Name: تسليط الضوء على المؤلف: التحقيق في آثار المركبات على الأنسجة المعوية باستخدام نماذج خط الخلايا البشرية 3D
Uploaded: 2023-09-01T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Investigating the Effects of Compounds on Intestinal Tissue Using 3D Human Cell Line Models at JoVE.com

شكرا لمؤسسة أمبرتو فيرونيسي على الزمالة التي تدعم عمل الباحث.

1. إعداد نموذج الغشاء المخاطي المعوي الأساسي 3D المعاد بناؤه
ملاحظة: يجب تنفيذ الإجراء بأكمله في غطاء تدفق رقائقي معقم. تشير جميع الخطوات في الإجراء الذي يتضمن استخدام حاضنة الخلايا إلى أن الثقافات يتم تحضينها عند 37 درجة مئوية في جو مرطب يحتوي على 5٪ CO2 (ما لم ينص على خلاف ?...

بناء نموذج الغشاء المخاطي المعوي 3D مع تضمين البارافين

<ol>
	<li>Chelakkot, C., Ghim, J., Ryu, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+regulating+intestinal+barrier+integrity+and+its+pathological+implications.">Mechanisms regulating intestinal barrier integrity and its pathological implications.</a> Experimental &amp; Molecular Medicine. 50 (8), 1-9 (2018).</li><li>Schoultz, I., Keita, &. #. 1. 9. 7. ;. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+intestinal+barrier+and+current+techniques+for+the+assessment+of+gut+permeability.">The intestinal barrier and current techniques for the assessment of gut permeability.</a> Cells. 9 (8), 1909 (1909).</li><li>Bednarek, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+methods+for+measuring+the+permeability+of+cell+monolayers.">In vitro methods for measuring the permeability of cell monolayers.</a> Methods and Protocols. 5 (1), 17 (2022).</li><li>Suzuki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+intestinal+barrier+by+nutrients:+The+role+of+tight+junctions.">Regulation of the intestinal barrier by nutrients: The role of tight junctions.</a> Animal Science Journal. 91 (1), e13357 (2020).</li><li>Guibourdenche, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Food+contaminants+effects+on+an+in+vitro+model+of+human+intestinal+epithelium.">Food contaminants effects on an in vitro model of human intestinal epithelium.</a> Toxics. 9 (6), 135 (2021).</li><li>Panwar, S., Sharma, S., Tripathi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+barrier+integrity+and+dysfunctions+in+maintaining+the+healthy+gut+and+their+health+outcomes.">Role of barrier integrity and dysfunctions in maintaining the healthy gut and their health outcomes.</a> Frontiers in Physiology. 12, 715611 (2021).</li><li>Truzzi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pro-inflammatory+effect+of+gliadins+and+glutenins+extracted+from+different+wheat+cultivars+on+an+in+vitro+3D+intestinal+epithelium+model.">Pro-inflammatory effect of gliadins and glutenins extracted from different wheat cultivars on an in vitro 3D intestinal epithelium model.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (1), 172 (2020).</li><li>Fedi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+models+replicating+the+human+intestinal+epithelium+for+absorption+and+metabolism+studies:+A+systematic+review.">In vitro models replicating the human intestinal epithelium for absorption and metabolism studies: A systematic review.</a> Journal of Controlled Release. 335, 247-268 (2021).</li><li>De Fazio, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Necrotizing+enterocolitis:+Overview+on+in+vitro+models.">Necrotizing enterocolitis: Overview on in vitro models.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (13), 6761 (2021).</li><li>Jubelin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+in+vitro+culture+models+in+oncology+research.">Three-dimensional in vitro culture models in oncology research.</a> Cell &amp; Bioscience. 12 (1), 155 (2022).</li><li>Russell, W., Burch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+principles+of+humane+experimental+technique.">The principles of humane experimental technique.</a> Available online. , (2023).</li><li>Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+it+time+for+reviewer+3+to+request+human+organ+chip+experiments+instead+of+animal+validation+studies.">Is it time for reviewer 3 to request human organ chip experiments instead of animal validation studies.</a> Advanced Science. 7 (22), 2002030 (2020).</li><li>Jung, S. M., Kim, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+models+of+the+small+intestine+for+studying+intestinal+diseases.">In vitro models of the small intestine for studying intestinal diseases.</a> Frontiers in Microbiology. 12, 767038 (2022).</li><li>Nitsche, K. S., M&#252;ller, I., Malcomber, S., Carmichael, P. L., Bouwmeester, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implementing+organ-on-chip+in+a+next-generation+risk+assessment+of+chemicals:+a+review.">Implementing organ-on-chip in a next-generation risk assessment of chemicals: a review.</a> Archives of Toxicology. 96 (3), 711-741 (2022).</li><li>Kekilli, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Midkine+level+may+be+used+as+a+noninvasive+biomarker+in+Crohn's+disease.">Midkine level may be used as a noninvasive biomarker in Crohn's disease.</a> Turkish Journal of Medical Sciences. 50, 324-329 (2020).</li><li>Truzzi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spermidine-eugenol+supplement+preserved+inflammation-challenged+intestinal+cells+by+stimulating+autophagy.">Spermidine-eugenol supplement preserved inflammation-challenged intestinal cells by stimulating autophagy.</a> International Journal of Molecular Sciences. 24 (4), 4131 (2023).</li><li>Truzzi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Are+supplements+safe?+Effects+of+gallic+and+ferulic+acids+on+in+vitro+cell+models.">Are supplements safe? Effects of gallic and ferulic acids on in vitro cell models.</a> Nutrients. 12 (6), 1591 (2020).</li><li>Buckley, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualisation+of+multiple+tight+junctional+complexes+in+human+airway+epithelial+cells.">Visualisation of multiple tight junctional complexes in human airway epithelial cells.</a> Biological Procedures. Online. 20, 3 (2018).</li><li>Ghosh, R., Gilda, J. E., Gomes, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+necessity+of+and+strategies+for+improving+confidence+in+the+accuracy+of+western+blots.">The necessity of and strategies for improving confidence in the accuracy of western blots.</a> Expert Review of Proteomics. 11 (5), 549-560 (2014).</li></ol>

يجمع نظام نموذج الغشاء المخاطي المعوي الأساسي المعاد بناؤه المعروض هنا (الشكل 6) بين التعقيد الفسيولوجي (ثقافات خلايا ثلاثية الأبعاد أكثر صلة من الناحية الفسيولوجية تحتوي على طبقة أحادية Caco-2 مع دعم الصفيحة المخصوصة الغنية ب ECM التي تحتوي على الخلايا الليفية والوحيدات) مع ا...

يشكل الحاجز الظهاري المعوي ، وهو بطانة داخلية بسمك خلية واحدة تحتوي على أنواع مختلفة من الخلايا الظهارية ، أول حاجز دفاعي مادي أو واجهة بين الخارج والوسط الداخلي للجسم 1,2. تشكل الخلايا المعوية من النوع العمودي النوع الأكثر وفرة من الخلايا الظهارية. هذه هي المسؤولة عن الحفاظ على سلامة الحاجز الظهاري من خلال التفاعلات بين العديد من مكونات الحاجز ، بما في ذلك التقاطعات الضيقة (TJs) ، وتلعب دورا مهما في تشديد الحاجز 1,3. يتكون هيكل TJ من بروتينات البلاك داخل الخلايا ، مثل انسداد المنطقة (ZO) والسينغولين ، بالتعاون مع البروتينات عبر الغشاء ، بما في ذلك الإطباق ، والكلاودين ، وجزيئات الالتصاق الموصلية (JAMs) التي تشكل بنية تشبه السوستة تربط بإحكام الخلايا المجاورة 3,4. تنظم البروتينات عبر الغشاء الانتشار السلبي للمركبات الصغيرة وتستبعد الجزيئات الكبيرة السامة.
تحفز المركبات الغذائية السامة المحتملة وملوثات الطعام إنتاج السيتوكين الالتهابي الذي يعطل نفاذية الظهارة ، وينشط الخلايا المناعية ويسبب التهاب الأنسجة المعوية المزمن5،6،7. في المقابل ، تم الإبلاغ عن العديد من المواد الكيميائية النباتية المضادة للأكسدة والمضادة للالتهابات لتقليل تعبير السيتوكين الالتهابي وتعزيز سلامة حاجز TJ المعوي من خلال استعادة تعبير بروتين TJ وتجميعه4،6،8. ومن ثم ، فإن تنظيم سلامة الحاجز الظهاري بواسطة كل من المركبات المفيدة والضارة قد شهد زيادة في استخدام كل من النماذج في الجسم الحي وفي المختبر التي تهدف إلى محاكاة الحاجز المعوي للفحص الصيدلاني ودراسات السمية. هذا مهم بشكل خاص بالنظر إلى الاهتمام المتزايد بفهم الفيزيولوجيا المرضية لأمراض الأمعاء المعوية (IBD) ، والتهاب الأمعاء والقولون الناخر ، والسرطان ، والتي يمكن محاكاتها في النماذج التجريبية8،9،10.
كان هناك طلب على تطوير نماذج قائمة على الخلايا في المختبر من أجل تحقيق هدف "3Rs" في التجارب على. وتشمل هذه بدائل بديلة لاستخدام ، والحد من عدد المستخدمة ، والصقل في اعتماد الأساليب التي تخفف من الضيق11،12،13. علاوة على ذلك ، فإن الآليات الجزيئية والخلوية والفسيولوجية الأساسية بين النماذج البشرية والفئران (القوارض هي الأنواع الأكثر استخداما) مميزة ، مما يؤدي إلى جدل حول فعالية نماذج الفئران كتنبؤات في الاستجابات البشرية12,13. تشمل المزايا العديدة لنماذج خط الخلايا البشرية في المختبر التجريب المقيد بالهدف والملاحظة المباشرة والتحليل المستمر13.
كانت الطبقات الأحادية من نوع الخلية الواحدة في الثقافات ثنائية الأبعاد (2D) بمثابة نماذج قوية. ومع ذلك ، لا يمكن لهذه إعادة إنتاج التعقيد الفسيولوجي للأنسجة البشريةبدقة 8،13،14. نتيجة لذلك ، يتم تطوير أنظمة زراعة ثلاثية الأبعاد مع تحسينات متزايدة باستمرار لتلخيص التعقيد الفسيولوجي لكل من الأنسجة المعوية السليمة والمريضة كأدوات تقييم المخاطر من الجيل التالي13،14. تشمل هذه النماذج سقالات 3D Transwell ذات خطوط الخلايا المتنوعة ، والثقافات العضوية ، وأجهزة الموائع الدقيقة (الأمعاء على الرقاقة) باستخدام كل من خطوط الخلايا والمواد العضوية (المشتقة من الأنسجة السليمة والمريضة)8،13،14.
استند بروتوكول المكافئ المعوي ثلاثي الأبعاد "الأنسجة السليمة" المقدم في الدراسة الحالية إلى تحقيق توازن بين التعقيد الفسيولوجي والبساطة التجريبية13. يمثل النموذج سقالة 3D Transwell ، التي تتألف من ثلاثة خطوط خلوية (الخلايا المعوية [خط سرطان القولون الغدي القياسي الذهبي Caco-2] مع مكون مناعي داعم [الخلايا الوحيدة U937 والخلايا الليفية L929]) ، مما يشكل نظاما موحدا وقابلا للتكرار بسهولة ينطبق على الفحص الأولي للجزيئات الغذائية ذات الأهمية على سلامة الحاجز الظهاري المعوي والاستجابة المناعية. يتضمن البروتوكول تضمين البارافين للتقييم المجهري الضوئي لسلامة الحاجز الظهاري باستخدام مكافئات معوية ثابتة. ميزة النهج الحالي هي أنه يمكن جعل أقسام عديدة من الأنسجة المدمجة تلطخ لمعلمات متعددة من تجربة واحدة.

basic three-dimensional (3d) intestinal model system with an immune component

كانت هناك زيادة في استخدام النماذج المعوية في الجسم الحي وفي المختبر لدراسة الفيزيولوجيا المرضية للأمراض المعوية الالتهابية ، للفحص الدوائي للمواد المفيدة المحتملة ، ولدراسات السمية على المكونات الغذائية التي يحتمل أن تكون ضارة. ومما له صلة بالموضوع أن هناك طلبا حاليا على تطوير نماذج في المختبر تعتمد على الخلايا لتحل محل النماذج الحيوانية. هنا ، يتم تقديم بروتوكول لنموذج مكافئ معوي ثلاثي الأبعاد (3D) أساسي "الأنسجة السليمة" باستخدام خطوط الخلايا مع فائدة مزدوجة تتمثل في توفير كل من البساطة التجريبية (نظام موحد وقابل للتكرار بسهولة) والتعقيد الفسيولوجي (الخلايا المعوية Caco-2 مع مكون مناعي داعم من الخلايا الوحيدة U937 والخلايا الليفية L929). يتضمن البروتوكول أيضا تضمين البارافين للتقييم المجهري الضوئي للمكافئات المعوية الثابتة ، وبالتالي توفير ميزة تحليل المعلمات البصرية المتعددة من تجربة واحدة. يتم استخدام مقاطع ملطخة بالهيماتوكسيلين ويوزين (H&E) تظهر الخلايا العمودية Caco-2 التي تشكل طبقة أحادية ضيقة ومنتظمة في معالجات التحكم للتحقق من فعالية النموذج كنظام تجريبي. باستخدام الغلوتين كمكون غذائي مؤيد للالتهابات ، تشمل المعلمات التي تم تحليلها من الأقسام انخفاض سمك الطبقة الأحادية ، بالإضافة إلى الاضطراب والانفصال عن المصفوفة الأساسية (H&E) ، وانخفاض تعبير بروتين الوصلة الضيقة كما هو موضح من تلطيخ الأوكلودين (قابل للقياس الكمي إحصائيا) ، والتنشيط المناعي لخلايا U937 المهاجرة كما يتضح من مجموعة التمايز 14 (CD14) والتمايز المرتبط ب CD11b إلى البلاعم. كما هو موضح باستخدام عديد السكاريد الدهني لمحاكاة التهاب الأمعاء ، فإن المعلمات الإضافية التي يمكن قياسها هي زيادة تلطيخ المخاط وتعبير السيتوكين (مثل midkine) الذي يمكن استخلاصه من الوسط قبل التثبيت. يمكن التوصية بنموذج الغشاء المخاطي المعوي الأساسي ثلاثي الأبعاد (3D) والأقسام الثابتة لدراسات الحالة الالتهابية وسلامة الحاجز مع إمكانية تحليل معلمات بصرية متعددة قابلة للقياس الكمي.

The intestinal epithelial barrier, a one-cell-thick internal lining containing different types of epithelial cells, constitutes the first physical defensive barrier or interface between the outside and the internal milieu of the body1,2. Columnar-type enterocytes constitute the most abundant type of epithelial cells. These are&#160;responsible for maintaining epithelial barrier integrity through interactions between several barrier components, including tight junctions (TJs), playing a significant role in barrier tightening1,3. The TJ structure consists of intracellular plaque proteins, such as zonula occludens (ZO) and cingulin, cooperating with transmembrane proteins, including occludins, claudins, and junctional adhesion molecules (JAMs) that form zipper-like structure tightly linking the neighboring cells3,4. The transmembrane proteins regulate the passive paracellular diffusion of small compounds and exclude toxic large molecules.
Potentially toxic food compounds and food contaminants stimulate inflammatory cytokine production that disrupts the epithelial permeability, activating immune cells and causing chronic intestinal tissue inflammation5,6,7. In contrast, various anti-oxidant and anti-inflammatory phytochemicals have been reported to reduce inflammatory cytokine expression and enhance intestinal TJ barrier integrity through the restoration of TJ protein expression and assembly4,6,8. Hence, the regulation of epithelial barrier integrity by both beneficial and harmful compounds has seen an increase in the use of both in vivo and in vitro models aimed at mimicking the intestinal barrier for pharmaceutical screening and toxicity studies. This is particularly relevant given the increasing interest in understanding the pathophysiology of intestinal bowel diseases (IBD), necrotizing enterocolitis, and cancer, which can be simulated in experimental models8,9,10.
There has been a demand for the development of cell-based in vitro models in order to achieve the objective of the &#8220;3Rs&#8221; in animal testing. These include replacement alternatives to the use of animals, reduction in the number of animals used, and refinement in adopting methods that alleviate distress11,12,13. Moreover, the underlying molecular, cellular, and physiological mechanisms between human and murine models (rodents being the most widely used species) are distinctive, leading to controversy regarding the efficacy of the murine models as predictors in human responses12,13. Numerous advantages of in vitro human cell-line models include target-restricted experimentation, direct observation, and continuous analysis13.
Single-cell-type monolayers in two-dimensional (2D) cultures have served as powerful models. However, these cannot precisely reproduce the physiological complexity of human tissues8,13,14. As a result, 3D&#160;culture systems are being developed with ever-increasing improvements to recapitulate the physiological complexity of both healthy and diseased intestinal tissues as next-generation risk assessment toolboxes13,14. These models include 3D Transwell scaffolds with diverse cell lines, organoid cultures, and microfluidic devices (intestine-on-chip) using both cell lines and organoids (derived from both healthy and diseased tissues)8,13,14.&#160;
The 3D &#8220;healthy tissue&#8221; intestinal equivalent protocol presented in the present study was based on striking a balance between physiological complexity and experimental simplicity13. The model is representative of a 3D Transwell scaffold, comprised of three cell lines (enterocytes [the gold-standard colon adenocarcinoma Caco-2 line] with a supporting immune component [U937 monocytes and L929 fibroblasts]), constituting a standardized and easily repeatable system applicable for the preliminary screening of dietary molecules of interest on intestinal epithelial barrier integrity and immune response. The protocol includes paraffin embedding for light microscopic evaluation of epithelial barrier integrity using fixed intestinal equivalents. The advantage of the present approach is that numerous sections of the embedded tissues can be made to stain for multiple parameters from a single experiment.

تسليط الضوء على المؤلف: التحقيق في آثار المركبات على الأنسجة المعوية باستخدام نماذج خط الخلايا البشرية 3D 

نظام نموذج الأمعاء الأساسي ثلاثي الأبعاد (3D) مع مكون مناعي

The scope of the work is to use these in vitro three-dimensional human cell line models to investigate the fact of beneficial as well as helpful compounds on intestinal tissue. The models can be used to further research understanding and also as a basic drug model. Using the plant-derived compounds, spermidine and eugenol, both separately and together in supplement form, we measure beneficial increases in autophagy and decreases in inflammation using these models.Then we will also able to show the potentially harmful effect of gluten extracted from certain wheat varieties on intestinal tissues. We are currently using economically priced, standardized, and easily repeatable in vitro system that better reflect the physiology of the human intestine as an alternative to animal models. Since we also use commercial human cell line rather than plant-derived cells, the responses from the study are more applicable to the general population.The protocol is based entirely on the use of different lines. These renders the model most standardized and reproducible. Furthermore, the simultaneous cultivation of different cell lines, enterocytes, fibroblasts, and immune system cells, allows for cellular responses that are closer to what happens in the patient.

الجانب الأول المهم هو تحديد مدى قبول الغشاء المخاطي المعوي الأساسي 3D للأغراض التجريبية. يتم تنفيذ ذلك مع البقع الأكثر استخداما على نطاق واسع في مختبرات الأنسجة وعلم الأنسجة ، وهي الهيماتوكسيلين (بقع المواد النووية اللون الأزرق الأرجواني الغامق) ويوزين (بقع المواد السيتوبلازمية متفاوتة ظ...

Watch this Scientific Journal Video about Investigating the Effects of Compounds on Intestinal Tissue Using 3D Human Cell Line Models at JoVE.com

هنا نصف بناء نظام نموذج خط الخلايا المعوية الأساسي ثلاثي الأبعاد (3D) وبروتوكول تضمين البارافين للتقييم المجهري الضوئي لمكافئات الأمعاء الثابتة. يسمح تلطيخ البروتينات المختارة بتحليل معلمات بصرية متعددة من تجربة واحدة للاستخدام المحتمل في دراسات فحص الأدوية قبل السريرية.

There has been an increase in the use of in vivo and in vitro intestinal models to study the pathophysiology of inflammatory intestinal diseases, for the ...

نطاق العمل هو استخدام هذه النماذج ثلاثية الأبعاد لخط الخلايا البشرية في المختبر للتحقيق في حقيقة المركبات المفيدة والمفيدة على الأنسجة المعوية. يمكن استخدام النماذج لمزيد من فهم البحث وأيضا كنموذج أساسي للدواء. باستخدام المركبات المشتقة من النباتات ، السبيرميدين والأوجينول ، بشكل منفصل ومعا في شكل مكمل ، نقيس الزيادات المفيدة في الالتهام الذاتي وانخفاض الالتهاب باستخدام هذه النماذج.ثم سنتمكن أيضا من إظهار التأثير الضار المحتمل للجلوتين المستخرج من بعض أنواع القمح على الأنسجة المعوية. نحن نستخدم حاليا نظاما في المختبر بأسعار اقتصادية وموحدة وقابلة للتكرار بسهولة والتي تعكس بشكل أفضل فسيولوجيا الأمعاء البشرية كبديل للنماذج الحيوانية. نظرا لأننا نستخدم أيضا خط الخلايا البشرية التجارية بدلا من الخلايا المشتقة من النباتات ، فإن استجابات الدراسة تنطبق بشكل أكبر على عامة السكان.يعتمد البروتوكول بالكامل على استخدام خطوط مختلفة. هذا يجعل النموذج الأكثر توحيدا وقابلية للتكرار. علاوة على ذلك ، فإن الزراعة المتزامنة لخطوط الخلايا المختلفة ، والخلايا المعوية ، والخلايا الليفية ، وخلايا الجهاز المناعي ، تسمح باستجابات خلوية أقرب إلى ما يحدث في المريض.

basic-three-dimensional-3d-intestinal-model-system-with-an-immune

Research

JoVE Journal

Biology

Basic Three-Dimensional (3D) Intestinal Model System with an Immune Component

There has been an increase in the use of in vivo and in vitro intestinal models to study the pathophysiology of inflammatory intestinal diseases, for the pharmacological screening of potentially beneficial substances, and for toxicity studies on potentially harmful food components. Of relevance, there is a current demand for the development of cell-based in vitro models to substitute animal models. Here, a protocol for a basic, &#8220;healthy tissue&#8221; three-dimensional (3D) intestinal equivalent model using cell lines is presented with the dual benefit of providing both experimental simplicity (standardized and easily repeatable system) and physiological complexity (Caco-2 enterocytes with a supporting immune component of U937 monocytes and L929 fibroblasts). The protocol also includes paraffin embedding for light microscopic evaluation of fixed intestinal equivalents, thereby providing the advantage of analyzing multiple visual parameters from a single experiment. Hematoxylin and eosin (H&#38;E) stained sections showing the Caco-2 columnar cells forming a tight and regular monolayer in control treatments are used to verify the efficacy of the model as an experimental system. Using gluten as a pro-inflammatory food component, parameters analyzed from sections include reduced monolayer thickness, as well as disruption and detachment from the underlying matrix (H&#38;E), decreased tight junction protein expression as shown from occludin staining (quantifiable statistically), and immune-activation of migrating U937 cells as evidenced from the cluster of differentiation 14 (CD14) staining and CD11b-related differentiation into macrophages. As shown by using lipopolysaccharide to simulate intestinal inflammation, additional parameters that can be measured are increased mucus staining and cytokine expression (such as midkine) that can be extracted from the medium prior to fixation. The basic three-dimensional (3D) intestinal mucosa model and fixed sections can be recommended for inflammatory status and barrier integrity studies with the possibility of analyzing multiple visual quantifiable parameters.

Here we describe constructing a basic three-dimensional (3D) intestinal cell line model system and a paraffin embedding protocol for light microscopic evaluation of fixed intestinal equivalents. Staining of selected proteins permits the analysis of multiple visual parameters from a single experiment for potential use in preclinical drug screening studies.

Preparation of a Basic 3D Reconstructed Intestinal Mucosa Model for Microscopic Evaluation of Fixed Intestinal Equivalents

To begin, select a 24-well plate containing inserts with 0.4 micron filters. Using a pipette, add 500 microliters of HBSS below and above the filter inserts. Then close the multi-well plate and place it in an incubator for two hours.After incubation, carefully aspirate the HBSS from the plate. Prepare a cell-free collagen solution in a sterile 50 milliliter tube in DMEM on ice. Add 250 microliters of collagen above the membrane filter and place the lid on the plate.Allow the solution to polymerize at room temperature. Next, remove the L-929 fibroblast cell culture from the incubator. Add two milliliters of a pre-warmed trypsin EDTA solution to the flask and place it in an incubator for three to five minutes.Transfer the cell suspension to a sterile 15 milliliter tube and centrifuge at 645 G for five minutes. Using a vacuum pump, aspirate the supernatant and resuspend the pellet in one milliliter of DMEM. Add 20 microliters of cell suspension into a tube containing 20 microliters of Trypan Blue solution.And use a cell counting chamber to evaluate the cell density. Next, remove the U-937 monocyte cell culture from the incubator. Centrifuge the cell suspension and resuspend the pellet in one milliliter of RPMI.After ensuring cells are homogeneously suspended, count them using a cell counting chamber. Next, prepare cell suspensions containing 50, 000 L-929 and 15, 000 U-937 cells respectively in 50 microliters of DMEM. Add each 50 microliter cell suspension to 450 microliters of collagen and mix thoroughly.Overlay the pre-coded cell-free lamina propria with 500 microliters of the collagen cell solution. Close the plate and place it in an incubator for two hours to allow the solution to set. Next, remove the Caco-2 cell culture from the incubator.Using a vacuum pump, aspirate the medium and rinse the cells with 10 milliliters of PBS. Add five milliliters of PBS trypsin EDTA solution and place it in an incubator for five to eight minutes. Then centrifuge the cell suspension and resuspend the pellet in one milliliter of DMEM.After counting, prepare a cell suspension containing 150, 000 Caco-2 cells in 50 microliters of DMEM. Place the plate in a laminar flow hood for 10 minutes before transferring it to the incubator. After 30 minutes, add 500 microliters of the DMEM above the reconstructed model and 500 microliters below the filter and return the plate to the incubator.The next day, carefully replace the medium with 500 microliters of fresh DMEM above and below the filter respectively.

إعداد نموذج الغشاء المخاطي المعوي الأساسي 3D المعاد بناؤه للتقييم المجهري للمكافئات المعوية الثابتة

Paraffin Embedding of a Basic 3D Reconstructed Intestinal Mucosa Model for Immune-Histochemical Staining

For paraffin embedding of cells, set the paraffin machine to 58 degrees Celsius. Using pliers, transfer the membrane inserts to clean wells of a sterile 24-well plate. Add 500 microliters of 37%buffered formalin and PBS above the filter, and one milliliter below the filter.Close the lid and leave the plate in a fume hood for two hours. Once the lamina propria is detached from the membrane insert, transfer the intestinal mucosa into a beaker containing 25 milliliters of 35%ethanol, and incubate for 10 minutes. After dehydration in increasing ethanol concentrations, place the samples in 50 milliliters of xylene or a histological clearing agent for 10 to 20 minutes.Once the samples are transparent, place them in a metal tissue cassette holder and submerge them in liquid paraffin inside a heated machine. After 45 minutes, use a microtome to cut four micron sections. Place the cut section on the slides and dry them in an oven at 37 degrees Celsius for 24 hours.An acceptable 3-D intestinal equivalent mucosa model consists of Caco-2 cells formed in a tight and regular monolayer above the extracellular-matrix-rich lamina propria. Unacceptable models include those showing excessive growth, disorganized epithelial layers, malformation or lack of epithelial layer formation. The proinflammatory effect of wheat protein with a high gluten content disrupted the cellular monolayer and reduced the thickness of the epithelial layer compared to the control group.The occludin protein content was significantly higher in the control group than in the group exposed to gluten protein. CD14 and CD11b staining of U937 monocytes showed that wheat protein with a high gluten content activated the monocytes, and induced their migration and differentiation into macrophages. Under the lipopolysaccharide challenge, Caco-2 cells increased mucus production and the release of the inflammatory marker midkine.