Name: Autore in primo piano: Indagine sugli effetti dei composti sul tessuto intestinale utilizzando modelli 3D di linee cellulari umane
Uploaded: 2023-09-01T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Investigating the Effects of Compounds on Intestinal Tissue Using 3D Human Cell Line Models at JoVE.com

Si ringrazia la Fondazione Umberto Veronesi per una borsa di studio a sostegno del lavoro di ricerca.

1. Preparazione del modello di base della mucosa intestinale ricostruita in 3D
NOTA: L'intera procedura deve essere eseguita in una cappa sterile a flusso laminare. Tutte le fasi della procedura che prevedono l'uso dell'incubatore cellulare implicano l'incubazione delle colture a 37 °C in un'atmosfera umidificata contenente il 5% di CO2 (salvo diversa indicazione nel protocollo).
<ol><li>Preparazione preliminare delle linee cellulari utilizzate nel sistema modello inte...

Costruzione di un modello 3D della mucosa intestinale con inclusione di paraffina

<ol>
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Effects of gallic and ferulic acids on in vitro cell models.</a> Nutrients. 12 (6), 1591 (2020).</li><li>Buckley, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualisation+of+multiple+tight+junctional+complexes+in+human+airway+epithelial+cells.">Visualisation of multiple tight junctional complexes in human airway epithelial cells.</a> Biological Procedures. Online. 20, 3 (2018).</li><li>Ghosh, R., Gilda, J. E., Gomes, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+necessity+of+and+strategies+for+improving+confidence+in+the+accuracy+of+western+blots.">The necessity of and strategies for improving confidence in the accuracy of western blots.</a> Expert Review of Proteomics. 11 (5), 549-560 (2014).</li></ol>

Il sistema modello di mucosa intestinale ricostruito di base qui presentato (Figura 6) combina la complessità fisiologica (colture cellulari 3D più rilevanti dal punto di vista fisiologico contenenti un monostrato di Caco-2 con un supporto della lamina propria ricco di ECM contenente fibroblasti e monociti) con la semplicità sperimentale (utilizzando linee cellulari umane commerciali per produrre un sistema standardizzato e facilmente ripetibile)13. In quanto tale,...

La barriera epiteliale intestinale, un rivestimento interno spesso una cellula contenente diversi tipi di cellule epiteliali, costituisce la prima barriera fisica difensiva o interfaccia tra l'ambiente esterno e quello interno del corpo 1,2. Gli enterociti di tipo colonnare costituiscono il tipo più abbondante di cellule epiteliali. Questi sono responsabili del mantenimento dell'integrità della barriera epiteliale attraverso le interazioni tra diversi componenti della barriera, comprese le giunzioni strette (TJ), svolgendo un ruolo significativo nel rafforzamento della barriera 1,3. La struttura TJ è costituita da proteine della placca intracellulare, come zonula occludens (ZO) e cingulin, che cooperano con proteine transmembrana, tra cui occlusine, claudine e molecole di adesione giunzionale (JAM) che formano una struttura a cerniera che collega strettamente le cellule vicine 3,4. Le proteine transmembrana regolano la diffusione paracellulare passiva di piccoli composti ed escludono le grandi molecole tossiche.
I composti alimentari potenzialmente tossici e i contaminanti alimentari stimolano la produzione di citochine infiammatorie che interrompono la permeabilità epiteliale, attivando le cellule immunitarie e causando infiammazione cronica dei tessuti intestinali 5,6,7. Al contrario, è stato riportato che varie sostanze fitochimiche antiossidanti e antinfiammatorie riducono l'espressione delle citochine infiammatorie e migliorano l'integrità della barriera TJ intestinale attraverso il ripristino dell'espressione e dell'assemblaggio della proteina TJ 4,6,8. Pertanto, la regolazione dell'integrità della barriera epiteliale da parte di composti sia benefici che dannosi ha visto un aumento dell'uso di modelli sia in vivo che in vitro volti a mimare la barriera intestinale per lo screening farmaceutico e gli studi di tossicità. Ciò è particolarmente rilevante dato il crescente interesse per la comprensione della fisiopatologia delle malattie intestinali intestinali (IBD), dell'enterocolite necrotizzante e del cancro, che possono essere simulate nei modelli sperimentali 8,9,10.
C'è stata una richiesta per lo sviluppo di modelli in vitro basati su cellule al fine di raggiungere l'obiettivo delle "3R" nella sperimentazione animale. Questi includono alternative sostitutive all'uso di animali, riduzione del numero di animali utilizzati e perfezionamento nell'adozione di metodi che alleviano il disagio 11,12,13. Inoltre, i meccanismi molecolari, cellulari e fisiologici sottostanti tra modelli umani e murini (i roditori sono le specie più utilizzate) sono distintivi, portando a controversie sull'efficacia dei modelli murini come predittori nelle risposte umane12,13. Numerosi vantaggi dei modelli in vitro di linee cellulari umane includono la sperimentazione con target ristretto, l'osservazione diretta e l'analisi continua13.
I monostrati di tipo a cellula singola in colture bidimensionali (2D) sono serviti come potenti modelli. Tuttavia, questi non possono riprodurre con precisione la complessità fisiologica dei tessuti umani 8,13,14. Di conseguenza, i sistemi di coltura 3D vengono sviluppati con miglioramenti sempre crescenti per ricapitolare la complessità fisiologica dei tessuti intestinali sani e malati come strumenti di valutazione del rischio di nuova generazione13,14. Questi modelli includono scaffold 3D Transwell con diverse linee cellulari, colture di organoidi e dispositivi microfluidici (intestino su chip) che utilizzano sia linee cellulari che organoidi (derivati da tessuti sani e malati)8,13,14.
Il protocollo intestinale equivalente 3D di "tessuto sano" presentato nel presente studio si basava sul raggiungimento di un equilibrio tra complessità fisiologica e semplicità sperimentale13. Il modello è rappresentativo di uno scaffold 3D Transwell, composto da tre linee cellulari (enterociti [la linea di adenocarcinoma del colon Caco-2] con una componente immunitaria di supporto [monociti U937 e fibroblasti L929]), costituenti un sistema standardizzato e facilmente ripetibile applicabile per lo screening preliminare di molecole dietetiche di interesse per l'integrità della barriera epiteliale intestinale e la risposta immunitaria. Il protocollo include l'inclusione della paraffina per la valutazione al microscopio dell'integrità della barriera epiteliale utilizzando equivalenti intestinali fissi. Il vantaggio dell'approccio attuale è che numerose sezioni dei tessuti incorporati possono essere colorate per più parametri da un singolo esperimento.

basic three-dimensional (3d) intestinal model system with an immune component

Si è registrato un aumento dell'utilizzo di modelli intestinali in vivo e in vitro per lo studio della fisiopatologia delle malattie infiammatorie intestinali, per lo screening farmacologico di sostanze potenzialmente benefiche e per studi di tossicità su componenti alimentari potenzialmente dannosi. Di rilievo è l'attuale domanda di sviluppo di modelli in vitro basati su cellule per sostituire i modelli animali. Qui, viene presentato un protocollo per un modello di base equivalente intestinale tridimensionale (3D) di "tessuto sano" utilizzando linee cellulari con il duplice vantaggio di fornire sia semplicità sperimentale (sistema standardizzato e facilmente ripetibile) che complessità fisiologica (enterociti Caco-2 con una componente immunitaria di supporto dei monociti U937 e dei fibroblasti L929). Il protocollo include anche l'inclusione della paraffina per la valutazione al microscopio ottico degli equivalenti intestinali fissi, fornendo così il vantaggio di analizzare più parametri visivi da un singolo esperimento. Le sezioni colorate con ematossilina ed eosina (H&E) che mostrano le cellule colonnari Caco-2 che formano un monostrato stretto e regolare nei trattamenti di controllo sono utilizzate per verificare l'efficacia del modello come sistema sperimentale. Utilizzando il glutine come componente alimentare pro-infiammatorio, i parametri analizzati dalle sezioni includono la riduzione dello spessore del monostrato, nonché l'interruzione e il distacco dalla matrice sottostante (H & E), la diminuzione dell'espressione proteica della giunzione stretta come mostrato dalla colorazione dell'occludina (quantificabile statisticamente) e l'attivazione immunitaria delle cellule U937 in migrazione come evidenziato dalla colorazione del cluster di differenziazione 14 (CD14) e dalla differenziazione correlata a CD11b in macrofagi. Come dimostrato dall'uso del lipopolisaccaride per simulare l'infiammazione intestinale, ulteriori parametri che possono essere misurati sono l'aumento della colorazione del muco e l'espressione di citochine (come midkine) che possono essere estratte dal terreno prima della fissazione. Il modello tridimensionale di base (3D) della mucosa intestinale e le sezioni fisse possono essere consigliati per studi sullo stato infiammatorio e sull'integrità della barriera con la possibilità di analizzare molteplici parametri visivi quantificabili.

The intestinal epithelial barrier, a one-cell-thick internal lining containing different types of epithelial cells, constitutes the first physical defensive barrier or interface between the outside and the internal milieu of the body1,2. Columnar-type enterocytes constitute the most abundant type of epithelial cells. These are&#160;responsible for maintaining epithelial barrier integrity through interactions between several barrier components, including tight junctions (TJs), playing a significant role in barrier tightening1,3. The TJ structure consists of intracellular plaque proteins, such as zonula occludens (ZO) and cingulin, cooperating with transmembrane proteins, including occludins, claudins, and junctional adhesion molecules (JAMs) that form zipper-like structure tightly linking the neighboring cells3,4. The transmembrane proteins regulate the passive paracellular diffusion of small compounds and exclude toxic large molecules.
Potentially toxic food compounds and food contaminants stimulate inflammatory cytokine production that disrupts the epithelial permeability, activating immune cells and causing chronic intestinal tissue inflammation5,6,7. In contrast, various anti-oxidant and anti-inflammatory phytochemicals have been reported to reduce inflammatory cytokine expression and enhance intestinal TJ barrier integrity through the restoration of TJ protein expression and assembly4,6,8. Hence, the regulation of epithelial barrier integrity by both beneficial and harmful compounds has seen an increase in the use of both in vivo and in vitro models aimed at mimicking the intestinal barrier for pharmaceutical screening and toxicity studies. This is particularly relevant given the increasing interest in understanding the pathophysiology of intestinal bowel diseases (IBD), necrotizing enterocolitis, and cancer, which can be simulated in experimental models8,9,10.
There has been a demand for the development of cell-based in vitro models in order to achieve the objective of the &#8220;3Rs&#8221; in animal testing. These include replacement alternatives to the use of animals, reduction in the number of animals used, and refinement in adopting methods that alleviate distress11,12,13. Moreover, the underlying molecular, cellular, and physiological mechanisms between human and murine models (rodents being the most widely used species) are distinctive, leading to controversy regarding the efficacy of the murine models as predictors in human responses12,13. Numerous advantages of in vitro human cell-line models include target-restricted experimentation, direct observation, and continuous analysis13.
Single-cell-type monolayers in two-dimensional (2D) cultures have served as powerful models. However, these cannot precisely reproduce the physiological complexity of human tissues8,13,14. As a result, 3D&#160;culture systems are being developed with ever-increasing improvements to recapitulate the physiological complexity of both healthy and diseased intestinal tissues as next-generation risk assessment toolboxes13,14. These models include 3D Transwell scaffolds with diverse cell lines, organoid cultures, and microfluidic devices (intestine-on-chip) using both cell lines and organoids (derived from both healthy and diseased tissues)8,13,14.&#160;
The 3D &#8220;healthy tissue&#8221; intestinal equivalent protocol presented in the present study was based on striking a balance between physiological complexity and experimental simplicity13. The model is representative of a 3D Transwell scaffold, comprised of three cell lines (enterocytes [the gold-standard colon adenocarcinoma Caco-2 line] with a supporting immune component [U937 monocytes and L929 fibroblasts]), constituting a standardized and easily repeatable system applicable for the preliminary screening of dietary molecules of interest on intestinal epithelial barrier integrity and immune response. The protocol includes paraffin embedding for light microscopic evaluation of epithelial barrier integrity using fixed intestinal equivalents. The advantage of the present approach is that numerous sections of the embedded tissues can be made to stain for multiple parameters from a single experiment.

Autore in primo piano: Indagine sugli effetti dei composti sul tessuto intestinale utilizzando modelli 3D di linee cellulari umane 

Sistema modello intestinale tridimensionale (3D) di base con una componente immunitaria

The scope of the work is to use these in vitro three-dimensional human cell line models to investigate the fact of beneficial as well as helpful compounds on intestinal tissue. The models can be used to further research understanding and also as a basic drug model. Using the plant-derived compounds, spermidine and eugenol, both separately and together in supplement form, we measure beneficial increases in autophagy and decreases in inflammation using these models.Then we will also able to show the potentially harmful effect of gluten extracted from certain wheat varieties on intestinal tissues. We are currently using economically priced, standardized, and easily repeatable in vitro system that better reflect the physiology of the human intestine as an alternative to animal models. Since we also use commercial human cell line rather than plant-derived cells, the responses from the study are more applicable to the general population.The protocol is based entirely on the use of different lines. These renders the model most standardized and reproducible. Furthermore, the simultaneous cultivation of different cell lines, enterocytes, fibroblasts, and immune system cells, allows for cellular responses that are closer to what happens in the patient.

Il primo aspetto importante è quello di determinare l'accettabilità della mucosa intestinale equivalente 3D di base a scopo sperimentale. Questo viene eseguito con il colorante più utilizzato nei laboratori di istologia e istopatologia, ovvero l'ematossilina (colora il materiale nucleare di colore blu-viola intenso) e l'eosina (colora il materiale citoplasmatico di varie tonalità di rosa). La colorazione H&E viene prima eseguita su un controllo non trattato, che viene coltivato nelle stesse condizioni e negli stessi ...

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Qui descriviamo la costruzione di un sistema modello di linea cellulare intestinale tridimensionale (3D) di base e un protocollo di inclusione della paraffina per la valutazione microscopica ottica di equivalenti intestinali fissi. La colorazione di proteine selezionate consente l'analisi di più parametri visivi da un singolo esperimento per un potenziale utilizzo in studi preclinici di screening farmacologico.

There has been an increase in the use of in vivo and in vitro intestinal models to study the pathophysiology of inflammatory intestinal diseases, for the ...

Lo scopo del lavoro è quello di utilizzare questi modelli tridimensionali in vitro di linee cellulari umane per studiare il fatto di composti benefici e utili sul tessuto intestinale. I modelli possono essere utilizzati per approfondire la comprensione della ricerca e anche come modello farmacologico di base. Utilizzando i composti di origine vegetale, spermidina ed eugenolo, sia separatamente che insieme sotto forma di integratore, misuriamo gli aumenti benefici dell'autofagia e la diminuzione dell'infiammazione utilizzando questi modelli.Successivamente saremo anche in grado di dimostrare l'effetto potenzialmente dannoso del glutine estratto da alcune varietà di grano sui tessuti intestinali. Attualmente stiamo utilizzando sistemi in vitro a prezzi economici, standardizzati e facilmente ripetibili che riflettono meglio la fisiologia dell'intestino umano come alternativa ai modelli animali. Poiché utilizziamo anche linee cellulari umane commerciali piuttosto che cellule di origine vegetale, le risposte dello studio sono più applicabili alla popolazione generale.Il protocollo si basa interamente sull'utilizzo di diverse linee. In questo modo il modello è più standardizzato e riproducibile. Inoltre, la coltivazione simultanea di diverse linee cellulari, enterociti, fibroblasti e cellule del sistema immunitario, consente risposte cellulari più vicine a ciò che accade nel paziente.

basic-three-dimensional-3d-intestinal-model-system-with-an-immune

Research

JoVE Journal

Biology

Basic Three-Dimensional (3D) Intestinal Model System with an Immune Component

There has been an increase in the use of in vivo and in vitro intestinal models to study the pathophysiology of inflammatory intestinal diseases, for the pharmacological screening of potentially beneficial substances, and for toxicity studies on potentially harmful food components. Of relevance, there is a current demand for the development of cell-based in vitro models to substitute animal models. Here, a protocol for a basic, &#8220;healthy tissue&#8221; three-dimensional (3D) intestinal equivalent model using cell lines is presented with the dual benefit of providing both experimental simplicity (standardized and easily repeatable system) and physiological complexity (Caco-2 enterocytes with a supporting immune component of U937 monocytes and L929 fibroblasts). The protocol also includes paraffin embedding for light microscopic evaluation of fixed intestinal equivalents, thereby providing the advantage of analyzing multiple visual parameters from a single experiment. Hematoxylin and eosin (H&#38;E) stained sections showing the Caco-2 columnar cells forming a tight and regular monolayer in control treatments are used to verify the efficacy of the model as an experimental system. Using gluten as a pro-inflammatory food component, parameters analyzed from sections include reduced monolayer thickness, as well as disruption and detachment from the underlying matrix (H&#38;E), decreased tight junction protein expression as shown from occludin staining (quantifiable statistically), and immune-activation of migrating U937 cells as evidenced from the cluster of differentiation 14 (CD14) staining and CD11b-related differentiation into macrophages. As shown by using lipopolysaccharide to simulate intestinal inflammation, additional parameters that can be measured are increased mucus staining and cytokine expression (such as midkine) that can be extracted from the medium prior to fixation. The basic three-dimensional (3D) intestinal mucosa model and fixed sections can be recommended for inflammatory status and barrier integrity studies with the possibility of analyzing multiple visual quantifiable parameters.

Here we describe constructing a basic three-dimensional (3D) intestinal cell line model system and a paraffin embedding protocol for light microscopic evaluation of fixed intestinal equivalents. Staining of selected proteins permits the analysis of multiple visual parameters from a single experiment for potential use in preclinical drug screening studies.

Ricerca

Biologia

Preparation of a Basic 3D Reconstructed Intestinal Mucosa Model for Microscopic Evaluation of Fixed Intestinal Equivalents

To begin, select a 24-well plate containing inserts with 0.4 micron filters. Using a pipette, add 500 microliters of HBSS below and above the filter inserts. Then close the multi-well plate and place it in an incubator for two hours.After incubation, carefully aspirate the HBSS from the plate. Prepare a cell-free collagen solution in a sterile 50 milliliter tube in DMEM on ice. Add 250 microliters of collagen above the membrane filter and place the lid on the plate.Allow the solution to polymerize at room temperature. Next, remove the L-929 fibroblast cell culture from the incubator. Add two milliliters of a pre-warmed trypsin EDTA solution to the flask and place it in an incubator for three to five minutes.Transfer the cell suspension to a sterile 15 milliliter tube and centrifuge at 645 G for five minutes. Using a vacuum pump, aspirate the supernatant and resuspend the pellet in one milliliter of DMEM. Add 20 microliters of cell suspension into a tube containing 20 microliters of Trypan Blue solution.And use a cell counting chamber to evaluate the cell density. Next, remove the U-937 monocyte cell culture from the incubator. Centrifuge the cell suspension and resuspend the pellet in one milliliter of RPMI.After ensuring cells are homogeneously suspended, count them using a cell counting chamber. Next, prepare cell suspensions containing 50, 000 L-929 and 15, 000 U-937 cells respectively in 50 microliters of DMEM. Add each 50 microliter cell suspension to 450 microliters of collagen and mix thoroughly.Overlay the pre-coded cell-free lamina propria with 500 microliters of the collagen cell solution. Close the plate and place it in an incubator for two hours to allow the solution to set. Next, remove the Caco-2 cell culture from the incubator.Using a vacuum pump, aspirate the medium and rinse the cells with 10 milliliters of PBS. Add five milliliters of PBS trypsin EDTA solution and place it in an incubator for five to eight minutes. Then centrifuge the cell suspension and resuspend the pellet in one milliliter of DMEM.After counting, prepare a cell suspension containing 150, 000 Caco-2 cells in 50 microliters of DMEM. Place the plate in a laminar flow hood for 10 minutes before transferring it to the incubator. After 30 minutes, add 500 microliters of the DMEM above the reconstructed model and 500 microliters below the filter and return the plate to the incubator.The next day, carefully replace the medium with 500 microliters of fresh DMEM above and below the filter respectively.

Preparazione di un modello di base della mucosa intestinale ricostruita in 3D per la valutazione microscopica di equivalenti intestinali fissi

Paraffin Embedding of a Basic 3D Reconstructed Intestinal Mucosa Model for Immune-Histochemical Staining

For paraffin embedding of cells, set the paraffin machine to 58 degrees Celsius. Using pliers, transfer the membrane inserts to clean wells of a sterile 24-well plate. Add 500 microliters of 37%buffered formalin and PBS above the filter, and one milliliter below the filter.Close the lid and leave the plate in a fume hood for two hours. Once the lamina propria is detached from the membrane insert, transfer the intestinal mucosa into a beaker containing 25 milliliters of 35%ethanol, and incubate for 10 minutes. After dehydration in increasing ethanol concentrations, place the samples in 50 milliliters of xylene or a histological clearing agent for 10 to 20 minutes.Once the samples are transparent, place them in a metal tissue cassette holder and submerge them in liquid paraffin inside a heated machine. After 45 minutes, use a microtome to cut four micron sections. Place the cut section on the slides and dry them in an oven at 37 degrees Celsius for 24 hours.An acceptable 3-D intestinal equivalent mucosa model consists of Caco-2 cells formed in a tight and regular monolayer above the extracellular-matrix-rich lamina propria. Unacceptable models include those showing excessive growth, disorganized epithelial layers, malformation or lack of epithelial layer formation. The proinflammatory effect of wheat protein with a high gluten content disrupted the cellular monolayer and reduced the thickness of the epithelial layer compared to the control group.The occludin protein content was significantly higher in the control group than in the group exposed to gluten protein. CD14 and CD11b staining of U937 monocytes showed that wheat protein with a high gluten content activated the monocytes, and induced their migration and differentiation into macrophages. Under the lipopolysaccharide challenge, Caco-2 cells increased mucus production and the release of the inflammatory marker midkine.