एच 2 ए एक्स और एंटी -53 बीपी 1 प्राथमिक एंटीबॉडी वाले दो समाधान तैयार करें जो ब्लॉकिंग समाधान में घुल जाते हैं। फिर पीबीएस 1 एक्स में स्लाइड को दो बार धोएं। फिर ब्लॉकिंग घोल में 30 मिनट के लिए स्लाइड रखें।ब्लॉकिंग समाधान में घुलने वाले प्राथमिक एंटीबॉडी युक्त दो समाधानों में से प्रत्येक के प्रत्येक स्लाइड में 10 माइक्रोलीटर जोड़ें। स्लाइड्स को पैराफिल्म से कवर करें। रात भर चार डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।इनक्यूबेशन के बाद, पीबीएस 1 एक्स में पांच मिनट के लिए तीन धुलाई करें। ब्लॉकिंग समाधान में घुलने वाले डाइलाइट 488 और एलेक्सा फ्लुर 568 द्वितीयक एंटीबॉडी युक्त दो समाधान तैयार करें। फिर ब्लॉकिंग समाधान में घुलने वाले द्वितीयक एंटीबॉडी युक्त दो समाधानों में से प्रत्येक के प्रत्येक स्लाइड में 10 माइक्रोलीटर जोड़ें।स्लाइड को पैराफिल्म के साथ कवर करें और दो घंटे के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें। इस दूसरे इनक्यूबेशन के बाद, पीबीएस 1 एक्स में पांच मिनट के लिए तीन धुलाई करें। नाभिक को दाग का मुकाबला करने के लिए असेंबली से पहले कवर स्लिप पर डीएपीआई के साथ 2.5 माइक्रोलीटर एंटीफैड घोल जोड़ें।फॉसी गतिज का आकलन करने के लिए, प्रक्रिया वही है जो अब वर्णित है। अंतिम चरण फॉसी का अवलोकन और परिमाणीकरण है। गामा एच 2 ए एक्स और 53 बीपी 1 फॉसी के बिना मानव लिम्फोसाइट्स ए में, बी में दिखाए गए हैं, और सी में, गामा एच 2 ए एक्स और 53 बीपी 1 फॉसी की विभिन्न मात्रा के साथ मानव लिम्फोसाइट्स दिखाए गए हैं।यह फॉसी सह-स्थानीयकरण का निम्न स्तर देखा गया है। जैसा कि अपेक्षित था, अनुपचारित अनुपचारित कोशिकाओं के बीच गामा एच 2 ए एक्स और 53 बीपी 1 फॉसी दोनों की बहुत अधिक आवृत्ति देखी जाती है। इसके अलावा, दो मार्करों के फॉसी की संख्या में एक बड़ा अंतर देखा जाता है।समय के साथ गामा H2AX और 53BP1 फॉसी के समय पाठ्यक्रम ने एक अलग व्यवहार दिखाया, हालांकि वे एक ही कार्य में योगदान करते हैं। गामा एच 2 ए एक्स और 53 बीपी 1 फॉसी विश्लेषण में जोखिम या रोग संबंधी संदर्भों में सेलुलर प्रतिक्रिया का मूल्यांकन करने की क्षमता है। हालांकि, गामा एच 2 ए एक्स और 53 बीपी 1 दोहरी इम्यूनोफ्लोरेसेंस घटना की वास्तविक आवृत्ति को कम कर सकते हैं।

Research

JoVE Journal

Genetics

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जीनोम एडिटिंग और hPSCs की निर्देशित भेदभाव मानव अग्नाशय विकास में वंश अवधारक पूछताछ के लिए

Interrogating gene function in self-renewing or differentiating human pluripotent stem cells (hPSCs) offers a valuable platform towards understanding ...

Mapping Genome-wide Accessible Chromatin in Primary Human T Lymphocytes by ATAC-Seq

मानचित्रण जीनोम-वाइड सुलभ क्रोमेटिन प्राथमिक मानव टी लिम्फोसाइटों में ATAC-Seq द्वारा

Assay for Transposase-Accessible Chromatin with high-throughput sequencing (ATAC-seq) is a method used for the identification of open (accessible) regions ...

Determining Genome-wide Transcript Decay Rates in Proliferating and Quiescent Human Fibroblasts

Proliferating और Quiescent मानव Fibroblasts में जीनोम चौड़ा प्रतिलिपि क्षय दरों का निर्धारण

Quiescence is a temporary, reversible state in which cells have ceased cell division, but retain the capacity to proliferate. Multiple studies, including ...

ATAC-seq Assay with Low Mitochondrial DNA Contamination from Primary Human CD4+ T Lymphocytes

ATAC-seq परख के साथ कम Mitochondrial डीएनए संदूषण प्राथमिक मानव सीडी 4 + टी लिम्फोसाइटों से

ATAC-seq has become a widely used methodology in the study of epigenetics due to its rapid and simple approach to mapping genome-wide accessible ...

Navigating MARRVEL, a Web-Based Tool that Integrates Human Genomics and Model Organism Genetics Information

MARRVEL नेविगेट, एक वेब आधारित उपकरण है कि मानव जीनोमिक्स और मॉडल जीव आनुवंशिकी जानकारी एकीकृत करता है

Through whole-exome/genome sequencing, human geneticists identify rare variants that segregate with disease phenotypes. To assess if a specific variant is ...

In Vivo Functional Study of Disease-associated Rare Human Variants Using Drosophila

In Vivo Functional Study of Disease-associated Rare Human Variants Using Drosophila

रोग से जुड़े दुर्लभ मानव वेरिएंट Drosophila का उपयोग कर के Vivo कार्यात्मक अध्ययन में

Advances in sequencing technology have made whole-genome and whole-exome datasets more accessible for both clinical diagnosis and cutting-edge human ...

Generation of Defined Genomic Modifications Using CRISPR-CAS9 in Human Pluripotent Stem Cells

मानव Pluripotent स्टेम सेल में CRISPR-CAS9 का उपयोग कर परिभाषित जीनोमिक संशोधनों का उत्पादन

Human pluripotent stem cells offer a powerful system to study gene function and model specific mutations relevant to disease. The generation of precise ...