Name: Pleins feux sur l’auteur : Étude des effets des composés sur le tissu intestinal à l’aide de modèles 3D de lignées cellulaires humaines
Uploaded: 2023-09-01T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Investigating the Effects of Compounds on Intestinal Tissue Using 3D Human Cell Line Models at JoVE.com

Merci à la Fondation Umberto Veronesi pour une bourse de soutien aux travaux des chercheurs.

1. Préparation du modèle de base de la muqueuse intestinale reconstruite en 3D
REMARQUE : L’ensemble de la procédure doit être effectué dans une hotte à flux laminaire stérile. Toutes les étapes de la procédure impliquant l’utilisation de l’incubateur cellulaire signifient que les cultures sont incubées à 37 °C dans une atmosphère humidifiée contenant 5 % de CO2 (sauf indication contraire dans le protocole).
<ol><li>Préparation préalable des lign?...

Construction d’un modèle 3D de muqueuse intestinale avec enrobage de paraffine

<ol>
	<li>Chelakkot, C., Ghim, J., Ryu, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+regulating+intestinal+barrier+integrity+and+its+pathological+implications.">Mechanisms regulating intestinal barrier integrity and its pathological implications.</a> Experimental &amp; Molecular Medicine. 50 (8), 1-9 (2018).</li><li>Schoultz, I., Keita, &. #. 1. 9. 7. ;. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+intestinal+barrier+and+current+techniques+for+the+assessment+of+gut+permeability.">The intestinal barrier and current techniques for the assessment of gut permeability.</a> Cells. 9 (8), 1909 (1909).</li><li>Bednarek, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+methods+for+measuring+the+permeability+of+cell+monolayers.">In vitro methods for measuring the permeability of cell monolayers.</a> Methods and Protocols. 5 (1), 17 (2022).</li><li>Suzuki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+intestinal+barrier+by+nutrients:+The+role+of+tight+junctions.">Regulation of the intestinal barrier by nutrients: The role of tight junctions.</a> Animal Science Journal. 91 (1), e13357 (2020).</li><li>Guibourdenche, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Food+contaminants+effects+on+an+in+vitro+model+of+human+intestinal+epithelium.">Food contaminants effects on an in vitro model of human intestinal epithelium.</a> Toxics. 9 (6), 135 (2021).</li><li>Panwar, S., Sharma, S., Tripathi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+barrier+integrity+and+dysfunctions+in+maintaining+the+healthy+gut+and+their+health+outcomes.">Role of barrier integrity and dysfunctions in maintaining the healthy gut and their health outcomes.</a> Frontiers in Physiology. 12, 715611 (2021).</li><li>Truzzi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pro-inflammatory+effect+of+gliadins+and+glutenins+extracted+from+different+wheat+cultivars+on+an+in+vitro+3D+intestinal+epithelium+model.">Pro-inflammatory effect of gliadins and glutenins extracted from different wheat cultivars on an in vitro 3D intestinal epithelium model.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (1), 172 (2020).</li><li>Fedi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+models+replicating+the+human+intestinal+epithelium+for+absorption+and+metabolism+studies:+A+systematic+review.">In vitro models replicating the human intestinal epithelium for absorption and metabolism studies: A systematic review.</a> Journal of Controlled Release. 335, 247-268 (2021).</li><li>De Fazio, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Necrotizing+enterocolitis:+Overview+on+in+vitro+models.">Necrotizing enterocolitis: Overview on in vitro models.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (13), 6761 (2021).</li><li>Jubelin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+in+vitro+culture+models+in+oncology+research.">Three-dimensional in vitro culture models in oncology research.</a> Cell &amp; Bioscience. 12 (1), 155 (2022).</li><li>Russell, W., Burch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+principles+of+humane+experimental+technique.">The principles of humane experimental technique.</a> Available online. , (2023).</li><li>Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+it+time+for+reviewer+3+to+request+human+organ+chip+experiments+instead+of+animal+validation+studies.">Is it time for reviewer 3 to request human organ chip experiments instead of animal validation studies.</a> Advanced Science. 7 (22), 2002030 (2020).</li><li>Jung, S. M., Kim, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+models+of+the+small+intestine+for+studying+intestinal+diseases.">In vitro models of the small intestine for studying intestinal diseases.</a> Frontiers in Microbiology. 12, 767038 (2022).</li><li>Nitsche, K. S., M&#252;ller, I., Malcomber, S., Carmichael, P. L., Bouwmeester, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implementing+organ-on-chip+in+a+next-generation+risk+assessment+of+chemicals:+a+review.">Implementing organ-on-chip in a next-generation risk assessment of chemicals: a review.</a> Archives of Toxicology. 96 (3), 711-741 (2022).</li><li>Kekilli, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Midkine+level+may+be+used+as+a+noninvasive+biomarker+in+Crohn's+disease.">Midkine level may be used as a noninvasive biomarker in Crohn's disease.</a> Turkish Journal of Medical Sciences. 50, 324-329 (2020).</li><li>Truzzi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spermidine-eugenol+supplement+preserved+inflammation-challenged+intestinal+cells+by+stimulating+autophagy.">Spermidine-eugenol supplement preserved inflammation-challenged intestinal cells by stimulating autophagy.</a> International Journal of Molecular Sciences. 24 (4), 4131 (2023).</li><li>Truzzi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Are+supplements+safe?+Effects+of+gallic+and+ferulic+acids+on+in+vitro+cell+models.">Are supplements safe? Effects of gallic and ferulic acids on in vitro cell models.</a> Nutrients. 12 (6), 1591 (2020).</li><li>Buckley, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualisation+of+multiple+tight+junctional+complexes+in+human+airway+epithelial+cells.">Visualisation of multiple tight junctional complexes in human airway epithelial cells.</a> Biological Procedures. Online. 20, 3 (2018).</li><li>Ghosh, R., Gilda, J. E., Gomes, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+necessity+of+and+strategies+for+improving+confidence+in+the+accuracy+of+western+blots.">The necessity of and strategies for improving confidence in the accuracy of western blots.</a> Expert Review of Proteomics. 11 (5), 549-560 (2014).</li></ol>

Le système modèle de base de la muqueuse intestinale reconstruite présenté ici (Figure 6) combine la complexité physiologique (cultures cellulaires 3D plus pertinentes sur le plan physiologique contenant une monocouche Caco-2 avec un support de lamina propria riche en MEC contenant des fibroblastes et des monocytes) et la simplicité expérimentale (utilisation de lignées cellulaires humaines commerciales pour produire un système standardisé et facilement reproductible)<sup class="xr...

La barrière épithéliale intestinale, une paroi interne d’une cellule d’épaisseur contenant différents types de cellules épithéliales, constitue la première barrière défensive physique ou interface entre le milieu extérieur et le milieu interne du corps 1,2. Les entérocytes de type cylindrique constituent le type de cellules épithéliales le plus abondant. Ceux-ci sont responsables du maintien de l’intégrité de la barrière épithéliale grâce à des interactions entre plusieurs composants de la barrière, y compris les jonctions serrées (TJ), jouant un rôle important dans le resserrement de la barrière 1,3. La structure TJ est constituée de protéines de plaque intracellulaire, telles que les occlusions zonules (ZO) et la cinguline, qui coopèrent avec des protéines transmembranaires, notamment les occlusines, les claudines et les molécules d’adhésion jonctionnelle (JAM) qui forment une structure en forme de fermeture éclair reliant étroitement les cellules voisines 3,4. Les protéines transmembranaires régulent la diffusion paracellulaire passive des petits composés et excluent les grosses molécules toxiques.
Les composés alimentaires potentiellement toxiques et les contaminants alimentaires stimulent la production de cytokines inflammatoires qui perturbent la perméabilité épithéliale, activant les cellules immunitaires et provoquant une inflammation chronique des tissus intestinaux 5,6,7. En revanche, divers composés phytochimiques antioxydants et anti-inflammatoires ont été signalés pour réduire l’expression des cytokines inflammatoires et améliorer l’intégrité de la barrière intestinale TJ grâce à la restauration de l’expression et de l’assemblage de la protéine TJ 4,6,8. Par conséquent, la régulation de l’intégrité de la barrière épithéliale par des composés bénéfiques et nocifs a vu une augmentation de l’utilisation de modèles in vivo et in vitro visant à imiter la barrière intestinale pour le dépistage pharmaceutique et les études de toxicité. Ceci est particulièrement pertinent compte tenu de l’intérêt croissant pour la compréhension de la physiopathologie des maladies intestinales de l’intestin (MICI), de l’entérocolite nécrosante et du cancer, qui peut être simulée dans les modèles expérimentaux 8,9,10.
Il y a eu une demande pour le développement de modèles in vitro cellulaires afin d’atteindre l’objectif des « 3R » dans l’expérimentation animale. Il s’agit notamment de solutions de remplacement à l’utilisation d’animaux, de la réduction du nombre d’animaux utilisés et de l’amélioration de l’adoption de méthodes qui atténuent la détresse 11,12,13. De plus, les mécanismes moléculaires, cellulaires et physiologiques sous-jacents entre les modèles humains et murins (les rongeurs étant l’espèce la plus utilisée) sont distincts, ce qui conduit à une controverse concernant l’efficacité des modèles murins en tant que prédicteurs des réponses humaines12,13. Parmi les nombreux avantages des modèles de lignées cellulaires humaines in vitro, citons l’expérimentation restreinte à la cible, l’observation directe et l’analyse continue13.
Les monocouches de type unicellulaire dans les cultures bidimensionnelles (2D) ont servi de modèles puissants. Cependant, ceux-ci ne peuvent pas reproduire avec précision la complexité physiologique des tissus humains 8,13,14. En conséquence, des systèmes de culture 3D sont en cours de développement avec des améliorations toujours croissantes pour récapituler la complexité physiologique des tissus intestinaux sains et malades en tant que boîtes à outils d’évaluation des risques de nouvelle génération13,14. Ces modèles comprennent des échafaudages Transwell 3D avec diverses lignées cellulaires, des cultures d’organoïdes et des dispositifs microfluidiques (intestin sur puce) utilisant à la fois des lignées cellulaires et des organoïdes (dérivés de tissus sains et malades)8,13,14.
Le protocole équivalent intestinal 3D « tissu sain » présenté dans la présente étude était basé sur la recherche d’un équilibre entre la complexité physiologique et la simplicité expérimentale13. Le modèle est représentatif d’un échafaudage Transwell 3D, composé de trois lignées cellulaires (entérocytes [la lignée Caco-2 de référence de l’adénocarcinome du côlon] avec une composante immunitaire de soutien [monocytes U937 et fibroblastes L929]), constituant un système standardisé et facilement reproductible applicable au criblage préliminaire de molécules alimentaires d’intérêt sur l’intégrité de la barrière épithéliale intestinale et la réponse immunitaire. Le protocole comprend l’enrobage de paraffine pour l’évaluation microscopique de l’intégrité de la barrière épithéliale à l’aide d’équivalents intestinaux fixes. L’avantage de l’approche actuelle est qu’il est possible de colorer de nombreuses sections des tissus intégrés pour plusieurs paramètres à partir d’une seule expérience.

basic three-dimensional (3d) intestinal model system with an immune component

Il y a eu une augmentation de l’utilisation de modèles intestinaux in vivo et in vitro pour étudier la physiopathologie des maladies inflammatoires intestinales, pour le criblage pharmacologique de substances potentiellement bénéfiques et pour les études de toxicité sur des composants alimentaires potentiellement nocifs. Il est important de noter qu’il existe actuellement une demande pour le développement de modèles in vitro à base de cellules pour remplacer les modèles animaux. Ici, un protocole pour un modèle de base d’équivalent intestinal tridimensionnel (3D) de « tissu sain » utilisant des lignées cellulaires est présenté avec le double avantage d’offrir à la fois une simplicité expérimentale (système standardisé et facilement reproductible) et une complexité physiologique (entérocytes Caco-2 avec une composante immunitaire de soutien des monocytes U937 et des fibroblastes L929). Le protocole comprend également l’enrobage de paraffine pour l’évaluation par microscopie optique d’équivalents intestinaux fixes, offrant ainsi l’avantage d’analyser plusieurs paramètres visuels à partir d’une seule expérience. Des coupes colorées à l’hématoxyline et à l’éosine (H&E) montrant les cellules cylindriques Caco-2 formant une monocouche serrée et régulière dans les traitements témoins sont utilisées pour vérifier l’efficacité du modèle en tant que système expérimental. En utilisant le gluten comme composant alimentaire pro-inflammatoire, les paramètres analysés à partir des coupes comprennent une épaisseur de monocouche réduite, ainsi qu’une perturbation et un détachement de la matrice sous-jacente (H & E), une diminution de l’expression de la protéine de jonction serrée comme le montre la coloration à l’occludine (quantifiable statistiquement) et l’activation immunitaire des cellules U937 migrantes, comme en témoigne la coloration en grappe de différenciation 14 (CD14) et la différenciation liée à CD11b en macrophages. Comme le montre l’utilisation de lipopolysaccharides pour simuler l’inflammation intestinale, des paramètres supplémentaires qui peuvent être mesurés sont l’augmentation de la coloration du mucus et l’expression des cytokines (telles que la midkine) qui peuvent être extraites du milieu avant la fixation. Le modèle de base tridimensionnel (3D) de la muqueuse intestinale et les coupes fixes peuvent être recommandés pour les études de l’état inflammatoire et de l’intégrité de la barrière avec la possibilité d’analyser plusieurs paramètres visuels quantifiables.

The intestinal epithelial barrier, a one-cell-thick internal lining containing different types of epithelial cells, constitutes the first physical defensive barrier or interface between the outside and the internal milieu of the body1,2. Columnar-type enterocytes constitute the most abundant type of epithelial cells. These are&#160;responsible for maintaining epithelial barrier integrity through interactions between several barrier components, including tight junctions (TJs), playing a significant role in barrier tightening1,3. The TJ structure consists of intracellular plaque proteins, such as zonula occludens (ZO) and cingulin, cooperating with transmembrane proteins, including occludins, claudins, and junctional adhesion molecules (JAMs) that form zipper-like structure tightly linking the neighboring cells3,4. The transmembrane proteins regulate the passive paracellular diffusion of small compounds and exclude toxic large molecules.
Potentially toxic food compounds and food contaminants stimulate inflammatory cytokine production that disrupts the epithelial permeability, activating immune cells and causing chronic intestinal tissue inflammation5,6,7. In contrast, various anti-oxidant and anti-inflammatory phytochemicals have been reported to reduce inflammatory cytokine expression and enhance intestinal TJ barrier integrity through the restoration of TJ protein expression and assembly4,6,8. Hence, the regulation of epithelial barrier integrity by both beneficial and harmful compounds has seen an increase in the use of both in vivo and in vitro models aimed at mimicking the intestinal barrier for pharmaceutical screening and toxicity studies. This is particularly relevant given the increasing interest in understanding the pathophysiology of intestinal bowel diseases (IBD), necrotizing enterocolitis, and cancer, which can be simulated in experimental models8,9,10.
There has been a demand for the development of cell-based in vitro models in order to achieve the objective of the &#8220;3Rs&#8221; in animal testing. These include replacement alternatives to the use of animals, reduction in the number of animals used, and refinement in adopting methods that alleviate distress11,12,13. Moreover, the underlying molecular, cellular, and physiological mechanisms between human and murine models (rodents being the most widely used species) are distinctive, leading to controversy regarding the efficacy of the murine models as predictors in human responses12,13. Numerous advantages of in vitro human cell-line models include target-restricted experimentation, direct observation, and continuous analysis13.
Single-cell-type monolayers in two-dimensional (2D) cultures have served as powerful models. However, these cannot precisely reproduce the physiological complexity of human tissues8,13,14. As a result, 3D&#160;culture systems are being developed with ever-increasing improvements to recapitulate the physiological complexity of both healthy and diseased intestinal tissues as next-generation risk assessment toolboxes13,14. These models include 3D Transwell scaffolds with diverse cell lines, organoid cultures, and microfluidic devices (intestine-on-chip) using both cell lines and organoids (derived from both healthy and diseased tissues)8,13,14.&#160;
The 3D &#8220;healthy tissue&#8221; intestinal equivalent protocol presented in the present study was based on striking a balance between physiological complexity and experimental simplicity13. The model is representative of a 3D Transwell scaffold, comprised of three cell lines (enterocytes [the gold-standard colon adenocarcinoma Caco-2 line] with a supporting immune component [U937 monocytes and L929 fibroblasts]), constituting a standardized and easily repeatable system applicable for the preliminary screening of dietary molecules of interest on intestinal epithelial barrier integrity and immune response. The protocol includes paraffin embedding for light microscopic evaluation of epithelial barrier integrity using fixed intestinal equivalents. The advantage of the present approach is that numerous sections of the embedded tissues can be made to stain for multiple parameters from a single experiment.

Pleins feux sur l’auteur : Étude des effets des composés sur le tissu intestinal à l’aide de modèles 3D de lignées cellulaires humaines 

Système de modèle intestinal tridimensionnel (3D) de base avec une composante immunitaire

The scope of the work is to use these in vitro three-dimensional human cell line models to investigate the fact of beneficial as well as helpful compounds on intestinal tissue. The models can be used to further research understanding and also as a basic drug model. Using the plant-derived compounds, spermidine and eugenol, both separately and together in supplement form, we measure beneficial increases in autophagy and decreases in inflammation using these models.Then we will also able to show the potentially harmful effect of gluten extracted from certain wheat varieties on intestinal tissues. We are currently using economically priced, standardized, and easily repeatable in vitro system that better reflect the physiology of the human intestine as an alternative to animal models. Since we also use commercial human cell line rather than plant-derived cells, the responses from the study are more applicable to the general population.The protocol is based entirely on the use of different lines. These renders the model most standardized and reproducible. Furthermore, the simultaneous cultivation of different cell lines, enterocytes, fibroblasts, and immune system cells, allows for cellular responses that are closer to what happens in the patient.

Le premier aspect important est de déterminer l’acceptabilité de la muqueuse intestinale équivalente 3D de base à des fins expérimentales. Ceci est réalisé avec la coloration la plus largement utilisée dans les laboratoires d’histologie et d’histopathologie, à savoir l’hématoxyline (colore la matière nucléaire de couleur bleu-violet profond) et l’éosine (colore la matière cytoplasmique de différentes nuances de rose). La coloration H&E est d’abord réalisée sur un témoin non traité, qui est ...

Watch this Scientific Journal Video about Investigating the Effects of Compounds on Intestinal Tissue Using 3D Human Cell Line Models at JoVE.com

Nous décrivons ici la construction d’un système modèle de base de lignées cellulaires intestinales tridimensionnelles (3D) et d’un protocole d’enrobage de paraffine pour l’évaluation par microscopie optique d’équivalents intestinaux fixes. La coloration de protéines sélectionnées permet d’analyser plusieurs paramètres visuels à partir d’une seule expérience en vue d’une utilisation potentielle dans des études précliniques de criblage de médicaments.

There has been an increase in the use of in vivo and in vitro intestinal models to study the pathophysiology of inflammatory intestinal diseases, for the ...

L’objectif du travail est d’utiliser ces modèles de lignées cellulaires humaines tridimensionnelles in vitro pour étudier le fait de composés bénéfiques et utiles sur les tissus intestinaux. Les modèles peuvent être utilisés pour approfondir la compréhension de la recherche et également comme modèle de base de médicaments. En utilisant les composés d’origine végétale, la spermidine et l’eugénol, à la fois séparément et ensemble sous forme de supplément, nous mesurons les augmentations bénéfiques de l’autophagie et les diminutions de l’inflammation à l’aide de ces modèles.Ensuite, nous pourrons également montrer l’effet potentiellement nocif du gluten extrait de certaines variétés de blé sur les tissus intestinaux. Nous utilisons actuellement un système in vitro économiquement abordable, standardisé et facilement reproductible qui reflète mieux la physiologie de l’intestin humain comme alternative aux modèles animaux. Étant donné que nous utilisons également des lignées cellulaires humaines commerciales plutôt que des cellules d’origine végétale, les réponses de l’étude sont plus applicables à la population générale.Le protocole est entièrement basé sur l’utilisation de différentes lignes. Cela rend le modèle le plus standardisé et le plus reproductible. De plus, la culture simultanée de différentes lignées cellulaires, entérocytes, fibroblastes et cellules du système immunitaire, permet des réponses cellulaires plus proches de ce qui se passe chez le patient.

basic-three-dimensional-3d-intestinal-model-system-with-an-immune

Research

JoVE Journal

Biology

Basic Three-Dimensional (3D) Intestinal Model System with an Immune Component

There has been an increase in the use of in vivo and in vitro intestinal models to study the pathophysiology of inflammatory intestinal diseases, for the pharmacological screening of potentially beneficial substances, and for toxicity studies on potentially harmful food components. Of relevance, there is a current demand for the development of cell-based in vitro models to substitute animal models. Here, a protocol for a basic, &#8220;healthy tissue&#8221; three-dimensional (3D) intestinal equivalent model using cell lines is presented with the dual benefit of providing both experimental simplicity (standardized and easily repeatable system) and physiological complexity (Caco-2 enterocytes with a supporting immune component of U937 monocytes and L929 fibroblasts). The protocol also includes paraffin embedding for light microscopic evaluation of fixed intestinal equivalents, thereby providing the advantage of analyzing multiple visual parameters from a single experiment. Hematoxylin and eosin (H&#38;E) stained sections showing the Caco-2 columnar cells forming a tight and regular monolayer in control treatments are used to verify the efficacy of the model as an experimental system. Using gluten as a pro-inflammatory food component, parameters analyzed from sections include reduced monolayer thickness, as well as disruption and detachment from the underlying matrix (H&#38;E), decreased tight junction protein expression as shown from occludin staining (quantifiable statistically), and immune-activation of migrating U937 cells as evidenced from the cluster of differentiation 14 (CD14) staining and CD11b-related differentiation into macrophages. As shown by using lipopolysaccharide to simulate intestinal inflammation, additional parameters that can be measured are increased mucus staining and cytokine expression (such as midkine) that can be extracted from the medium prior to fixation. The basic three-dimensional (3D) intestinal mucosa model and fixed sections can be recommended for inflammatory status and barrier integrity studies with the possibility of analyzing multiple visual quantifiable parameters.

Here we describe constructing a basic three-dimensional (3D) intestinal cell line model system and a paraffin embedding protocol for light microscopic evaluation of fixed intestinal equivalents. Staining of selected proteins permits the analysis of multiple visual parameters from a single experiment for potential use in preclinical drug screening studies.

Recherche

Biologie

Preparation of a Basic 3D Reconstructed Intestinal Mucosa Model for Microscopic Evaluation of Fixed Intestinal Equivalents

To begin, select a 24-well plate containing inserts with 0.4 micron filters. Using a pipette, add 500 microliters of HBSS below and above the filter inserts. Then close the multi-well plate and place it in an incubator for two hours.After incubation, carefully aspirate the HBSS from the plate. Prepare a cell-free collagen solution in a sterile 50 milliliter tube in DMEM on ice. Add 250 microliters of collagen above the membrane filter and place the lid on the plate.Allow the solution to polymerize at room temperature. Next, remove the L-929 fibroblast cell culture from the incubator. Add two milliliters of a pre-warmed trypsin EDTA solution to the flask and place it in an incubator for three to five minutes.Transfer the cell suspension to a sterile 15 milliliter tube and centrifuge at 645 G for five minutes. Using a vacuum pump, aspirate the supernatant and resuspend the pellet in one milliliter of DMEM. Add 20 microliters of cell suspension into a tube containing 20 microliters of Trypan Blue solution.And use a cell counting chamber to evaluate the cell density. Next, remove the U-937 monocyte cell culture from the incubator. Centrifuge the cell suspension and resuspend the pellet in one milliliter of RPMI.After ensuring cells are homogeneously suspended, count them using a cell counting chamber. Next, prepare cell suspensions containing 50, 000 L-929 and 15, 000 U-937 cells respectively in 50 microliters of DMEM. Add each 50 microliter cell suspension to 450 microliters of collagen and mix thoroughly.Overlay the pre-coded cell-free lamina propria with 500 microliters of the collagen cell solution. Close the plate and place it in an incubator for two hours to allow the solution to set. Next, remove the Caco-2 cell culture from the incubator.Using a vacuum pump, aspirate the medium and rinse the cells with 10 milliliters of PBS. Add five milliliters of PBS trypsin EDTA solution and place it in an incubator for five to eight minutes. Then centrifuge the cell suspension and resuspend the pellet in one milliliter of DMEM.After counting, prepare a cell suspension containing 150, 000 Caco-2 cells in 50 microliters of DMEM. Place the plate in a laminar flow hood for 10 minutes before transferring it to the incubator. After 30 minutes, add 500 microliters of the DMEM above the reconstructed model and 500 microliters below the filter and return the plate to the incubator.The next day, carefully replace the medium with 500 microliters of fresh DMEM above and below the filter respectively.

Préparation d’un modèle de base de muqueuse intestinale reconstruite en 3D pour l’évaluation microscopique d’équivalents intestinaux fixes

Paraffin Embedding of a Basic 3D Reconstructed Intestinal Mucosa Model for Immune-Histochemical Staining

For paraffin embedding of cells, set the paraffin machine to 58 degrees Celsius. Using pliers, transfer the membrane inserts to clean wells of a sterile 24-well plate. Add 500 microliters of 37%buffered formalin and PBS above the filter, and one milliliter below the filter.Close the lid and leave the plate in a fume hood for two hours. Once the lamina propria is detached from the membrane insert, transfer the intestinal mucosa into a beaker containing 25 milliliters of 35%ethanol, and incubate for 10 minutes. After dehydration in increasing ethanol concentrations, place the samples in 50 milliliters of xylene or a histological clearing agent for 10 to 20 minutes.Once the samples are transparent, place them in a metal tissue cassette holder and submerge them in liquid paraffin inside a heated machine. After 45 minutes, use a microtome to cut four micron sections. Place the cut section on the slides and dry them in an oven at 37 degrees Celsius for 24 hours.An acceptable 3-D intestinal equivalent mucosa model consists of Caco-2 cells formed in a tight and regular monolayer above the extracellular-matrix-rich lamina propria. Unacceptable models include those showing excessive growth, disorganized epithelial layers, malformation or lack of epithelial layer formation. The proinflammatory effect of wheat protein with a high gluten content disrupted the cellular monolayer and reduced the thickness of the epithelial layer compared to the control group.The occludin protein content was significantly higher in the control group than in the group exposed to gluten protein. CD14 and CD11b staining of U937 monocytes showed that wheat protein with a high gluten content activated the monocytes, and induced their migration and differentiation into macrophages. Under the lipopolysaccharide challenge, Caco-2 cells increased mucus production and the release of the inflammatory marker midkine.