Name: מחבר זרקור: חקירת ההשפעות של תרכובות על רקמת המעי באמצעות מודלים תלת-ממדיים של קו תאים אנושיים
Uploaded: 2023-09-01T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Investigating the Effects of Compounds on Intestinal Tissue Using 3D Human Cell Line Models at JoVE.com

תודה לקרן אומברטו ורונסי על מלגה התומכת בעבודת חוקר.

1. הכנת מודל רירית המעי המשוחזר התלת-ממדי הבסיסי
הערה: ההליך כולו חייב להתבצע במכסה מנוע זרימה למינרית סטרילית. כל השלבים בהליך השימוש באינקובטור התא מסמנים כי תרביות מודגרות ב -37 מעלות צלזיוס באטמוספירה לחה המכילה 5% CO2 (אלא אם צוין אחרת בפרוטוקול).
<ol><li>הכנה מוקד?...

בניית מודל רירית מעי תלת מימדית עם שיבוץ פרפין

<ol>
	<li>Chelakkot, C., Ghim, J., Ryu, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+regulating+intestinal+barrier+integrity+and+its+pathological+implications.">Mechanisms regulating intestinal barrier integrity and its pathological implications.</a> Experimental &amp; Molecular Medicine. 50 (8), 1-9 (2018).</li><li>Schoultz, I., Keita, &. #. 1. 9. 7. ;. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+intestinal+barrier+and+current+techniques+for+the+assessment+of+gut+permeability.">The intestinal barrier and current techniques for the assessment of gut permeability.</a> Cells. 9 (8), 1909 (1909).</li><li>Bednarek, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+methods+for+measuring+the+permeability+of+cell+monolayers.">In vitro methods for measuring the permeability of cell monolayers.</a> Methods and Protocols. 5 (1), 17 (2022).</li><li>Suzuki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+intestinal+barrier+by+nutrients:+The+role+of+tight+junctions.">Regulation of the intestinal barrier by nutrients: The role of tight junctions.</a> Animal Science Journal. 91 (1), e13357 (2020).</li><li>Guibourdenche, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Food+contaminants+effects+on+an+in+vitro+model+of+human+intestinal+epithelium.">Food contaminants effects on an in vitro model of human intestinal epithelium.</a> Toxics. 9 (6), 135 (2021).</li><li>Panwar, S., Sharma, S., Tripathi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+barrier+integrity+and+dysfunctions+in+maintaining+the+healthy+gut+and+their+health+outcomes.">Role of barrier integrity and dysfunctions in maintaining the healthy gut and their health outcomes.</a> Frontiers in Physiology. 12, 715611 (2021).</li><li>Truzzi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pro-inflammatory+effect+of+gliadins+and+glutenins+extracted+from+different+wheat+cultivars+on+an+in+vitro+3D+intestinal+epithelium+model.">Pro-inflammatory effect of gliadins and glutenins extracted from different wheat cultivars on an in vitro 3D intestinal epithelium model.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (1), 172 (2020).</li><li>Fedi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+models+replicating+the+human+intestinal+epithelium+for+absorption+and+metabolism+studies:+A+systematic+review.">In vitro models replicating the human intestinal epithelium for absorption and metabolism studies: A systematic review.</a> Journal of Controlled Release. 335, 247-268 (2021).</li><li>De Fazio, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Necrotizing+enterocolitis:+Overview+on+in+vitro+models.">Necrotizing enterocolitis: Overview on in vitro models.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (13), 6761 (2021).</li><li>Jubelin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+in+vitro+culture+models+in+oncology+research.">Three-dimensional in vitro culture models in oncology research.</a> Cell &amp; Bioscience. 12 (1), 155 (2022).</li><li>Russell, W., Burch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+principles+of+humane+experimental+technique.">The principles of humane experimental technique.</a> Available online. , (2023).</li><li>Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+it+time+for+reviewer+3+to+request+human+organ+chip+experiments+instead+of+animal+validation+studies.">Is it time for reviewer 3 to request human organ chip experiments instead of animal validation studies.</a> Advanced Science. 7 (22), 2002030 (2020).</li><li>Jung, S. M., Kim, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+models+of+the+small+intestine+for+studying+intestinal+diseases.">In vitro models of the small intestine for studying intestinal diseases.</a> Frontiers in Microbiology. 12, 767038 (2022).</li><li>Nitsche, K. S., M&#252;ller, I., Malcomber, S., Carmichael, P. L., Bouwmeester, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implementing+organ-on-chip+in+a+next-generation+risk+assessment+of+chemicals:+a+review.">Implementing organ-on-chip in a next-generation risk assessment of chemicals: a review.</a> Archives of Toxicology. 96 (3), 711-741 (2022).</li><li>Kekilli, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Midkine+level+may+be+used+as+a+noninvasive+biomarker+in+Crohn's+disease.">Midkine level may be used as a noninvasive biomarker in Crohn's disease.</a> Turkish Journal of Medical Sciences. 50, 324-329 (2020).</li><li>Truzzi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spermidine-eugenol+supplement+preserved+inflammation-challenged+intestinal+cells+by+stimulating+autophagy.">Spermidine-eugenol supplement preserved inflammation-challenged intestinal cells by stimulating autophagy.</a> International Journal of Molecular Sciences. 24 (4), 4131 (2023).</li><li>Truzzi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Are+supplements+safe?+Effects+of+gallic+and+ferulic+acids+on+in+vitro+cell+models.">Are supplements safe? Effects of gallic and ferulic acids on in vitro cell models.</a> Nutrients. 12 (6), 1591 (2020).</li><li>Buckley, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualisation+of+multiple+tight+junctional+complexes+in+human+airway+epithelial+cells.">Visualisation of multiple tight junctional complexes in human airway epithelial cells.</a> Biological Procedures. Online. 20, 3 (2018).</li><li>Ghosh, R., Gilda, J. E., Gomes, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+necessity+of+and+strategies+for+improving+confidence+in+the+accuracy+of+western+blots.">The necessity of and strategies for improving confidence in the accuracy of western blots.</a> Expert Review of Proteomics. 11 (5), 549-560 (2014).</li></ol>

מערכת המודל הבסיסית המשוחזרת של רירית המעי המוצגת כאן (איור 6) משלבת מורכבות פיזיולוגית (תרביות תאים תלת-ממדיות רלוונטיות יותר מבחינה פיזיולוגית המכילות שכבה חד-שכבתית Caco-2 עם תמיכה עשירה ב-ECM lamina propria המכילה פיברובלסטים ומונוציטים) עם פשטות ניסיונית (שימוש בקווי תאים אנושי?...

מחסום האפיתל של המעי, רירית פנימית בעובי תא אחד המכילה סוגים שונים של תאי אפיתל, מהווה את מחסום ההגנה הפיזי הראשון או ממשק בין הסביבה החיצונית והפנימית של הגוף 1,2. אנטרוציטים מסוג עמודה מהווים את הסוג הנפוץ ביותר של תאי אפיתל. אלה אחראים לשמירה על שלמות מחסום האפיתל באמצעות אינטראקציות בין מספר רכיבי מחסום, כולל צמתים הדוקים (TJs), הממלאים תפקיד משמעותי בהידוק מחסום 1,3. מבנה TJ מורכב מחלבוני פלאק תוך-תאיים, כגון zonula occludens (ZO) ו-cingulin, המשתפים פעולה עם חלבונים טרנסממברנליים, כולל אוקלודינים, קלאודינים ומולקולות היצמדות צמתיות (JAMs) היוצרות מבנה דמוי רוכסן המקשר בחוזקה בין התאים השכנים 3,4. החלבונים הטרנסממברנליים מווסתים את הדיפוזיה הפארא-תאית הפסיבית של תרכובות קטנות ואינם כוללים מולקולות גדולות רעילות.
תרכובות מזון רעילות פוטנציאליות ומזהמי מזון מעוררים ייצור ציטוקינים דלקתיים המשבשים את חדירות האפיתל, מפעילים את תאי החיסון וגורמים לדלקת כרונית ברקמת המעי 5,6,7. לעומת זאת, פיטוכימיקלים נוגדי חמצון ואנטי דלקתיים שונים דווחו כמפחיתים את ביטוי הציטוקינים הדלקתיים ומשפרים את שלמות מחסום TJ במעי באמצעות שיקום ביטוי והרכבה של חלבון TJ 4,6,8. לפיכך, הרגולציה של שלמות מחסום האפיתל על ידי תרכובות מועילות ומזיקות כאחד ראתה עלייה בשימוש הן במודלים in vivo והן במודלים במבחנה שמטרתם לחקות את מחסום המעי לבדיקות סקר תרופתיות ומחקרי רעילות. זה רלוונטי במיוחד לאור העניין הגובר בהבנת הפתופיזיולוגיה של מחלות מעיים (IBD), אנטרוקוליטיס נמקית וסרטן, שניתן לדמות במודלים ניסיוניים 8,9,10.
יש ביקוש לפיתוח מודלים מבוססי תאים במבחנה על מנת להשיג את המטרה של "3Rs" בניסויים בבעלי חיים. אלה כוללים חלופות חלופיות לשימוש בבעלי חיים, צמצום מספר בעלי החיים בשימוש, ועידון באימוץ שיטות להקלת מצוקה 11,12,13. יתר על כן, המנגנונים המולקולריים, התאיים והפיזיולוגיים הבסיסיים בין מודלים אנושיים ומורין (מכרסמים הם המין הנפוץ ביותר) הם ייחודיים, מה שמוביל למחלוקת לגבי יעילותם של המודלים המורין כמנבאים בתגובות אנושיות12,13. יתרונות רבים של מודלים של קו תאים אנושי במבחנה כוללים ניסויים מוגבלי מטרה, תצפית ישירה וניתוח רציף13.
חד-שכבות מסוג תא בודד בתרביות דו-ממדיות (דו-ממדיות) שימשו כמודלים רבי עוצמה. עם זאת, אלה אינם יכולים לשחזר במדויק את המורכבות הפיזיולוגית של רקמות אנושיות 8,13,14. כתוצאה מכך, מערכות תרבית תלת-ממדיות מפותחות עם שיפורים הולכים וגדלים כדי לשחזר את המורכבות הפיזיולוגית של רקמות מעיים בריאות וחולות כאחד כארגזי כלים להערכת סיכונים של הדור הבא13,14. מודלים אלה כוללים פיגומים תלת-ממדיים של Transwell עם קווי תאים מגוונים, תרביות אורגנואידים והתקנים מיקרופלואידים (מעי-על-שבב) המשתמשים הן בקווי תאים והן באורגנואידים (שמקורם הן ברקמות בריאות והן ברקמות חולות)8,13,14.
פרוטוקול המקבילה התלת-ממדי של "רקמה בריאה" במעי שהוצג במחקר הנוכחי התבסס על מציאת איזון בין מורכבות פיזיולוגית לבין פשטות ניסויית13. המודל מייצג פיגום טרנסוול תלת-ממדי, המורכב משלושה קווי תאים (אנטרוציטים [קו אדנוקרצינומה Caco-2 של המעי הגס הסטנדרטי בזהב] עם מרכיב חיסוני תומך [מונוציטים U937 ופיברובלסטים L929]), המהווים מערכת מתוקננת וניתנת לחזרה בקלות הישימה לסינון ראשוני של מולקולות תזונתיות בעלות עניין על שלמות מחסום האפיתל של המעי ותגובה חיסונית. הפרוטוקול כולל הטמעת פרפין להערכה מיקרוסקופית קלה של שלמות מחסום האפיתל באמצעות מקבילות מעי קבועות. היתרון של הגישה הנוכחית הוא שניתן לגרום לחלקים רבים של הרקמות המשובצות להכתים עבור פרמטרים מרובים מניסוי יחיד.

basic three-dimensional (3d) intestinal model system with an immune component

חלה עלייה בשימוש במודלים של מעיים in vivo ו - in vitro לחקר הפתופיזיולוגיה של מחלות מעיים דלקתיות, לסינון פרמקולוגי של חומרים שעשויים להיות מועילים, ולמחקרי רעילות על רכיבי מזון שעלולים להיות מזיקים. רלוונטיות, קיים כיום ביקוש לפיתוח מודלים מבוססי תאים במבחנה שיחליפו מודלים של בעלי חיים. כאן, פרוטוקול למודל תלת-ממדי תלת-ממדי (3D) תלת-ממדי בסיסי של "רקמה בריאה" באמצעות קווי תאים מוצג עם היתרון הכפול של מתן פשטות ניסיונית (מערכת מתוקננת וניתנת לחזרה בקלות) ומורכבות פיזיולוגית (אנטרוציט Caco-2 עם מרכיב חיסוני תומך של מונוציטים U937 ופיברובלסטים L929). הפרוטוקול כולל גם הטבעה של פרפין להערכה מיקרוסקופית קלה של מקבילות מעיים קבועות, ובכך מספק את היתרון של ניתוח פרמטרים חזותיים מרובים מניסוי יחיד. חלקים מוכתמים של Hematoxylin ו-eosin (H&E) המראים את תאי העמוד Caco-2 היוצרים שכבה חד-שכבתית הדוקה וסדירה בטיפולי בקרה משמשים לאימות יעילות המודל כמערכת ניסויית. שימוש בגלוטן כמרכיב מזון פרו-דלקתי, פרמטרים שנותחו מקטעים כוללים ירידה בעובי החד-שכבתי, כמו גם הפרעה וניתוק מהמטריצה הבסיסית (H&E), ירידה בביטוי חלבון בצומת הדוק כפי שמוצג מצביעת אוקלודין (ניתן לכימות סטטיסטי), והפעלת מערכת החיסון של תאי U937 נודדים כפי שניתן לראות מצביעת צביעת צביעת התמיינות 14 (CD14) והתמיינות הקשורה ל- CD11b למקרופאגים. כפי שניתן לראות על ידי שימוש בליפופוליסכריד כדי לדמות דלקת מעיים, פרמטרים נוספים שניתן למדוד הם צביעת ריר מוגברת וביטוי ציטוקינים (כגון מידקין) שניתן להפיק מהמדיום לפני הקיבוע. ניתן להמליץ על מודל תלת מימדי (3D) בסיסי של רירית המעי ומקטעים קבועים למחקרי סטטוס דלקתי ותקינות מחסום עם אפשרות לנתח פרמטרים חזותיים מרובים הניתנים לכימות חזותי.

The intestinal epithelial barrier, a one-cell-thick internal lining containing different types of epithelial cells, constitutes the first physical defensive barrier or interface between the outside and the internal milieu of the body1,2. Columnar-type enterocytes constitute the most abundant type of epithelial cells. These are&#160;responsible for maintaining epithelial barrier integrity through interactions between several barrier components, including tight junctions (TJs), playing a significant role in barrier tightening1,3. The TJ structure consists of intracellular plaque proteins, such as zonula occludens (ZO) and cingulin, cooperating with transmembrane proteins, including occludins, claudins, and junctional adhesion molecules (JAMs) that form zipper-like structure tightly linking the neighboring cells3,4. The transmembrane proteins regulate the passive paracellular diffusion of small compounds and exclude toxic large molecules.
Potentially toxic food compounds and food contaminants stimulate inflammatory cytokine production that disrupts the epithelial permeability, activating immune cells and causing chronic intestinal tissue inflammation5,6,7. In contrast, various anti-oxidant and anti-inflammatory phytochemicals have been reported to reduce inflammatory cytokine expression and enhance intestinal TJ barrier integrity through the restoration of TJ protein expression and assembly4,6,8. Hence, the regulation of epithelial barrier integrity by both beneficial and harmful compounds has seen an increase in the use of both in vivo and in vitro models aimed at mimicking the intestinal barrier for pharmaceutical screening and toxicity studies. This is particularly relevant given the increasing interest in understanding the pathophysiology of intestinal bowel diseases (IBD), necrotizing enterocolitis, and cancer, which can be simulated in experimental models8,9,10.
There has been a demand for the development of cell-based in vitro models in order to achieve the objective of the &#8220;3Rs&#8221; in animal testing. These include replacement alternatives to the use of animals, reduction in the number of animals used, and refinement in adopting methods that alleviate distress11,12,13. Moreover, the underlying molecular, cellular, and physiological mechanisms between human and murine models (rodents being the most widely used species) are distinctive, leading to controversy regarding the efficacy of the murine models as predictors in human responses12,13. Numerous advantages of in vitro human cell-line models include target-restricted experimentation, direct observation, and continuous analysis13.
Single-cell-type monolayers in two-dimensional (2D) cultures have served as powerful models. However, these cannot precisely reproduce the physiological complexity of human tissues8,13,14. As a result, 3D&#160;culture systems are being developed with ever-increasing improvements to recapitulate the physiological complexity of both healthy and diseased intestinal tissues as next-generation risk assessment toolboxes13,14. These models include 3D Transwell scaffolds with diverse cell lines, organoid cultures, and microfluidic devices (intestine-on-chip) using both cell lines and organoids (derived from both healthy and diseased tissues)8,13,14.&#160;
The 3D &#8220;healthy tissue&#8221; intestinal equivalent protocol presented in the present study was based on striking a balance between physiological complexity and experimental simplicity13. The model is representative of a 3D Transwell scaffold, comprised of three cell lines (enterocytes [the gold-standard colon adenocarcinoma Caco-2 line] with a supporting immune component [U937 monocytes and L929 fibroblasts]), constituting a standardized and easily repeatable system applicable for the preliminary screening of dietary molecules of interest on intestinal epithelial barrier integrity and immune response. The protocol includes paraffin embedding for light microscopic evaluation of epithelial barrier integrity using fixed intestinal equivalents. The advantage of the present approach is that numerous sections of the embedded tissues can be made to stain for multiple parameters from a single experiment.

מחבר זרקור: חקירת ההשפעות של תרכובות על רקמת המעי באמצעות מודלים תלת-ממדיים של קו תאים אנושיים 

מערכת מודל מעי תלת-ממדית בסיסית (3D) עם מרכיב חיסוני

The scope of the work is to use these in vitro three-dimensional human cell line models to investigate the fact of beneficial as well as helpful compounds on intestinal tissue. The models can be used to further research understanding and also as a basic drug model. Using the plant-derived compounds, spermidine and eugenol, both separately and together in supplement form, we measure beneficial increases in autophagy and decreases in inflammation using these models.Then we will also able to show the potentially harmful effect of gluten extracted from certain wheat varieties on intestinal tissues. We are currently using economically priced, standardized, and easily repeatable in vitro system that better reflect the physiology of the human intestine as an alternative to animal models. Since we also use commercial human cell line rather than plant-derived cells, the responses from the study are more applicable to the general population.The protocol is based entirely on the use of different lines. These renders the model most standardized and reproducible. Furthermore, the simultaneous cultivation of different cell lines, enterocytes, fibroblasts, and immune system cells, allows for cellular responses that are closer to what happens in the patient.

ההיבט החשוב הראשון הוא לקבוע את הקבילות של רירית המעי הבסיסית 3D שווה ערך למטרות ניסיוני. זה מבוצע עם הכתם הנפוץ ביותר במעבדות היסטולוגיה והיסטופתולוגיה, כלומר hematoxylin (כתמים חומר גרעיני צבע כחול סגול עמוק) ו eosin (כתמים חומר ציטופלזמי גוונים משתנים של ורוד). צביעת H&E מבוצעת תחילה בביקורת לא מט?...

Watch this Scientific Journal Video about Investigating the Effects of Compounds on Intestinal Tissue Using 3D Human Cell Line Models at JoVE.com

כאן אנו מתארים בניית מערכת מודל בסיסית תלת ממדית (3D) של קו תאי מעי ופרוטוקול הטמעת פרפין להערכה מיקרוסקופית קלה של מקבילות מעיים קבועות. צביעה של חלבונים נבחרים מאפשרת ניתוח של פרמטרים חזותיים מרובים מניסוי יחיד לשימוש פוטנציאלי במחקרי סינון תרופות פרה-קליניים.

There has been an increase in the use of in vivo and in vitro intestinal models to study the pathophysiology of inflammatory intestinal diseases, for the ...

היקף העבודה הוא להשתמש במודלים תלת-ממדיים אלה של קו תאים אנושיים במבחנה כדי לחקור את העובדה של תרכובות מועילות כמו גם מועילות על רקמת המעי. המודלים יכולים לשמש להעמקת ההבנה המחקרית וגם כמודל תרופתי בסיסי. באמצעות התרכובות הצמחיות, ספרמידין ואאוג'נול, בנפרד וביחד בצורת תוספים, אנו מודדים עליות מועילות באוטופגיה וירידה בדלקת באמצעות מודלים אלה.אז נוכל גם להראות את ההשפעה המזיקה הפוטנציאלית של גלוטן המופק מזני חיטה מסוימים על רקמות המעי. אנו משתמשים כיום במערכת חוץ גופית במחיר כלכלי, סטנדרטית וניתנת לחזרה בקלות המשקפת טוב יותר את הפיזיולוגיה של המעי האנושי כחלופה למודלים של בעלי חיים. מאחר שאנו משתמשים גם בקו תאים אנושי מסחרי ולא בתאים שמקורם בצמח, התגובות מהמחקר ישימות יותר לאוכלוסייה הכללית.הפרוטוקול מבוסס כולו על שימוש בקווים שונים. אלה הופכים את המודל לסטנדרטי ביותר וניתן לשחזור. יתר על כן, טיפוח בו זמנית של קווי תאים שונים, אנטרוציטים, פיברובלסטים ותאי מערכת החיסון, מאפשר תגובות תאיות קרובות יותר למה שקורה אצל המטופל.

basic-three-dimensional-3d-intestinal-model-system-with-an-immune

Research

JoVE Journal

Biology

Basic Three-Dimensional (3D) Intestinal Model System with an Immune Component

There has been an increase in the use of in vivo and in vitro intestinal models to study the pathophysiology of inflammatory intestinal diseases, for the pharmacological screening of potentially beneficial substances, and for toxicity studies on potentially harmful food components. Of relevance, there is a current demand for the development of cell-based in vitro models to substitute animal models. Here, a protocol for a basic, &#8220;healthy tissue&#8221; three-dimensional (3D) intestinal equivalent model using cell lines is presented with the dual benefit of providing both experimental simplicity (standardized and easily repeatable system) and physiological complexity (Caco-2 enterocytes with a supporting immune component of U937 monocytes and L929 fibroblasts). The protocol also includes paraffin embedding for light microscopic evaluation of fixed intestinal equivalents, thereby providing the advantage of analyzing multiple visual parameters from a single experiment. Hematoxylin and eosin (H&#38;E) stained sections showing the Caco-2 columnar cells forming a tight and regular monolayer in control treatments are used to verify the efficacy of the model as an experimental system. Using gluten as a pro-inflammatory food component, parameters analyzed from sections include reduced monolayer thickness, as well as disruption and detachment from the underlying matrix (H&#38;E), decreased tight junction protein expression as shown from occludin staining (quantifiable statistically), and immune-activation of migrating U937 cells as evidenced from the cluster of differentiation 14 (CD14) staining and CD11b-related differentiation into macrophages. As shown by using lipopolysaccharide to simulate intestinal inflammation, additional parameters that can be measured are increased mucus staining and cytokine expression (such as midkine) that can be extracted from the medium prior to fixation. The basic three-dimensional (3D) intestinal mucosa model and fixed sections can be recommended for inflammatory status and barrier integrity studies with the possibility of analyzing multiple visual quantifiable parameters.

Here we describe constructing a basic three-dimensional (3D) intestinal cell line model system and a paraffin embedding protocol for light microscopic evaluation of fixed intestinal equivalents. Staining of selected proteins permits the analysis of multiple visual parameters from a single experiment for potential use in preclinical drug screening studies.

Preparation of a Basic 3D Reconstructed Intestinal Mucosa Model for Microscopic Evaluation of Fixed Intestinal Equivalents

To begin, select a 24-well plate containing inserts with 0.4 micron filters. Using a pipette, add 500 microliters of HBSS below and above the filter inserts. Then close the multi-well plate and place it in an incubator for two hours.After incubation, carefully aspirate the HBSS from the plate. Prepare a cell-free collagen solution in a sterile 50 milliliter tube in DMEM on ice. Add 250 microliters of collagen above the membrane filter and place the lid on the plate.Allow the solution to polymerize at room temperature. Next, remove the L-929 fibroblast cell culture from the incubator. Add two milliliters of a pre-warmed trypsin EDTA solution to the flask and place it in an incubator for three to five minutes.Transfer the cell suspension to a sterile 15 milliliter tube and centrifuge at 645 G for five minutes. Using a vacuum pump, aspirate the supernatant and resuspend the pellet in one milliliter of DMEM. Add 20 microliters of cell suspension into a tube containing 20 microliters of Trypan Blue solution.And use a cell counting chamber to evaluate the cell density. Next, remove the U-937 monocyte cell culture from the incubator. Centrifuge the cell suspension and resuspend the pellet in one milliliter of RPMI.After ensuring cells are homogeneously suspended, count them using a cell counting chamber. Next, prepare cell suspensions containing 50, 000 L-929 and 15, 000 U-937 cells respectively in 50 microliters of DMEM. Add each 50 microliter cell suspension to 450 microliters of collagen and mix thoroughly.Overlay the pre-coded cell-free lamina propria with 500 microliters of the collagen cell solution. Close the plate and place it in an incubator for two hours to allow the solution to set. Next, remove the Caco-2 cell culture from the incubator.Using a vacuum pump, aspirate the medium and rinse the cells with 10 milliliters of PBS. Add five milliliters of PBS trypsin EDTA solution and place it in an incubator for five to eight minutes. Then centrifuge the cell suspension and resuspend the pellet in one milliliter of DMEM.After counting, prepare a cell suspension containing 150, 000 Caco-2 cells in 50 microliters of DMEM. Place the plate in a laminar flow hood for 10 minutes before transferring it to the incubator. After 30 minutes, add 500 microliters of the DMEM above the reconstructed model and 500 microliters below the filter and return the plate to the incubator.The next day, carefully replace the medium with 500 microliters of fresh DMEM above and below the filter respectively.

הכנת מודל תלת ממדי בסיסי משוחזר של רירית המעי להערכה מיקרוסקופית של מקבילות מעי קבועות

Paraffin Embedding of a Basic 3D Reconstructed Intestinal Mucosa Model for Immune-Histochemical Staining

For paraffin embedding of cells, set the paraffin machine to 58 degrees Celsius. Using pliers, transfer the membrane inserts to clean wells of a sterile 24-well plate. Add 500 microliters of 37%buffered formalin and PBS above the filter, and one milliliter below the filter.Close the lid and leave the plate in a fume hood for two hours. Once the lamina propria is detached from the membrane insert, transfer the intestinal mucosa into a beaker containing 25 milliliters of 35%ethanol, and incubate for 10 minutes. After dehydration in increasing ethanol concentrations, place the samples in 50 milliliters of xylene or a histological clearing agent for 10 to 20 minutes.Once the samples are transparent, place them in a metal tissue cassette holder and submerge them in liquid paraffin inside a heated machine. After 45 minutes, use a microtome to cut four micron sections. Place the cut section on the slides and dry them in an oven at 37 degrees Celsius for 24 hours.An acceptable 3-D intestinal equivalent mucosa model consists of Caco-2 cells formed in a tight and regular monolayer above the extracellular-matrix-rich lamina propria. Unacceptable models include those showing excessive growth, disorganized epithelial layers, malformation or lack of epithelial layer formation. The proinflammatory effect of wheat protein with a high gluten content disrupted the cellular monolayer and reduced the thickness of the epithelial layer compared to the control group.The occludin protein content was significantly higher in the control group than in the group exposed to gluten protein. CD14 and CD11b staining of U937 monocytes showed that wheat protein with a high gluten content activated the monocytes, and induced their migration and differentiation into macrophages. Under the lipopolysaccharide challenge, Caco-2 cells increased mucus production and the release of the inflammatory marker midkine.