Name: dual immunofluorescence of &#947;h2ax and 53bp1 in human peripheral lymphocytes
Uploaded: 2023-07-14T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Dual Immunofluorescence of Î³H2AX and 53BP1 in Human Peripheral Lymphocytes at JoVE.com

Tam kan bağışçılarına ve kan örneklerini alan tüm sağlık personeline teşekkür ederiz.

Çalışma Pisa Üniversitesi etik kurulu tarafından onaylanmış, her donörden bilgilendirilmiş ve imzalı onam alınmıştır.
1. γH2AX ve 53BP1 odaklarının oluşumu
<ol><li>Numunelerin hazırlanması ve mutajenik tedavi<ol><li>Antikoagülan olarak lityum heparin içeren kan toplama (örneğin, Vacutainer) tüplerinde sağlıklı yetişkin bireylerden venipunktur yoluyla tam kan örnekleri toplayın.</li>
		<li>Uygun kan örneği korumasını garanti etmek i...

<ol>
	<li>Chatterjee, N., Walker, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+DNA+damage,+repair+and+mutagenesis.">Mechanisms of DNA damage, repair and mutagenesis.</a> Environmental and Molecular Mutagenesis. 58 (5), 235-263 (2017).</li><li>Aleksandrov, R., Hristova, R., Stoynov, S., Gospodinov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chromatin+response+to+double-strand+DNA+breaks+and+their+repair.">The chromatin response to double-strand DNA breaks and their repair.</a> Cells. 9 (8), 1853 (2020).</li><li>Jackson, S. P., Bartek, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+DNA-damage+response+in+human+biology+and+disease.">The DNA-damage response in human biology and disease.</a> Nature. 461 (7267), 1071-1078 (2009).</li><li>Dickey, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=H2AX:+functional+roles+and+potential+applications.">H2AX: functional roles and potential applications.</a> Chromosoma. 118 (6), 683-692 (2009).</li><li>Her, J., Bunting, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+cells+ensure+correct+repair+of+DNA+double-strand+break.">How cells ensure correct repair of DNA double-strand break.</a> Journal of Biological Chemistry, Thematic Minireview. 293 (27), 10502-10511 (2018).</li><li>Kuo, L. K., Yang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#947;-H2AX+-+A+novel+biomarker+for+DNA+double-strand+breaks.">&#947;-H2AX - A novel biomarker for DNA double-strand breaks.</a> In Vivo. 22 (3), 305-310 (2008).</li><li>B&#225;rtov&#225;, E., Legartova, S., Dundr, M., Such&#225;nkov&#225;, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+of+the+53BP1+protein+in+genome+protection:+structural+and+functional+characteristics+of+53BP1-dependent+DNA+repair.">A role of the 53BP1 protein in genome protection: structural and functional characteristics of 53BP1-dependent DNA repair.</a> Aging. 11 (8), 2488-2511 (2019).</li><li>Popp, H. D., Brendel, S., Hofman, W., Fabarius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunofluorescence+microscopy+of+&#947;H2AX+and+53BP1+for+analyzing+the+formation+and+repair+of+DNA+double-strand+breaks.">Immunofluorescence microscopy of &#947;H2AX and 53BP1 for analyzing the formation and repair of DNA double-strand breaks.</a> Journal of Visualized Experiments. (129), 56617 (2017).</li><li>Jezkova, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Particles+with+similar+LET+values+generate+DNA+breaks+of+different+complexity+and+reparability:+a+high-resolution+microscopy+analysis+of+&#947;H2AX/53BP1+foci.">Particles with similar LET values generate DNA breaks of different complexity and reparability: a high-resolution microscopy analysis of &#947;H2AX/53BP1 foci.</a> Nanoscale. 10, 1162-1179 (2018).</li><li>Scarpato, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+of+nuclear+phosphorylation+(&#947;-H2AX)+in+human+lymphocytes+treated+in+vitro+with+UVB,+bleomycin+and+mitomycin+C.">Kinetics of nuclear phosphorylation (&#947;-H2AX) in human lymphocytes treated in vitro with UVB, bleomycin and mitomycin C.</a> Mutagenesis. 28 (4), 465-473 (2013).</li><li>Im, K., Mareninov, S., Diaz, M. F. P., Yong, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+introduction+to+performing+immunofluorescence+staining.">An introduction to performing immunofluorescence staining.</a> Methods in Molecular Biology. 1897, 299-311 (2019).</li><li>Sanderson, M. J., Smith, I., Parker, I., Bootman, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fluorescence microscopy. 10, (2014).</li><li>Jamur, M. C., Oliver, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+fixatives+for+immunostaining.">Cell fixatives for immunostaining.</a> Methods in Molecular Biology. , 55-61 (2010).</li><li>Jamur, M. C., Oliver, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Permeabilization+of+the+cell+membrane.">Permeabilization of the cell membrane.</a> Methods in Molecular Biology. 588, 63-66 (2010).</li><li>Hecht, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bleomycin:+New+perspectives+on+the+mechanism+of+action.">Bleomycin: New perspectives on the mechanism of action.</a> Journal of Natural Products. 63, 158-168 (2000).</li><li>Fei, P., El-Deiry, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P53+and+radiation+responses.">P53 and radiation responses.</a> Oncogene. 22, 5774-5783 (2003).</li><li>Mahaney, B. L., Meek, K., Lees-Miller, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repair+of+ionizing+radiation-induced+DNA+double-strand+breaks+by+non-homologous+end-joining.">Repair of ionizing radiation-induced DNA double-strand breaks by non-homologous end-joining.</a> Biochemical Journal. 417 (3), 639-650 (2009).</li><li>Palla, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gamma-H2AX:+Can+it+be+established+as+a+classical+cancer+prognostic+factor.">Gamma-H2AX: Can it be established as a classical cancer prognostic factor.</a> Tumor Biology. 39 (3), 1010428317695931 (2017).</li><li>Markov&#224;, E., Hillert, L., Malmgren, L., Persson, B. R. R., Belyaev, I. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microwaves+from+GSM+mobile+telephones+affect+53BP1+and+gamma-H2AX+foci+in+human+lymphocytes+from+hypersensitive+and+healthy+persons.">Microwaves from GSM mobile telephones affect 53BP1 and gamma-H2AX foci in human lymphocytes from hypersensitive and healthy persons.</a> Environmental Health Perspectives. 113 (9), 1172-1177 (2005).</li><li>Scarpato, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+damage+in+peripheral+lymphocytes+of+obese+and+overweight+Italian+children+as+evaluated+by+the+&#947;-H2AX+focus+assay+and+micronucleus+test.">Nuclear damage in peripheral lymphocytes of obese and overweight Italian children as evaluated by the &#947;-H2AX focus assay and micronucleus test.</a> The FASEB Journal. 25 (2), 685-693 (2018).</li><li>Shanbhag, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+neuronal+accumulation+of+DNA+double-strand+breaks+in+Alzheimer's+disease.">Early neuronal accumulation of DNA double-strand breaks in Alzheimer's disease.</a> Acta Neuropathologica Communication. 7 (1), 77 (2019).</li><li>Lassmann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+formation+of+gamma-H2AX+and+53BP1+DNA+repair+foci+in+blood+cells+after+radioiodine+therapy+of+differentiated+thyroid+cancer.">In vivo formation of gamma-H2AX and 53BP1 DNA repair foci in blood cells after radioiodine therapy of differentiated thyroid cancer.</a> Journal of Nuclear Medicine. 51 (8), 1318-1325 (2010).</li><li>Derlin, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+&#947;-H2AX+and+53BP1+foci+in+peripheral+blood+lymphocytes+to+predict+subclinical+hematotoxicity+and+response+in+somatostatin+receptor-targeted+radionuclide+therapy+for+advanced+gastroenteropancreatic+neuroendocrine+tumors.">Assessment of &#947;-H2AX and 53BP1 foci in peripheral blood lymphocytes to predict subclinical hematotoxicity and response in somatostatin receptor-targeted radionuclide therapy for advanced gastroenteropancreatic neuroendocrine tumors.</a> Cancers (Basel). 13 (7), 1516 (2021).</li><li>Djuzenova, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radiosensitivity+in+breast+cancer+assessed+by+the+histone+&#947;-H2AX+and+53BP1+foci.">Radiosensitivity in breast cancer assessed by the histone &#947;-H2AX and 53BP1 foci.</a> Radiation Oncology. 24, 8-98 (2013).</li><li>Atkinson, J., Bezak, E., Kempson, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+DNA+double-strand+breaks+-+are+we+there+yet.">Imaging DNA double-strand breaks - are we there yet.</a> Nature Reviews in Molecular Cell Biology. 23, 579-580 (2022).</li></ol>

γH2AX ve 53BP1 odaklarının immünofloresan analizi, bir hücre sisteminin fazlar arası çekirdeklerinde genomik hasarı değerlendirmek için uygun bir yöntemdir. Bu prosedür, deneylerin sonucunu, özellikle fiksasyon ve geçirgenlikte kullanılan ajanları, antikorların tipini ve seyreltme faktörlerini ve mutajenin konsantrasyonunu etkileyebilecek birkaç kritik noktaya sahiptir.
İmmünofloresan yöntemi, esas olarak protein olan antijenleri tanımlamayı beklediği için protein bü...

DNA hasarı, hücresel oksidatif metabolizma tarafından üretilen ROS veya hem kimyasallar hem de fiziksel1 gibi eksojen olabilen ajanlar tarafından sürekli olarak indüklenir. En zararlı lezyonlar arasında, çift iplikçik kırılmaları (DSB'ler) genomik instabiliteye katkıda bulunmada temel bir rol oynar, çünkü bunlar karsinogenez sürecini başlatabilen kromozom anormalliklerine neden olurlar. Böylece hücrelere DSB'lerin onarımı2'nin karmaşık ve verimli mekanizmaları sağlanır.
Bir DSB meydana geldiğinde, hücre, MRE11 / RAD50 / NBS1 kompleksi ile birlikte, hücre döngüsü3'ü yavaşlatan veya durduran diğer proteinleri aktive etmek için ATM veya ATR kinazların işe alındığı DNA hasar yanıtını (DDR) tetikler. Bu kinazların temel bir hedefi, DSB'lerden (yani γH2AX) birkaç megabaz içinde Ser-139 üzerinde fosforile edilen histon H2AX'tir, böylece diğerlerinin yanı sıra BRCA1 ve p53 bağlayıcı protein 1 (53BP1)3 gibi çeşitli onarım faktörlerinin işe alınmasına izin verir. Daha sonra,DSB'leri 4,5'i onarmak için homolog rekombinasyon (HR), homolog olmayan uç birleştirme (NHEJ) veya tek iplikli tavlama (SSA) arasında bir yol tetiklenir. Bu nedenle, 53BP1, İK veya NHEJ arasındaki seçimi dikte etmede, esas olarak HR6 yerine NHEJ'nin aktivasyonunu teşvik etmede rol oynar. Dahası, hem H2AX histonun hem de 53BP1'in fosforile edilmiş formu, DSB'lerin bölgelerinde odaklar oluşturabilir. Bu odaklar, çift ipliğin bütünlüğü geri kazanılana kadar devam ettiğinden, γH2AX veya 53BP1 odaklarının bir zaman aralığında ortaya çıkışını / kaybolmasını değerlendirmek, bir hücre sisteminde DSB'lerin oluşumunu ve onarımını değerlendirmek için yararlı bir yöntem olarak kabul edilir 6,7. Bununla birlikte, yukarıda tarif edilen moleküler süreçlere göre, γH2AX ve 53BP1 odaklarının DDR8,9 sırasında DSB'lerin yakınında birlikte lokalize olması beklendiğinden, bu belirteçlerin varlığını çift immünofloresanda eşzamanlı olarak tespit etmek yararlı olabilir.
Bu nedenle, bu makalenin amacı, radyomimetik ajan bleomisin tarafından insan periferik lenfositlerinde indüklenen genomik hasarı değerlendirmek için γH2AX ve 53BP1 odaklarının eşzamanlı nicelleştirilmesinin uygunluğunu değerlendirmektir. Aynı metodolojiyi kullanarak, bleomisin kaynaklı DSB'lerin onarım kinetiğini daha önce kurulmuş deneysel bir prosedür10'a göre tanımlamaya çalıştık.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>AlexaFluor 568 goat anti-mouse IgG (&#947;1)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21124</td>
			<td>53BP1 secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleoprim</td>
			<td>Sanofi</td>
			<td></td>
			<td>bleomycin sulfate (mutagen)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin solution 100X</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ECB3001D</td>
			<td>antibiotics for culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 10X</td>
			<td>Termofisher</td>
			<td>14200075</td>
			<td>Phosphate-buffered saline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>EC20180L</td>
			<td>Fetal Bovine Serum for immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit IgG (H+L) DyLight 488 Coniugated</td>
			<td>Termofisher</td>
			<td>#35552</td>
			<td>&#947;H2AX secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-53BP1 monoclonal antibody</td>
			<td>Merck</td>
			<td>MAB 3802</td>
			<td>53BP1 primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labophot 2</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Fluorescence microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P-histone H2AX (Ser139) rabbit antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>#2577</td>
			<td>&#947;H2AX primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phytohemoagglutinin</td>
			<td>Termofisher</td>
			<td>R30852801</td>
			<td>component of culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong gold antifade reagent with DAPI</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>#8961</td>
			<td>Antifade solution with DAPI for counterstaining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ECB9006L</td>
			<td>Culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T9284</td>
			<td>Nonionic detergent for permeabilization</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dual immunofluorescence of &#947;h2ax and 53bp1 in human peripheral lymphocytes

Çift iplikçik kopmaları (DSB'ler), hücre çekirdeğinde meydana gelebilecek en ciddi lezyonlardan biridir ve onarılmazsa, kanser de dahil olmak üzere ciddi sonuçlara yol açabilir. Bu nedenle, hücreye DSB'leri onarmak için karmaşık mekanizmalar sağlanır ve bu yollar Ser-139 (yani γH2AX) ve p53 bağlayıcı protein 1'de (53BP1) fosforile edilmiş formunda histon H2AX'i içerir. Her iki protein de DSB'lerin bölgelerinde odaklar oluşturabildiğinden, bu belirteçlerin tanımlanması hem DSB'leri hem de onarım kinetiğini incelemek için uygun bir yöntem olarak kabul edilir. γH2AX ve 53BP1 odaklarının oluşumuna yol açan moleküler süreçlere göre, iki DNA hasar belirtecinin aynı anda tespiti ile DSB'lerin nicelleştirilmesine izin veren alternatif bir yaklaşım oluşturmak için DSB'lerin yakınındaki ko-lokalizasyonlarını araştırmak daha yararlı olabilir. Bu nedenle, bu protokol, radyomimetik ajan bleomisin tarafından insan lenfositlerinde indüklenen genomik hasarı, ikili immünofloresansta γH2AX ve 53BP1 odaklarının varlığı yoluyla değerlendirmeyi amaçlamaktadır. Bu metodolojiyi kullanarak, bleomisin kaynaklı DSB'lerin onarım kinetiğini incelemek için bir ön girişim olarak, zaman içinde γH2AX ve 53BP1 odaklarının sayısındaki değişimi de tanımladık.

Periferik lenfositlerin floresan mikroskop analizi ile elde edilen veriler, üç ana yönü değerlendirmemize izin verir: bleomisin tedavisinin, mutajenik etkisinden dolayı γH2AX ve 53BP1 odaklarının (ve dolayısıyla DSB'lerin) sayısını arttırmadaki etkinliği, her iki odağın da DSB'lerin bölgesinde ne ölçüde birlikte lokalize olduğu ve bleomisin kaynaklı DSB'lerin onarım kinetiğini tanımlamak için γH2AX ve 53BP1 odaklarının zaman seyri. Beklendiği gibi, tedavi edilmemiş ve tedavi edilmiş hüc...

Watch this Scientific Journal Video about Dual Immunofluorescence of Î³H2AX and 53BP1 in Human Peripheral Lymphocytes at JoVE.com

Dual Immunofluorescence of &#947;H2AX and 53BP1 in Human Peripheral Lymphocytes

Bu protokol, bleomisin ile tedavi edilen insan periferik lenfositlerinin interfaz çekirdeklerinde γH2AX ve 53BP1 odaklarının eşzamanlı tespiti yoluyla DNA çift iplikçik kırılmalarının oluşumunu ve onarımını değerlendirmek için bir yöntem sunmaktadır.

İnsan Periferik Lenfositlerinde γH2AX ve 53BP1'in İkili İmmünofloresansı

Double strand breaks (DSBs) are one of the most severe lesions that can occur in cell nuclei, and, if not repaired, they can lead to severe outcomes, ...

Bu makalenin amacı, bleomisin tarafından insan periferik lenfositlerinde indüklenen genomik hasarı değerlendirmek için Gama H2AX ve 53BP1 odaklarının eşzamanlı nicelleştirilmesinin uygunluğunu değerlendirmektir. Çeşitli faktörler çift iplikçik kopmalarına neden olabilir. Böylece hücrelere, hem Gama H2AX hem de 53 Bağlayıcı Protein 1'i içeren, çift iplikçik kırılmasının yakınında birlikte lokalize olabilen çeşitli onarım mekanizmaları sağlanır.Tam kan örneklerini topladıktan sonra, 4.7 mililitre tam ortam içeren bir tüpe 300 mikrolitre numune ekleyin. Daha sonra mililitre bleomisin sülfat nihai konsantrasyonu başına beş mikrogram ekleyin. Her örnek için bir negatif denetim ayarlayın.Tüpü iki saat boyunca 37 santigrat derecede bir termostata koyun. Numuneleri beş dakika boyunca 540 G'de santrifüj edin. Daha sonra pelet üzerine beş mililitre hipotonik çözelti ekleyin.Daha sonra hemolize neden olmak için 400 mikrolitre pre fiksatif çözelti ekleyin. Numuneleri beş dakika boyunca 540 G'de santrifüj edin, ardından hücreleri sabitlemek için peletleri oda sıcaklığında beş mililitre metanol içinde en az 30 dakika boyunca tekrar askıya alın. Numuneleri beş dakika boyunca 540 G'de santrifüj edin, ardından peletleri beş mililitre fiksatif çözelti içinde tekrar askıya alın.Bu adımı bir kez daha yineleyin. Beş dakika boyunca tekrar 540 G'de santrifüj yapın, ardından süpernatantı aspire edin, pelet süspansiyonu için yeterli çözelti bırakın. Yeniden askıya alınmış hücre peletini slaytların üzerine bırakın.Anti-Gama H2AX ve anti-53BP1 primer antikorlarını içeren iki çözeltiyi bloke edici çözelti içinde çözünmüş olarak hazırlayın. Ardından slaytları PBS 1X'te iki kez yıkayın. Ardından slaytları engelleme çözeltisinde 30 dakika tutun.Her slayta, blokaj çözeltisi içinde çözünmüş birincil antikorları içeren iki çözeltinin her birinin 10 mikrolitresini ekleyin. Slaytları parafilmle örtün. Gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin.Kuluçkadan sonra, PBS 1X'te beş dakika boyunca üç yıkama yapın. DyLight 488 ve Alexa Fluor 568 sekonder antikorlarını içeren iki çözeltiyi bloke edici çözelti içinde çözünmüş olarak hazırlayın. Daha sonra her slayta, blokaj çözeltisi içinde çözünmüş ikincil antikorları içeren iki çözeltinin her birinden 10 mikrolitre ekleyin.Slaytları parafilmle örtün ve iki saat boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. Bu ikinci inkübasyondan sonra, PBS 1X'te beş dakika boyunca üç yıkama yapın. Çekirdeklerin lekelenmesine karşı koymak için montajdan önce kapak fişlerinin üzerine DAPI ile 2,5 mikrolitre Antifade çözeltisi ekleyin.Odakları kinetik olarak değerlendirmek için, prosedür şimdi tarif edilenle aynıdır. Son aşama, odakların gözlemlenmesi ve nicelleştirilmesidir. Gama H2AX ve 53BP1 odakları olmayan insan lenfositleri A, B ve C'de, farklı miktarlarda Gama H2AX ve 53BP1 odaklarına sahip insan lenfositleri gösterilmiştir.Düşük düzeyde odaklar ko-lokalizasyon gözlenir. Beklendiği gibi, tedavi edilmemiş hücreler arasında hem Gama H2AX hem de 53BP1 odaklarının çok daha yüksek bir frekansı gözlenir. Ayrıca, iki belirtecin odak sayısında büyük bir fark gözlenir.Gama H2AX ve 53BP1 odaklarının zaman içindeki seyri, aynı işleve katkıda bulunmalarına rağmen farklı bir davranış göstermiştir. Gama H2AX ve 53BP1 odakları analizi, hücresel yanıtı maruz kalma veya patolojik bağlamlarda değerlendirme yeteneğine sahiptir. Bununla birlikte, Gama H2AX ve 53BP1 çift immünofloresan, olayın gerçek sıklığını hafife almaya neden olabilir.

Research

JoVE Journal

Genetics

siRNA Transfection and EMSA Analyses on Freshly Isolated Human Villous Cytotrophoblasts

Taze izole edilmiş insan Villöz sitotrofoblastlar ilgili siRNA transfeksiyonu ve EMSA analizi

Human primary villous cytotrophoblasts are a very useful source of primary cells to study placental functions and regulatory mechanisms, and to comprehend ...

Genetik

Parallel Measurement of Circadian Clock Gene Expression and Hormone Secretion in Human Primary Cell Cultures

İnsan Primer Hücre Kültürleri içinde Sirkadyen Saat Gen İfade ve Hormon salgısını Paralel Ölçümü

Circadian clocks are functional in all light-sensitive organisms, allowing for an adaptation to the external world by anticipating daily environmental ...

Analysis of Cap-binding Proteins in Human Cells Exposed to Physiological Oxygen Conditions

Fizyolojik Oksijen Koşullarına Maruz İnsan hücrelerinde Cap-bağlayıcı proteinlerin analizi

Translational control is a focal point of gene regulation, especially during periods of cellular stress. Cap-dependent translation via the eIF4F complex ...

Genome Editing and Directed Differentiation of hPSCs for Interrogating Lineage Determinants in Human Pancreatic Development

İnsan Pankreas Geliştirme Lineage Belirleyicileri sorgulanması için Genom Düzenleme ve hPSCs arasında Yönetmen Farklılaşma

Interrogating gene function in self-renewing or differentiating human pluripotent stem cells (hPSCs) offers a valuable platform towards understanding ...

Mapping Genome-wide Accessible Chromatin in Primary Human T Lymphocytes by ATAC-Seq

Birincil insan T lenfositler tarafından ataç-Seq genom genelinde erişilebilir Kromatin eşleme

Assay for Transposase-Accessible Chromatin with high-throughput sequencing (ATAC-seq) is a method used for the identification of open (accessible) regions ...

Determining Genome-wide Transcript Decay Rates in Proliferating and Quiescent Human Fibroblasts

Genom çapında transkript çürüme oranları Proliferasyona ve durgun insan fibroblast belirleme

Quiescence is a temporary, reversible state in which cells have ceased cell division, but retain the capacity to proliferate. Multiple studies, including ...

ATAC-seq Assay with Low Mitochondrial DNA Contamination from Primary Human CD4+ T Lymphocytes

ATAÇ-seq tahlil birincil insan CD4 + T lenfositleri kirlenme düşük mitokondrial DNA ile

ATAC-seq has become a widely used methodology in the study of epigenetics due to its rapid and simple approach to mapping genome-wide accessible ...

Navigating MARRVEL, a Web-Based Tool that Integrates Human Genomics and Model Organism Genetics Information

İnsan Genomik ve Model Organizma Genetiği Bilgilerini Entegre Eden Web Tabanlı Bir Araç olan MARRVEL'de Gezinme

Through whole-exome/genome sequencing, human geneticists identify rare variants that segregate with disease phenotypes. To assess if a specific variant is ...

In Vivo Functional Study of Disease-associated Rare Human Variants Using Drosophila

In Vivo Functional Study of Disease-associated Rare Human Variants Using Drosophila

Drosophila Kullanarak Hastalıkla İlişkili Nadir İnsan Varyantlarının Vivo Fonksiyonel Çalışmasında

Advances in sequencing technology have made whole-genome and whole-exome datasets more accessible for both clinical diagnosis and cutting-edge human ...

Generation of Defined Genomic Modifications Using CRISPR-CAS9 in Human Pluripotent Stem Cells

İnsan Pluripotent Kök Hücrelerinde CRISPR-CAS9 Kullanılarak Tanımlanmış Genomik Modifikasyonların Üretimi

Human pluripotent stem cells offer a powerful system to study gene function and model specific mutations relevant to disease. The generation of precise ...