Name: Autor im Rampenlicht: Untersuchung der Auswirkungen von Verbindungen auf das Darmgewebe mit Hilfe von 3D-Modellen menschlicher Zelllinien
Uploaded: 2023-09-01T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Investigating the Effects of Compounds on Intestinal Tissue Using 3D Human Cell Line Models at JoVE.com

Dank an die Umberto Veronesi Stiftung für ein Stipendium zur Unterstützung der Arbeit von Forschern.

1. Erstellung des grundlegenden 3D-rekonstruierten Darmschleimhautmodells
HINWEIS: Das gesamte Verfahren muss in einer sterilen Laminar-Flow-Haube durchgeführt werden. Alle Schritte des Verfahrens, bei denen der Zellinkubator verwendet wird, bedeuten, dass die Kulturen bei 37 °C in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5 % CO2 inkubiert werden (sofern im Protokoll nicht anders angegeben).
<ol><li>Vorherige Präparation der im Darmmodellsystem verwendeten Zelllinien<ol><l...

Konstruktion eines 3D-Darmschleimhautmodells mit Paraffineinbettung

<ol>
	<li>Chelakkot, C., Ghim, J., Ryu, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+regulating+intestinal+barrier+integrity+and+its+pathological+implications.">Mechanisms regulating intestinal barrier integrity and its pathological implications.</a> Experimental &amp; Molecular Medicine. 50 (8), 1-9 (2018).</li><li>Schoultz, I., Keita, &. #. 1. 9. 7. ;. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+intestinal+barrier+and+current+techniques+for+the+assessment+of+gut+permeability.">The intestinal barrier and current techniques for the assessment of gut permeability.</a> Cells. 9 (8), 1909 (1909).</li><li>Bednarek, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+methods+for+measuring+the+permeability+of+cell+monolayers.">In vitro methods for measuring the permeability of cell monolayers.</a> Methods and Protocols. 5 (1), 17 (2022).</li><li>Suzuki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+intestinal+barrier+by+nutrients:+The+role+of+tight+junctions.">Regulation of the intestinal barrier by nutrients: The role of tight junctions.</a> Animal Science Journal. 91 (1), e13357 (2020).</li><li>Guibourdenche, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Food+contaminants+effects+on+an+in+vitro+model+of+human+intestinal+epithelium.">Food contaminants effects on an in vitro model of human intestinal epithelium.</a> Toxics. 9 (6), 135 (2021).</li><li>Panwar, S., Sharma, S., Tripathi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+barrier+integrity+and+dysfunctions+in+maintaining+the+healthy+gut+and+their+health+outcomes.">Role of barrier integrity and dysfunctions in maintaining the healthy gut and their health outcomes.</a> Frontiers in Physiology. 12, 715611 (2021).</li><li>Truzzi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pro-inflammatory+effect+of+gliadins+and+glutenins+extracted+from+different+wheat+cultivars+on+an+in+vitro+3D+intestinal+epithelium+model.">Pro-inflammatory effect of gliadins and glutenins extracted from different wheat cultivars on an in vitro 3D intestinal epithelium model.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (1), 172 (2020).</li><li>Fedi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+models+replicating+the+human+intestinal+epithelium+for+absorption+and+metabolism+studies:+A+systematic+review.">In vitro models replicating the human intestinal epithelium for absorption and metabolism studies: A systematic review.</a> Journal of Controlled Release. 335, 247-268 (2021).</li><li>De Fazio, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Necrotizing+enterocolitis:+Overview+on+in+vitro+models.">Necrotizing enterocolitis: Overview on in vitro models.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (13), 6761 (2021).</li><li>Jubelin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+in+vitro+culture+models+in+oncology+research.">Three-dimensional in vitro culture models in oncology research.</a> Cell &amp; Bioscience. 12 (1), 155 (2022).</li><li>Russell, W., Burch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+principles+of+humane+experimental+technique.">The principles of humane experimental technique.</a> Available online. , (2023).</li><li>Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+it+time+for+reviewer+3+to+request+human+organ+chip+experiments+instead+of+animal+validation+studies.">Is it time for reviewer 3 to request human organ chip experiments instead of animal validation studies.</a> Advanced Science. 7 (22), 2002030 (2020).</li><li>Jung, S. M., Kim, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+models+of+the+small+intestine+for+studying+intestinal+diseases.">In vitro models of the small intestine for studying intestinal diseases.</a> Frontiers in Microbiology. 12, 767038 (2022).</li><li>Nitsche, K. S., M&#252;ller, I., Malcomber, S., Carmichael, P. L., Bouwmeester, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implementing+organ-on-chip+in+a+next-generation+risk+assessment+of+chemicals:+a+review.">Implementing organ-on-chip in a next-generation risk assessment of chemicals: a review.</a> Archives of Toxicology. 96 (3), 711-741 (2022).</li><li>Kekilli, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Midkine+level+may+be+used+as+a+noninvasive+biomarker+in+Crohn's+disease.">Midkine level may be used as a noninvasive biomarker in Crohn's disease.</a> Turkish Journal of Medical Sciences. 50, 324-329 (2020).</li><li>Truzzi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spermidine-eugenol+supplement+preserved+inflammation-challenged+intestinal+cells+by+stimulating+autophagy.">Spermidine-eugenol supplement preserved inflammation-challenged intestinal cells by stimulating autophagy.</a> International Journal of Molecular Sciences. 24 (4), 4131 (2023).</li><li>Truzzi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Are+supplements+safe?+Effects+of+gallic+and+ferulic+acids+on+in+vitro+cell+models.">Are supplements safe? Effects of gallic and ferulic acids on in vitro cell models.</a> Nutrients. 12 (6), 1591 (2020).</li><li>Buckley, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualisation+of+multiple+tight+junctional+complexes+in+human+airway+epithelial+cells.">Visualisation of multiple tight junctional complexes in human airway epithelial cells.</a> Biological Procedures. Online. 20, 3 (2018).</li><li>Ghosh, R., Gilda, J. E., Gomes, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+necessity+of+and+strategies+for+improving+confidence+in+the+accuracy+of+western+blots.">The necessity of and strategies for improving confidence in the accuracy of western blots.</a> Expert Review of Proteomics. 11 (5), 549-560 (2014).</li></ol>

Das hier vorgestellte grundlegende rekonstruierte Modellsystem der Darmschleimhaut (Abbildung 6) kombiniert physiologische Komplexität (physiologisch relevantere 3D-Zellkulturen, die eine Caco-2-Monoschicht mit einem EZM-reichen Lamina-propria-Träger mit Fibroblasten und Monozyten enthalten) mit experimenteller Einfachheit (Verwendung kommerzieller humaner Zelllinien zur Herstellung eines standardisierten und leicht wiederholbaren Systems)13. Daher wird dieses Model...

Die intestinale Epithelbarriere, eine eine Zelle dicke innere Auskleidung, die verschiedene Arten von Epithelzellen enthält, stellt die erste physikalische Abwehrbarriere oder Schnittstelle zwischen dem äußeren und dem inneren Milieu des Körpers dar 1,2. Enterozyten vom Säulentyp stellen die am häufigsten vorkommende Art von Epithelzellen dar. Diese sind für die Aufrechterhaltung der Integrität der epithelialen Barriere durch Wechselwirkungen zwischen mehreren Barrierekomponenten, einschließlich Tight Junctions (TJs), verantwortlich und spielen eine wichtige Rolle bei der Straffung der Barriere 1,3. Die TJ-Struktur besteht aus intrazellulären Plaqueproteinen wie Zonula occludens (ZO) und Cingulin, die mit Transmembranproteinen zusammenarbeiten, einschließlich Occludinen, Claudinen und junktionalen Adhäsionsmolekülen (JAMs), die eine reißverschlussartige Struktur bilden, die die benachbarten Zellen fest miteinander verbindet 3,4. Die Transmembranproteine regulieren die passive parazelluläre Diffusion kleiner Verbindungen und schließen toxische große Moleküle aus.
Potenziell toxische Lebensmittelverbindungen und Lebensmittelkontaminanten stimulieren die Produktion von entzündlichen Zytokinen, die die epitheliale Permeabilität stören, Immunzellen aktivieren und chronische Entzündungen des Darmgewebes verursachen 5,6,7. Im Gegensatz dazu wurde berichtet, dass verschiedene antioxidative und entzündungshemmende Phytochemikalien die inflammatorische Zytokinexpression reduzieren und die Integrität der intestinalen TJ-Barriere durch die Wiederherstellung der TJ-Proteinexpression und -assemblierung verbessern 4,6,8. Daher hat die Regulierung der Integrität der Epithelbarriere sowohl durch nützliche als auch durch schädliche Verbindungen zu einer Zunahme der Verwendung von In-vivo- und In-vitro-Modellen geführt, die darauf abzielen, die Darmbarriere für pharmazeutische Screening- und Toxizitätsstudien nachzuahmen. Dies ist besonders relevant angesichts des zunehmenden Interesses am Verständnis der Pathophysiologie von Darmerkrankungen (CED), nekrotisierender Enterokolitis und Krebs, die in experimentellen Modellen simuliert werden können 8,9,10.
Gefragt ist die Entwicklung von zellbasierten In-vitro-Modellen, um das Ziel der "3R" im Tierversuch zu erreichen. Dazu gehören Ersatzalternativen zur Verwendung von Tieren, die Verringerung der Anzahl der verwendeten Tiere und die Verfeinerung der Anwendung von Methoden zur Linderung von Not 11,12,13. Darüber hinaus sind die zugrundeliegenden molekularen, zellulären und physiologischen Mechanismen zwischen menschlichen und murinen Modellen (Nagetiere sind die am weitesten verbreitete Spezies) unterschiedlich, was zu einer Kontroverse über die Wirksamkeit der murinen Modelle als Prädiktoren für menschliche Reaktionen führt12,13. Zu den zahlreichen Vorteilen von In-vitro-Modellen humaner Zelllinien gehören zielbeschränkte Experimente, direkte Beobachtung und kontinuierliche Analyse13.
Einzelzell-Monoschichten in zweidimensionalen (2D) Kulturen haben als leistungsfähige Modelle gedient. Diese können jedoch die physiologische Komplexität menschlicher Gewebe nicht exakt wiedergeben 8,13,14. Infolgedessen werden 3D-Kultursysteme mit immer besseren Verbesserungen entwickelt, um die physiologische Komplexität sowohl von gesundem als auch von erkranktem Darmgewebe als Risikobewertungs-Toolboxen der nächsten Generation zu rekapitulieren 13,14. Zu diesen Modellen gehören 3D-Transwell-Gerüste mit verschiedenen Zelllinien, Organoidkulturen und mikrofluidischen Geräten (Intestine-on-Chip), die sowohl Zelllinien als auch Organoide (sowohl aus gesundem als auch aus erkranktem Gewebe) verwenden8,13,14.
Das in der vorliegenden Studie vorgestellte 3D-Protokoll für "gesundes Gewebe" basierte auf der Suche nach einem Gleichgewicht zwischen physiologischer Komplexität und experimenteller Einfachheit13. Das Modell ist repräsentativ für ein 3D-Transwell-Gerüst, das aus drei Zelllinien besteht (Enterozyten [die Goldstandard-Caco-2-Linie des Kolon-Adenokarzinoms] mit einer unterstützenden Immunkomponente [U937-Monozyten und L929-Fibroblasten]), die ein standardisiertes und leicht wiederholbares System darstellen, das für das vorläufige Screening von Nahrungsmolekülen von Interesse auf die Integrität der Darmepithelbarriere und die Immunantwort anwendbar ist. Das Protokoll umfasst Paraffineinbettungen zur lichtmikroskopischen Beurteilung der Integrität der Epithelbarriere unter Verwendung von fixierten Darmäquivalenten. Der Vorteil des vorliegenden Ansatzes besteht darin, dass zahlreiche Abschnitte des eingebetteten Gewebes in einem einzigen Experiment für mehrere Parameter gefärbt werden können.

basic three-dimensional (3d) intestinal model system with an immune component

Die Verwendung von In-vivo - und In-vitro-Darmmodellen zur Untersuchung der Pathophysiologie entzündlicher Darmerkrankungen, zum pharmakologischen Screening potenziell nützlicher Substanzen und zur Toxizitätsuntersuchung potenziell schädlicher Lebensmittelbestandteile hat zugenommen. Relevant ist, dass derzeit ein Bedarf an der Entwicklung von zellbasierten In-vitro-Modellen besteht, um Tiermodelle zu ersetzen. Hier wird ein Protokoll für ein grundlegendes, dreidimensionales (3D) intestinales Äquivalentmodell aus "gesundem Gewebe" unter Verwendung von Zelllinien vorgestellt, das sowohl experimentelle Einfachheit (standardisiertes und leicht wiederholbares System) als auch physiologische Komplexität (Caco-2-Enterozyten mit einer unterstützenden Immunkomponente von U937-Monozyten und L929-Fibroblasten) bietet. Das Protokoll beinhaltet auch eine Paraffineinbettung zur lichtmikroskopischen Auswertung von fixierten Darmäquivalenten, wodurch der Vorteil der Analyse mehrerer visueller Parameter in einem einzigen Experiment geboten wird. Hämatoxylin- und Eosin-gefärbte (H&E)-gefärbte Schnitte, die zeigen, dass die Caco-2-Säulenzellen eine dichte und regelmäßige Monoschicht in Kontrollbehandlungen bilden, werden verwendet, um die Wirksamkeit des Modells als experimentelles System zu überprüfen. Zu den Parametern, die aus den Schnitten analysiert wurden, gehören eine reduzierte Monoschichtdicke sowie eine Störung und Ablösung von der zugrunde liegenden Matrix (H&E), eine verminderte Expression von Tight-Junction-Proteinen, wie sie aus der Occludin-Färbung (statistisch quantifizierbar) hervorgeht, und die Immunaktivierung migrierender U937-Zellen, wie sie durch die Cluster-of-Differentiation 14 (CD14)-Färbung und die CD11b-bezogene Differenzierung in Makrophagen nachgewiesen wird. Wie die Verwendung von Lipopolysaccharid zur Simulation einer Darmentzündung zeigt, sind zusätzliche Parameter, die gemessen werden können, eine erhöhte Schleimfärbung und Zytokinexpression (z. B. Midkin), die vor der Fixierung aus dem Medium extrahiert werden können. Das grundlegende dreidimensionale (3D) Darmschleimhautmodell und die fixierten Schnitte können für Studien zum Entzündungsstatus und zur Barriereintegrität empfohlen werden, wobei die Möglichkeit besteht, mehrere visuell quantifizierbare Parameter zu analysieren.

The intestinal epithelial barrier, a one-cell-thick internal lining containing different types of epithelial cells, constitutes the first physical defensive barrier or interface between the outside and the internal milieu of the body1,2. Columnar-type enterocytes constitute the most abundant type of epithelial cells. These are&#160;responsible for maintaining epithelial barrier integrity through interactions between several barrier components, including tight junctions (TJs), playing a significant role in barrier tightening1,3. The TJ structure consists of intracellular plaque proteins, such as zonula occludens (ZO) and cingulin, cooperating with transmembrane proteins, including occludins, claudins, and junctional adhesion molecules (JAMs) that form zipper-like structure tightly linking the neighboring cells3,4. The transmembrane proteins regulate the passive paracellular diffusion of small compounds and exclude toxic large molecules.
Potentially toxic food compounds and food contaminants stimulate inflammatory cytokine production that disrupts the epithelial permeability, activating immune cells and causing chronic intestinal tissue inflammation5,6,7. In contrast, various anti-oxidant and anti-inflammatory phytochemicals have been reported to reduce inflammatory cytokine expression and enhance intestinal TJ barrier integrity through the restoration of TJ protein expression and assembly4,6,8. Hence, the regulation of epithelial barrier integrity by both beneficial and harmful compounds has seen an increase in the use of both in vivo and in vitro models aimed at mimicking the intestinal barrier for pharmaceutical screening and toxicity studies. This is particularly relevant given the increasing interest in understanding the pathophysiology of intestinal bowel diseases (IBD), necrotizing enterocolitis, and cancer, which can be simulated in experimental models8,9,10.
There has been a demand for the development of cell-based in vitro models in order to achieve the objective of the &#8220;3Rs&#8221; in animal testing. These include replacement alternatives to the use of animals, reduction in the number of animals used, and refinement in adopting methods that alleviate distress11,12,13. Moreover, the underlying molecular, cellular, and physiological mechanisms between human and murine models (rodents being the most widely used species) are distinctive, leading to controversy regarding the efficacy of the murine models as predictors in human responses12,13. Numerous advantages of in vitro human cell-line models include target-restricted experimentation, direct observation, and continuous analysis13.
Single-cell-type monolayers in two-dimensional (2D) cultures have served as powerful models. However, these cannot precisely reproduce the physiological complexity of human tissues8,13,14. As a result, 3D&#160;culture systems are being developed with ever-increasing improvements to recapitulate the physiological complexity of both healthy and diseased intestinal tissues as next-generation risk assessment toolboxes13,14. These models include 3D Transwell scaffolds with diverse cell lines, organoid cultures, and microfluidic devices (intestine-on-chip) using both cell lines and organoids (derived from both healthy and diseased tissues)8,13,14.&#160;
The 3D &#8220;healthy tissue&#8221; intestinal equivalent protocol presented in the present study was based on striking a balance between physiological complexity and experimental simplicity13. The model is representative of a 3D Transwell scaffold, comprised of three cell lines (enterocytes [the gold-standard colon adenocarcinoma Caco-2 line] with a supporting immune component [U937 monocytes and L929 fibroblasts]), constituting a standardized and easily repeatable system applicable for the preliminary screening of dietary molecules of interest on intestinal epithelial barrier integrity and immune response. The protocol includes paraffin embedding for light microscopic evaluation of epithelial barrier integrity using fixed intestinal equivalents. The advantage of the present approach is that numerous sections of the embedded tissues can be made to stain for multiple parameters from a single experiment.

Autor im Rampenlicht: Untersuchung der Auswirkungen von Verbindungen auf das Darmgewebe mit Hilfe von 3D-Modellen menschlicher Zelllinien 

Grundlegendes dreidimensionales (3D) Darmmodellsystem mit einer Immunkomponente

The scope of the work is to use these in vitro three-dimensional human cell line models to investigate the fact of beneficial as well as helpful compounds on intestinal tissue. The models can be used to further research understanding and also as a basic drug model. Using the plant-derived compounds, spermidine and eugenol, both separately and together in supplement form, we measure beneficial increases in autophagy and decreases in inflammation using these models.Then we will also able to show the potentially harmful effect of gluten extracted from certain wheat varieties on intestinal tissues. We are currently using economically priced, standardized, and easily repeatable in vitro system that better reflect the physiology of the human intestine as an alternative to animal models. Since we also use commercial human cell line rather than plant-derived cells, the responses from the study are more applicable to the general population.The protocol is based entirely on the use of different lines. These renders the model most standardized and reproducible. Furthermore, the simultaneous cultivation of different cell lines, enterocytes, fibroblasts, and immune system cells, allows for cellular responses that are closer to what happens in the patient.

Der erste wichtige Aspekt besteht darin, die Akzeptanz der basischen 3D-Darmäquivalent-Schleimhaut für experimentelle Zwecke zu bestimmen. Dies wird mit der am weitesten verbreiteten Färbung in Histologie- und Histopathologielabors durchgeführt, nämlich Hämatoxylin (färbt Kernmaterial tiefblau-violett) und Eosin (färbt zytoplasmatisches Material in verschiedenen Rosatönen). Die H&E-Färbung wird zunächst an einer unbehandelten Kontrolle durchgeführt, die unter den gleichen Bedingungen und im gleichen Zeitrahme...

Watch this Scientific Journal Video about Investigating the Effects of Compounds on Intestinal Tissue Using 3D Human Cell Line Models at JoVE.com

Hier beschreiben wir die Konstruktion eines grundlegenden dreidimensionalen (3D) intestinalen Zelllinienmodellsystems und eines Paraffin-Einbettungsprotokolls für die lichtmikroskopische Bewertung von fixierten intestinalen Äquivalenten. Die Färbung ausgewählter Proteine ermöglicht die Analyse mehrerer visueller Parameter aus einem einzigen Experiment für den potenziellen Einsatz in präklinischen Wirkstoff-Screening-Studien.

There has been an increase in the use of in vivo and in vitro intestinal models to study the pathophysiology of inflammatory intestinal diseases, for the ...

Ziel der Arbeit ist es, diese in vitro dreidimensionalen humanen Zelllinienmodelle zu verwenden, um die Tatsache von nützlichen und hilfreichen Verbindungen auf Darmgewebe zu untersuchen. Die Modelle können zur weiteren Erforschung des Verständnisses und auch als grundlegendes Arzneimittelmodell verwendet werden. Unter Verwendung der pflanzlichen Verbindungen Spermidin und Eugenol, sowohl einzeln als auch zusammen in Form von Nahrungsergänzungsmitteln, messen wir mit diesen Modellen einen positiven Anstieg der Autophagie und einen Rückgang der Entzündung.Dann können wir auch die potenziell schädliche Wirkung von Gluten, das aus bestimmten Weizensorten gewonnen wird, auf das Darmgewebe zeigen. Wir verwenden derzeit kostengünstige, standardisierte und leicht wiederholbare In-vitro-Systeme, die die Physiologie des menschlichen Darms als Alternative zu Tiermodellen besser widerspiegeln. Da wir auch kommerzielle menschliche Zelllinien anstelle von pflanzlichen Zellen verwenden, sind die Antworten aus der Studie eher auf die Allgemeinbevölkerung anwendbar.Das Protokoll basiert vollständig auf der Verwendung verschiedener Leitungen. Dadurch wird das Modell am standardisiertesten und reproduzierbarsten. Darüber hinaus ermöglicht die gleichzeitige Kultivierung verschiedener Zelllinien, Enterozyten, Fibroblasten und Zellen des Immunsystems zelluläre Reaktionen, die dem im Patienten näher kommen.

basic-three-dimensional-3d-intestinal-model-system-with-an-immune

Research

JoVE Journal

Biology

Basic Three-Dimensional (3D) Intestinal Model System with an Immune Component

There has been an increase in the use of in vivo and in vitro intestinal models to study the pathophysiology of inflammatory intestinal diseases, for the pharmacological screening of potentially beneficial substances, and for toxicity studies on potentially harmful food components. Of relevance, there is a current demand for the development of cell-based in vitro models to substitute animal models. Here, a protocol for a basic, &#8220;healthy tissue&#8221; three-dimensional (3D) intestinal equivalent model using cell lines is presented with the dual benefit of providing both experimental simplicity (standardized and easily repeatable system) and physiological complexity (Caco-2 enterocytes with a supporting immune component of U937 monocytes and L929 fibroblasts). The protocol also includes paraffin embedding for light microscopic evaluation of fixed intestinal equivalents, thereby providing the advantage of analyzing multiple visual parameters from a single experiment. Hematoxylin and eosin (H&#38;E) stained sections showing the Caco-2 columnar cells forming a tight and regular monolayer in control treatments are used to verify the efficacy of the model as an experimental system. Using gluten as a pro-inflammatory food component, parameters analyzed from sections include reduced monolayer thickness, as well as disruption and detachment from the underlying matrix (H&#38;E), decreased tight junction protein expression as shown from occludin staining (quantifiable statistically), and immune-activation of migrating U937 cells as evidenced from the cluster of differentiation 14 (CD14) staining and CD11b-related differentiation into macrophages. As shown by using lipopolysaccharide to simulate intestinal inflammation, additional parameters that can be measured are increased mucus staining and cytokine expression (such as midkine) that can be extracted from the medium prior to fixation. The basic three-dimensional (3D) intestinal mucosa model and fixed sections can be recommended for inflammatory status and barrier integrity studies with the possibility of analyzing multiple visual quantifiable parameters.

Here we describe constructing a basic three-dimensional (3D) intestinal cell line model system and a paraffin embedding protocol for light microscopic evaluation of fixed intestinal equivalents. Staining of selected proteins permits the analysis of multiple visual parameters from a single experiment for potential use in preclinical drug screening studies.

Forschung

Biologie

Preparation of a Basic 3D Reconstructed Intestinal Mucosa Model for Microscopic Evaluation of Fixed Intestinal Equivalents

To begin, select a 24-well plate containing inserts with 0.4 micron filters. Using a pipette, add 500 microliters of HBSS below and above the filter inserts. Then close the multi-well plate and place it in an incubator for two hours.After incubation, carefully aspirate the HBSS from the plate. Prepare a cell-free collagen solution in a sterile 50 milliliter tube in DMEM on ice. Add 250 microliters of collagen above the membrane filter and place the lid on the plate.Allow the solution to polymerize at room temperature. Next, remove the L-929 fibroblast cell culture from the incubator. Add two milliliters of a pre-warmed trypsin EDTA solution to the flask and place it in an incubator for three to five minutes.Transfer the cell suspension to a sterile 15 milliliter tube and centrifuge at 645 G for five minutes. Using a vacuum pump, aspirate the supernatant and resuspend the pellet in one milliliter of DMEM. Add 20 microliters of cell suspension into a tube containing 20 microliters of Trypan Blue solution.And use a cell counting chamber to evaluate the cell density. Next, remove the U-937 monocyte cell culture from the incubator. Centrifuge the cell suspension and resuspend the pellet in one milliliter of RPMI.After ensuring cells are homogeneously suspended, count them using a cell counting chamber. Next, prepare cell suspensions containing 50, 000 L-929 and 15, 000 U-937 cells respectively in 50 microliters of DMEM. Add each 50 microliter cell suspension to 450 microliters of collagen and mix thoroughly.Overlay the pre-coded cell-free lamina propria with 500 microliters of the collagen cell solution. Close the plate and place it in an incubator for two hours to allow the solution to set. Next, remove the Caco-2 cell culture from the incubator.Using a vacuum pump, aspirate the medium and rinse the cells with 10 milliliters of PBS. Add five milliliters of PBS trypsin EDTA solution and place it in an incubator for five to eight minutes. Then centrifuge the cell suspension and resuspend the pellet in one milliliter of DMEM.After counting, prepare a cell suspension containing 150, 000 Caco-2 cells in 50 microliters of DMEM. Place the plate in a laminar flow hood for 10 minutes before transferring it to the incubator. After 30 minutes, add 500 microliters of the DMEM above the reconstructed model and 500 microliters below the filter and return the plate to the incubator.The next day, carefully replace the medium with 500 microliters of fresh DMEM above and below the filter respectively.

Erstellung eines einfachen 3D-rekonstruierten Darmschleimhautmodells zur mikroskopischen Beurteilung von fixierten Darmäquivalenten

Paraffin Embedding of a Basic 3D Reconstructed Intestinal Mucosa Model for Immune-Histochemical Staining

For paraffin embedding of cells, set the paraffin machine to 58 degrees Celsius. Using pliers, transfer the membrane inserts to clean wells of a sterile 24-well plate. Add 500 microliters of 37%buffered formalin and PBS above the filter, and one milliliter below the filter.Close the lid and leave the plate in a fume hood for two hours. Once the lamina propria is detached from the membrane insert, transfer the intestinal mucosa into a beaker containing 25 milliliters of 35%ethanol, and incubate for 10 minutes. After dehydration in increasing ethanol concentrations, place the samples in 50 milliliters of xylene or a histological clearing agent for 10 to 20 minutes.Once the samples are transparent, place them in a metal tissue cassette holder and submerge them in liquid paraffin inside a heated machine. After 45 minutes, use a microtome to cut four micron sections. Place the cut section on the slides and dry them in an oven at 37 degrees Celsius for 24 hours.An acceptable 3-D intestinal equivalent mucosa model consists of Caco-2 cells formed in a tight and regular monolayer above the extracellular-matrix-rich lamina propria. Unacceptable models include those showing excessive growth, disorganized epithelial layers, malformation or lack of epithelial layer formation. The proinflammatory effect of wheat protein with a high gluten content disrupted the cellular monolayer and reduced the thickness of the epithelial layer compared to the control group.The occludin protein content was significantly higher in the control group than in the group exposed to gluten protein. CD14 and CD11b staining of U937 monocytes showed that wheat protein with a high gluten content activated the monocytes, and induced their migration and differentiation into macrophages. Under the lipopolysaccharide challenge, Caco-2 cells increased mucus production and the release of the inflammatory marker midkine.