Name: लेखक स्पॉटलाइट: 3 डी मानव सेल लाइन मॉडल का उपयोग कर आंतों के ऊतकों पर यौगिकों के प्रभाव की जांच
Uploaded: 2023-09-01T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Investigating the Effects of Compounds on Intestinal Tissue Using 3D Human Cell Line Models at JoVE.com

शोधकर्ता के काम का समर्थन करने वाली फैलोशिप के लिए अम्बर्टो वेरोनेसी फाउंडेशन के लिए धन्यवाद।

1. बुनियादी 3 डी पुनर्निर्मित आंतों के श्लेष्म मॉडल की तैयारी
नोट: पूरी प्रक्रिया एक बाँझ लामिना का प्रवाह हुड में किया जाना चाहिए. सेल इनक्यूबेटर के उपयोग से जुड़े प्रक्रिया के सभी चरण दर्शात?...

पैराफिन एम्बेडिंग के साथ एक 3 डी आंतों म्यूकोसा मॉडल का निर्माण

<ol>
	<li>Chelakkot, C., Ghim, J., Ryu, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+regulating+intestinal+barrier+integrity+and+its+pathological+implications.">Mechanisms regulating intestinal barrier integrity and its pathological implications.</a> Experimental &amp; Molecular Medicine. 50 (8), 1-9 (2018).</li><li>Schoultz, I., Keita, &. #. 1. 9. 7. ;. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+intestinal+barrier+and+current+techniques+for+the+assessment+of+gut+permeability.">The intestinal barrier and current techniques for the assessment of gut permeability.</a> Cells. 9 (8), 1909 (1909).</li><li>Bednarek, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+methods+for+measuring+the+permeability+of+cell+monolayers.">In vitro methods for measuring the permeability of cell monolayers.</a> Methods and Protocols. 5 (1), 17 (2022).</li><li>Suzuki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+intestinal+barrier+by+nutrients:+The+role+of+tight+junctions.">Regulation of the intestinal barrier by nutrients: The role of tight junctions.</a> Animal Science Journal. 91 (1), e13357 (2020).</li><li>Guibourdenche, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Food+contaminants+effects+on+an+in+vitro+model+of+human+intestinal+epithelium.">Food contaminants effects on an in vitro model of human intestinal epithelium.</a> Toxics. 9 (6), 135 (2021).</li><li>Panwar, S., Sharma, S., Tripathi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+barrier+integrity+and+dysfunctions+in+maintaining+the+healthy+gut+and+their+health+outcomes.">Role of barrier integrity and dysfunctions in maintaining the healthy gut and their health outcomes.</a> Frontiers in Physiology. 12, 715611 (2021).</li><li>Truzzi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pro-inflammatory+effect+of+gliadins+and+glutenins+extracted+from+different+wheat+cultivars+on+an+in+vitro+3D+intestinal+epithelium+model.">Pro-inflammatory effect of gliadins and glutenins extracted from different wheat cultivars on an in vitro 3D intestinal epithelium model.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (1), 172 (2020).</li><li>Fedi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+models+replicating+the+human+intestinal+epithelium+for+absorption+and+metabolism+studies:+A+systematic+review.">In vitro models replicating the human intestinal epithelium for absorption and metabolism studies: A systematic review.</a> Journal of Controlled Release. 335, 247-268 (2021).</li><li>De Fazio, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Necrotizing+enterocolitis:+Overview+on+in+vitro+models.">Necrotizing enterocolitis: Overview on in vitro models.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (13), 6761 (2021).</li><li>Jubelin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+in+vitro+culture+models+in+oncology+research.">Three-dimensional in vitro culture models in oncology research.</a> Cell &amp; Bioscience. 12 (1), 155 (2022).</li><li>Russell, W., Burch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+principles+of+humane+experimental+technique.">The principles of humane experimental technique.</a> Available online. , (2023).</li><li>Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+it+time+for+reviewer+3+to+request+human+organ+chip+experiments+instead+of+animal+validation+studies.">Is it time for reviewer 3 to request human organ chip experiments instead of animal validation studies.</a> Advanced Science. 7 (22), 2002030 (2020).</li><li>Jung, S. M., Kim, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+models+of+the+small+intestine+for+studying+intestinal+diseases.">In vitro models of the small intestine for studying intestinal diseases.</a> Frontiers in Microbiology. 12, 767038 (2022).</li><li>Nitsche, K. S., M&#252;ller, I., Malcomber, S., Carmichael, P. L., Bouwmeester, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implementing+organ-on-chip+in+a+next-generation+risk+assessment+of+chemicals:+a+review.">Implementing organ-on-chip in a next-generation risk assessment of chemicals: a review.</a> Archives of Toxicology. 96 (3), 711-741 (2022).</li><li>Kekilli, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Midkine+level+may+be+used+as+a+noninvasive+biomarker+in+Crohn's+disease.">Midkine level may be used as a noninvasive biomarker in Crohn's disease.</a> Turkish Journal of Medical Sciences. 50, 324-329 (2020).</li><li>Truzzi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spermidine-eugenol+supplement+preserved+inflammation-challenged+intestinal+cells+by+stimulating+autophagy.">Spermidine-eugenol supplement preserved inflammation-challenged intestinal cells by stimulating autophagy.</a> International Journal of Molecular Sciences. 24 (4), 4131 (2023).</li><li>Truzzi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Are+supplements+safe?+Effects+of+gallic+and+ferulic+acids+on+in+vitro+cell+models.">Are supplements safe? Effects of gallic and ferulic acids on in vitro cell models.</a> Nutrients. 12 (6), 1591 (2020).</li><li>Buckley, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualisation+of+multiple+tight+junctional+complexes+in+human+airway+epithelial+cells.">Visualisation of multiple tight junctional complexes in human airway epithelial cells.</a> Biological Procedures. Online. 20, 3 (2018).</li><li>Ghosh, R., Gilda, J. E., Gomes, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+necessity+of+and+strategies+for+improving+confidence+in+the+accuracy+of+western+blots.">The necessity of and strategies for improving confidence in the accuracy of western blots.</a> Expert Review of Proteomics. 11 (5), 549-560 (2014).</li></ol>

बुनियादी पुनर्निर्मित आंतों के श्लेष्म मॉडल प्रणाली यहाँ प्रस्तुत (चित्रा 6) प्रयोगात्मक सादगी के साथ शारीरिक जटिलता (अधिक शारीरिक रूप से प्रासंगिक 3 डी सेल संस्कृतियों एक ईसीएम अमीर लामिन...

आंतों के उपकला बाधा, एक कोशिका-मोटी आंतरिक अस्तर जिसमें विभिन्न प्रकार की उपकला कोशिकाएं होती हैं, शरीर के बाहर और आंतरिक परिवेश 1,2 के बीच पहली शारीरिक रक्षात्मक बाधा या इंटरफ़ेस का गठन करती है। स्तंभ-प्रकार के एंटरोसाइट्स उपकला कोशिकाओं के सबसे प्रचुर प्रकार का गठन करते हैं। ये तंग जंक्शनों (टीजे) सहित कई बाधा घटकों के बीच बातचीत के माध्यम से उपकला बाधा अखंडता को बनाए रखने के लिए जिम्मेदार हैं, जो बाधाकसने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं 1,3. टीजे संरचना में इंट्रासेल्युलर पट्टिका प्रोटीन होते हैं, जैसे ज़ोनुला ऑक्लुडेंस (जेडओ) और सिंगुलिन, ट्रांसमेम्ब्रेन प्रोटीन के साथ सहयोग करते हैं, जिसमें ऑक्लुडिन, क्लॉडिन और जंक्शनल आसंजन अणु (जेएएम) शामिल हैं जो जिपर जैसी संरचना बनाते हैं जो पड़ोसी कोशिकाओंको 3,4 से जोड़ते हैं। ट्रांसमेम्ब्रेन प्रोटीन छोटे यौगिकों के निष्क्रिय पैरासेल्युलर प्रसार को नियंत्रित करते हैं और जहरीले बड़े अणुओं को बाहर करते हैं।
संभावित विषाक्त खाद्य यौगिकों और खाद्य संदूषक भड़काऊ साइटोकिन उत्पादन को उत्तेजित करते हैं जो उपकला पारगम्यता को बाधित करता है, प्रतिरक्षा कोशिकाओं को सक्रिय करता है और पुरानी आंतों के ऊतकों की सूजन 5,6,7का कारण बनता है। इसके विपरीत, विभिन्न एंटी-ऑक्सीडेंट और एंटी-इंफ्लेमेटरी फाइटोकेमिकल्स को भड़काऊ साइटोकिन अभिव्यक्ति को कम करने और टीजे प्रोटीन अभिव्यक्ति और असेंबली 4,6,8की बहाली के माध्यम से आंतों के टीजे बाधा अखंडता को बढ़ाने के लिए सूचित किया गया है। इसलिए, लाभकारी और हानिकारक दोनों यौगिकों द्वारा उपकला बाधा अखंडता के विनियमन ने दवा स्क्रीनिंग और विषाक्तता अध्ययन के लिए आंतों की बाधा की नकल करने के उद्देश्य से विवो और इन विट्रो मॉडल दोनों के उपयोग में वृद्धि देखी है। यह विशेष रूप से आंतों के आंत्र रोगों (आईबीडी), नेक्रोटाइज़िंग एंटरोकोलाइटिस और कैंसर के पैथोफिज़ियोलॉजी को समझने में बढ़ती रुचि को देखते हुए प्रासंगिक है, जिसे प्रयोगात्मक मॉडल 8,9,10में अनुकरण किया जा सकता है।
पशु परीक्षण में "3 आर" के उद्देश्य को प्राप्त करने के लिए इन विट्रो मॉडल में सेल आधारित के विकास की मांग की गई है। इनमें जानवरों के उपयोग के प्रतिस्थापन विकल्प, उपयोग किए जाने वाले जानवरों की संख्या में कमी और संकट को कम करने वाले तरीकों को अपनाने में शोधन 11,12,13 शामिल हैं। इसके अलावा, मानव और murine मॉडल (कृन्तकों सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल किया प्रजातियों जा रहा है) के बीच अंतर्निहित आणविक, सेलुलर, और शारीरिक तंत्र मानव प्रतिक्रियाओं12,13 में भविष्यवक्ताओं के रूप में murine मॉडल की प्रभावकारिता के बारे में विवाद के लिए अग्रणी, विशिष्ट हैं. इन विट्रो मानव सेल लाइन मॉडल में के कई फायदे लक्ष्य प्रतिबंधित प्रयोग, प्रत्यक्ष अवलोकन, और निरंतर विश्लेषण13 शामिल हैं.
द्वि-आयामी (2 डी) संस्कृतियों में एकल-सेल-प्रकार मोनोलेयर ने शक्तिशाली मॉडल के रूप में कार्य किया है। हालांकि, ये मानव ऊतकों 8,13,14 की शारीरिक जटिलता को ठीक से पुन: पेश नहीं कर सकते हैं। नतीजतन, 3 डी संस्कृति प्रणालियों अगली पीढ़ी के जोखिम मूल्यांकन टूलबॉक्स13,14 के रूप में स्वस्थ और रोगग्रस्त आंतों के ऊतकों दोनों की शारीरिक जटिलता recapitulate करने के लिए कभी बढ़ती सुधार के साथ विकसित किया जा रहा है. इन मॉडलों में सेल लाइनों और ऑर्गेनोइड (स्वस्थ और रोगग्रस्त ऊतकों दोनों से व्युत्पन्न)8,13,14का उपयोग करके विविध सेल लाइनों, ऑर्गेनॉइड संस्कृतियों और माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों (आंत-ऑन-चिप) के साथ 3 डी ट्रांसवेल मचान शामिल हैं।
वर्तमान अध्ययन में प्रस्तुत 3 डी "स्वस्थ ऊतक" आंतों समकक्ष प्रोटोकॉल शारीरिक जटिलता और प्रयोगात्मक सादगी13 के बीच संतुलन बनाने पर आधारित था. मॉडल एक 3 डी ट्रांसवेल मचान का प्रतिनिधि है, जिसमें तीन सेल लाइनें (एंटरोसाइट्स [गोल्ड-स्टैंडर्ड कोलन एडेनोकार्सिनोमा कैको -2 लाइन] एक सहायक प्रतिरक्षा घटक [यू 937 मोनोसाइट्स और एल 929 फाइब्रोब्लास्ट्स] के साथ) शामिल हैं, जो आंतों के उपकला बाधा अखंडता और प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया पर ब्याज के आहार अणुओं की प्रारंभिक जांच के लिए लागू एक मानकीकृत और आसानी से दोहराने योग्य प्रणाली का गठन करते हैं। प्रोटोकॉल निश्चित आंतों समकक्षों का उपयोग कर उपकला बाधा अखंडता के प्रकाश सूक्ष्म मूल्यांकन के लिए पैराफिन एम्बेडिंग भी शामिल है. वर्तमान दृष्टिकोण का लाभ यह है कि एम्बेडेड ऊतकों के कई वर्गों को एक ही प्रयोग से कई मापदंडों के लिए दाग करने के लिए बनाया जा सकता है।

basic three-dimensional (3d) intestinal model system with an immune component

भड़काऊ आंतों के रोगों के पैथोफिज़ियोलॉजी का अध्ययन करने के लिए विवो और इन विट्रो आंतों के मॉडल के उपयोग में वृद्धि हुई है, संभावित लाभकारी पदार्थों की औषधीय जांच के लिए, और संभावित हानिकारक खाद्य घटकों पर विषाक्तता अध्ययन के लिए। प्रासंगिकता की, पशु मॉडल को प्रतिस्थापित करने के लिए इन विट्रो मॉडल में सेल आधारित के विकास के लिए एक वर्तमान मांग है. यहां, सेल लाइनों का उपयोग करके एक बुनियादी, "स्वस्थ ऊतक" त्रि-आयामी (3 डी) आंतों के समकक्ष मॉडल के लिए एक प्रोटोकॉल प्रयोगात्मक सादगी (मानकीकृत और आसानी से दोहराने योग्य प्रणाली) और शारीरिक जटिलता (कैको -2 एंटरोसाइट्स यू 937 मोनोसाइट्स और एल 929 फाइब्रोब्लास्ट के सहायक प्रतिरक्षा घटक के साथ) प्रदान करने के दोहरे लाभ के साथ प्रस्तुत किया गया है। प्रोटोकॉल भी निश्चित आंतों समकक्षों के प्रकाश सूक्ष्म मूल्यांकन के लिए पैराफिन एम्बेडिंग भी शामिल है, जिससे एक ही प्रयोग से कई दृश्य मापदंडों का विश्लेषण करने का लाभ प्रदान करते हैं। हेमेटोक्सिलिन और ईोसिन (एच एंड ई) सना हुआ खंड जो नियंत्रण उपचार में एक तंग और नियमित मोनोलेयर बनाने वाले काको -2 स्तंभ कोशिकाओं को दिखाते हैं, एक प्रयोगात्मक प्रणाली के रूप में मॉडल की प्रभावकारिता को सत्यापित करने के लिए उपयोग किया जाता है। एक समर्थक भड़काऊ खाद्य घटक के रूप में लस का प्रयोग, वर्गों से विश्लेषण मापदंडों कम monolayer मोटाई, साथ ही साथ बाधा और अंतर्निहित मैट्रिक्स (एच एंड ई) से टुकड़ी शामिल हैं, तंग जंक्शन प्रोटीन अभिव्यक्ति में कमी के रूप में occludin धुंधला (quantifiable सांख्यिकीय रूप से) से दिखाया गया है, और प्रतिरक्षा-सक्रियण U937 कोशिकाओं पलायन के रूप में भेदभाव 14 (CD14) धुंधला और मैक्रोफेज में CD11b से संबंधित भेदभाव के क्लस्टर से सबूत के रूप में. जैसा कि आंतों की सूजन का अनुकरण करने के लिए लिपोपॉलेसेकेराइड का उपयोग करके दिखाया गया है, अतिरिक्त पैरामीटर जिन्हें मापा जा सकता है, वे हैं बलगम धुंधला हो जाना और साइटोकिन अभिव्यक्ति (जैसे मिडकिन) में वृद्धि हुई है जिसे निर्धारण से पहले माध्यम से निकाला जा सकता है। बुनियादी त्रि-आयामी (3 डी) आंतों के श्लेष्म मॉडल और निश्चित वर्गों को कई दृश्य मात्रात्मक मापदंडों का विश्लेषण करने की संभावना के साथ भड़काऊ स्थिति और बाधा अखंडता अध्ययन के लिए अनुशंसित किया जा सकता है।

The intestinal epithelial barrier, a one-cell-thick internal lining containing different types of epithelial cells, constitutes the first physical defensive barrier or interface between the outside and the internal milieu of the body1,2. Columnar-type enterocytes constitute the most abundant type of epithelial cells. These are&#160;responsible for maintaining epithelial barrier integrity through interactions between several barrier components, including tight junctions (TJs), playing a significant role in barrier tightening1,3. The TJ structure consists of intracellular plaque proteins, such as zonula occludens (ZO) and cingulin, cooperating with transmembrane proteins, including occludins, claudins, and junctional adhesion molecules (JAMs) that form zipper-like structure tightly linking the neighboring cells3,4. The transmembrane proteins regulate the passive paracellular diffusion of small compounds and exclude toxic large molecules.
Potentially toxic food compounds and food contaminants stimulate inflammatory cytokine production that disrupts the epithelial permeability, activating immune cells and causing chronic intestinal tissue inflammation5,6,7. In contrast, various anti-oxidant and anti-inflammatory phytochemicals have been reported to reduce inflammatory cytokine expression and enhance intestinal TJ barrier integrity through the restoration of TJ protein expression and assembly4,6,8. Hence, the regulation of epithelial barrier integrity by both beneficial and harmful compounds has seen an increase in the use of both in vivo and in vitro models aimed at mimicking the intestinal barrier for pharmaceutical screening and toxicity studies. This is particularly relevant given the increasing interest in understanding the pathophysiology of intestinal bowel diseases (IBD), necrotizing enterocolitis, and cancer, which can be simulated in experimental models8,9,10.
There has been a demand for the development of cell-based in vitro models in order to achieve the objective of the &#8220;3Rs&#8221; in animal testing. These include replacement alternatives to the use of animals, reduction in the number of animals used, and refinement in adopting methods that alleviate distress11,12,13. Moreover, the underlying molecular, cellular, and physiological mechanisms between human and murine models (rodents being the most widely used species) are distinctive, leading to controversy regarding the efficacy of the murine models as predictors in human responses12,13. Numerous advantages of in vitro human cell-line models include target-restricted experimentation, direct observation, and continuous analysis13.
Single-cell-type monolayers in two-dimensional (2D) cultures have served as powerful models. However, these cannot precisely reproduce the physiological complexity of human tissues8,13,14. As a result, 3D&#160;culture systems are being developed with ever-increasing improvements to recapitulate the physiological complexity of both healthy and diseased intestinal tissues as next-generation risk assessment toolboxes13,14. These models include 3D Transwell scaffolds with diverse cell lines, organoid cultures, and microfluidic devices (intestine-on-chip) using both cell lines and organoids (derived from both healthy and diseased tissues)8,13,14.&#160;
The 3D &#8220;healthy tissue&#8221; intestinal equivalent protocol presented in the present study was based on striking a balance between physiological complexity and experimental simplicity13. The model is representative of a 3D Transwell scaffold, comprised of three cell lines (enterocytes [the gold-standard colon adenocarcinoma Caco-2 line] with a supporting immune component [U937 monocytes and L929 fibroblasts]), constituting a standardized and easily repeatable system applicable for the preliminary screening of dietary molecules of interest on intestinal epithelial barrier integrity and immune response. The protocol includes paraffin embedding for light microscopic evaluation of epithelial barrier integrity using fixed intestinal equivalents. The advantage of the present approach is that numerous sections of the embedded tissues can be made to stain for multiple parameters from a single experiment.

लेखक स्पॉटलाइट: 3 डी मानव सेल लाइन मॉडल का उपयोग कर आंतों के ऊतकों पर यौगिकों के प्रभाव की जांच 

एक प्रतिरक्षा घटक के साथ बुनियादी तीन आयामी (3 डी) आंतों के मॉडल प्रणाली

The scope of the work is to use these in vitro three-dimensional human cell line models to investigate the fact of beneficial as well as helpful compounds on intestinal tissue. The models can be used to further research understanding and also as a basic drug model. Using the plant-derived compounds, spermidine and eugenol, both separately and together in supplement form, we measure beneficial increases in autophagy and decreases in inflammation using these models.Then we will also able to show the potentially harmful effect of gluten extracted from certain wheat varieties on intestinal tissues. We are currently using economically priced, standardized, and easily repeatable in vitro system that better reflect the physiology of the human intestine as an alternative to animal models. Since we also use commercial human cell line rather than plant-derived cells, the responses from the study are more applicable to the general population.The protocol is based entirely on the use of different lines. These renders the model most standardized and reproducible. Furthermore, the simultaneous cultivation of different cell lines, enterocytes, fibroblasts, and immune system cells, allows for cellular responses that are closer to what happens in the patient.

पहला महत्वपूर्ण पहलू प्रयोगात्मक उद्देश्यों के लिए बुनियादी 3 डी आंतों के बराबर म्यूकोसा की स्वीकार्यता निर्धारित करना है। यह ऊतक विज्ञान और हिस्टोपैथोलॉजी प्रयोगशालाओं में सबसे व्यापक रूप से उपयो...

Watch this Scientific Journal Video about Investigating the Effects of Compounds on Intestinal Tissue Using 3D Human Cell Line Models at JoVE.com

यहां हम एक बुनियादी त्रि-आयामी (3 डी) आंतों की सेल लाइन मॉडल प्रणाली और निश्चित आंतों के समकक्षों के प्रकाश सूक्ष्म मूल्यांकन के लिए एक पैराफिन एम्बेडिंग प्रोटोकॉल के निर्माण का वर्णन करते हैं। चयनित प्रोटीन के धुंधला preclinical दवा स्क्रीनिंग अध्ययन में संभावित उपयोग के लिए एक ही प्रयोग से कई दृश्य मापदंडों के विश्लेषण की अनुमति देता है.

There has been an increase in the use of in vivo and in vitro intestinal models to study the pathophysiology of inflammatory intestinal diseases, for the ...

काम का दायरा आंतों के ऊतकों पर फायदेमंद और साथ ही सहायक यौगिकों के तथ्य की जांच करने के लिए इन विट्रो त्रि-आयामी मानव सेल लाइन मॉडल में इनका उपयोग करना है। मॉडल का उपयोग आगे अनुसंधान समझ और एक बुनियादी दवा मॉडल के रूप में भी किया जा सकता है। पौधे-व्युत्पन्न यौगिकों, शुक्राणु और यूजेनॉल का उपयोग करके, दोनों अलग-अलग और एक साथ पूरक रूप में, हम इन मॉडलों का उपयोग करके ऑटोफैगी में लाभकारी वृद्धि और सूजन में कमी को मापते हैं।तब हम आंतों के ऊतकों पर कुछ गेहूं की किस्मों से निकाले गए ग्लूटेन के संभावित हानिकारक प्रभाव को भी दिखा पाएंगे। वर्तमान में हम आर्थिक रूप से मूल्य, मानकीकृत, और आसानी से दोहराने योग्य इन विट्रो सिस्टम का उपयोग कर रहे हैं जो पशु मॉडल के विकल्प के रूप में मानव आंत के शरीर विज्ञान को बेहतर ढंग से दर्शाते हैं। चूंकि हम पौधे-व्युत्पन्न कोशिकाओं के बजाय वाणिज्यिक मानव कोशिका रेखा का भी उपयोग करते हैं, इसलिए अध्ययन से प्रतिक्रियाएं सामान्य आबादी पर अधिक लागू होती हैं।प्रोटोकॉल पूरी तरह से विभिन्न लाइनों के उपयोग पर आधारित है। ये मॉडल को सबसे मानकीकृत और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य प्रदान करते हैं। इसके अलावा, विभिन्न सेल लाइनों, एंटरोसाइट्स, फाइब्रोब्लास्ट्स और प्रतिरक्षा प्रणाली कोशिकाओं की एक साथ खेती, सेलुलर प्रतिक्रियाओं की अनुमति देती है जो रोगी में क्या होता है, इसके करीब हैं।

basic-three-dimensional-3d-intestinal-model-system-with-an-immune

Research

JoVE Journal

Biology

Basic Three-Dimensional (3D) Intestinal Model System with an Immune Component

There has been an increase in the use of in vivo and in vitro intestinal models to study the pathophysiology of inflammatory intestinal diseases, for the pharmacological screening of potentially beneficial substances, and for toxicity studies on potentially harmful food components. Of relevance, there is a current demand for the development of cell-based in vitro models to substitute animal models. Here, a protocol for a basic, &#8220;healthy tissue&#8221; three-dimensional (3D) intestinal equivalent model using cell lines is presented with the dual benefit of providing both experimental simplicity (standardized and easily repeatable system) and physiological complexity (Caco-2 enterocytes with a supporting immune component of U937 monocytes and L929 fibroblasts). The protocol also includes paraffin embedding for light microscopic evaluation of fixed intestinal equivalents, thereby providing the advantage of analyzing multiple visual parameters from a single experiment. Hematoxylin and eosin (H&#38;E) stained sections showing the Caco-2 columnar cells forming a tight and regular monolayer in control treatments are used to verify the efficacy of the model as an experimental system. Using gluten as a pro-inflammatory food component, parameters analyzed from sections include reduced monolayer thickness, as well as disruption and detachment from the underlying matrix (H&#38;E), decreased tight junction protein expression as shown from occludin staining (quantifiable statistically), and immune-activation of migrating U937 cells as evidenced from the cluster of differentiation 14 (CD14) staining and CD11b-related differentiation into macrophages. As shown by using lipopolysaccharide to simulate intestinal inflammation, additional parameters that can be measured are increased mucus staining and cytokine expression (such as midkine) that can be extracted from the medium prior to fixation. The basic three-dimensional (3D) intestinal mucosa model and fixed sections can be recommended for inflammatory status and barrier integrity studies with the possibility of analyzing multiple visual quantifiable parameters.

Here we describe constructing a basic three-dimensional (3D) intestinal cell line model system and a paraffin embedding protocol for light microscopic evaluation of fixed intestinal equivalents. Staining of selected proteins permits the analysis of multiple visual parameters from a single experiment for potential use in preclinical drug screening studies.

Preparation of a Basic 3D Reconstructed Intestinal Mucosa Model for Microscopic Evaluation of Fixed Intestinal Equivalents

To begin, select a 24-well plate containing inserts with 0.4 micron filters. Using a pipette, add 500 microliters of HBSS below and above the filter inserts. Then close the multi-well plate and place it in an incubator for two hours.After incubation, carefully aspirate the HBSS from the plate. Prepare a cell-free collagen solution in a sterile 50 milliliter tube in DMEM on ice. Add 250 microliters of collagen above the membrane filter and place the lid on the plate.Allow the solution to polymerize at room temperature. Next, remove the L-929 fibroblast cell culture from the incubator. Add two milliliters of a pre-warmed trypsin EDTA solution to the flask and place it in an incubator for three to five minutes.Transfer the cell suspension to a sterile 15 milliliter tube and centrifuge at 645 G for five minutes. Using a vacuum pump, aspirate the supernatant and resuspend the pellet in one milliliter of DMEM. Add 20 microliters of cell suspension into a tube containing 20 microliters of Trypan Blue solution.And use a cell counting chamber to evaluate the cell density. Next, remove the U-937 monocyte cell culture from the incubator. Centrifuge the cell suspension and resuspend the pellet in one milliliter of RPMI.After ensuring cells are homogeneously suspended, count them using a cell counting chamber. Next, prepare cell suspensions containing 50, 000 L-929 and 15, 000 U-937 cells respectively in 50 microliters of DMEM. Add each 50 microliter cell suspension to 450 microliters of collagen and mix thoroughly.Overlay the pre-coded cell-free lamina propria with 500 microliters of the collagen cell solution. Close the plate and place it in an incubator for two hours to allow the solution to set. Next, remove the Caco-2 cell culture from the incubator.Using a vacuum pump, aspirate the medium and rinse the cells with 10 milliliters of PBS. Add five milliliters of PBS trypsin EDTA solution and place it in an incubator for five to eight minutes. Then centrifuge the cell suspension and resuspend the pellet in one milliliter of DMEM.After counting, prepare a cell suspension containing 150, 000 Caco-2 cells in 50 microliters of DMEM. Place the plate in a laminar flow hood for 10 minutes before transferring it to the incubator. After 30 minutes, add 500 microliters of the DMEM above the reconstructed model and 500 microliters below the filter and return the plate to the incubator.The next day, carefully replace the medium with 500 microliters of fresh DMEM above and below the filter respectively.

निश्चित आंतों के समकक्षों के सूक्ष्म मूल्यांकन के लिए एक बुनियादी 3 डी पुनर्निर्मित आंतों के श्लेष्म मॉडल की तैयारी

Paraffin Embedding of a Basic 3D Reconstructed Intestinal Mucosa Model for Immune-Histochemical Staining

For paraffin embedding of cells, set the paraffin machine to 58 degrees Celsius. Using pliers, transfer the membrane inserts to clean wells of a sterile 24-well plate. Add 500 microliters of 37%buffered formalin and PBS above the filter, and one milliliter below the filter.Close the lid and leave the plate in a fume hood for two hours. Once the lamina propria is detached from the membrane insert, transfer the intestinal mucosa into a beaker containing 25 milliliters of 35%ethanol, and incubate for 10 minutes. After dehydration in increasing ethanol concentrations, place the samples in 50 milliliters of xylene or a histological clearing agent for 10 to 20 minutes.Once the samples are transparent, place them in a metal tissue cassette holder and submerge them in liquid paraffin inside a heated machine. After 45 minutes, use a microtome to cut four micron sections. Place the cut section on the slides and dry them in an oven at 37 degrees Celsius for 24 hours.An acceptable 3-D intestinal equivalent mucosa model consists of Caco-2 cells formed in a tight and regular monolayer above the extracellular-matrix-rich lamina propria. Unacceptable models include those showing excessive growth, disorganized epithelial layers, malformation or lack of epithelial layer formation. The proinflammatory effect of wheat protein with a high gluten content disrupted the cellular monolayer and reduced the thickness of the epithelial layer compared to the control group.The occludin protein content was significantly higher in the control group than in the group exposed to gluten protein. CD14 and CD11b staining of U937 monocytes showed that wheat protein with a high gluten content activated the monocytes, and induced their migration and differentiation into macrophages. Under the lipopolysaccharide challenge, Caco-2 cells increased mucus production and the release of the inflammatory marker midkine.