Name: 저자 스포트라이트: 3D 인간 세포주 모델을 사용하여 화합물이 장 조직에 미치는 영향 조사
Uploaded: 2023-09-01T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Investigating the Effects of Compounds on Intestinal Tissue Using 3D Human Cell Line Models at JoVE.com

연구자 작업을 지원하는 펠로우십을 제공한 움베르토 베로네시 재단(Umberto Veronesi Foundation)에 감사드립니다.

1. 기본 3D 재구성 장 점막 모델 준비
알림: 전체 절차는 멸균 층류 후드에서 수행해야 합니다. 세포 인큐베이터 사용과 관련된 절차의 모든 단계는 배양액이 5%CO2 를 함유한 가습 분위기에서 37°C에서 배양됨을 의미합니다(프로토콜에 달리 명시되지 않는 한).
<ol><li>장 모델 시스템에 사용되는 세포주의 사전 준비<ol><li>F25 플라스크에 2mM L-글루타민, 10% 소 태아 ...

파라핀 Embedding을 이용한 3D 장 점막 모델 구축

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여기에 제시된 기본 재구성 장 점막 모델 시스템(그림 6)은 생리학적 복잡성(섬유아세포 및 단핵구를 포함하는 ECM이 풍부한 lamina propria 지지체와 함께 Caco-2 단층을 포함하는 생리학적으로 더 관련성이 높은 3D 세포 배양)과 실험적 단순성(표준화되고 쉽게 반복 가능한 시스템을 생산하기 위해 상업용 인간 세포주를 사용)을 결합합니다.13. 따라서 이 모델 시?...

서로 다른 유형의 상피 세포를 포함하는 1 세포 두께의 내부 내막인 장 상피 장벽은 신체의 외부와 내부 환경 사이의 첫 번째 물리적 방어 장벽 또는 인터페이스를 구성합니다 1,2. 원주형 장세포는 가장 풍부한 유형의 상피세포를 구성합니다. 이들은 단단한 접합부(TJ)를 포함한 여러 장벽 구성 요소 간의 상호 작용을 통해 상피 장벽 무결성을 유지하는 역할을 하며, 장벽 강화에 중요한 역할을 합니다 1,3. TJ 구조는 조눌라 오클루덴스(zonula occludens, ZO) 및 싱귤린(cingulin)과 같은 세포내 플라크 단백질로 구성되며, 오클루딘(occludin), 클라우딘(claudin) 및 접합 접착 분자(junctional adhesion molecule, JAM)를 포함한 막관통 단백질과 협력하여 인접 세포를 단단히 연결하는 지퍼 모양의 구조를 형성합니다 3,4. 막관통 단백질은 작은 화합물의 수동 세포주위 확산을 조절하고 독성이 있는 큰 분자를 배제합니다.
잠재적으로 독성이 있는 식품 화합물 및 식품 오염 물질은 상피 투과성을 방해하고 면역 세포를 활성화하며 만성 장 조직 염증을 유발하는 염증성 사이토카인 생성을 자극합니다 5,6,7. 대조적으로, 다양한 항산화 및 항염증 파이토케미컬은 TJ 단백질 발현 및 조립 복원을 통해 염증성 사이토카인 발현을 감소시키고 장내 TJ 장벽 무결성을 향상시키는 것으로 보고되었습니다 4,6,8. 따라서 유익한 화합물과 유해 화합물 모두에 의한 상피 장벽 무결성 조절은 제약 스크리닝 및 독성 연구를 위한 장 장벽을 모방하는 것을 목표로 하는 생체 내 및 시험관 모델 모두의 사용이 증가하는 것을 보았습니다. 이는 장 질환(IBD), 괴사성 장염 및 암의 병태생리학을 이해하는 데 대한 관심이 증가함에 따라 특히 관련이 있으며, 이는 실험 모델8,9,10에서 시뮬레이션할 수 있습니다.
동물 실험에서 "3R"의 목표를 달성하기 위해 세포 기반 in vitro 모델 개발에 대한 요구가 있었습니다. 여기에는 동물 사용에 대한 대체 대안, 사용되는 동물 수의 감소, 고통을 완화하는 방법 채택의 개선이 포함됩니다 11,12,13. 더욱이, 인간과 쥐 모델(설치류가 가장 널리 사용되는 종) 사이의 근본적인 분자, 세포 및 생리학적 메커니즘은 독특하여 인간 반응의 예측 변수로서 쥐 모델의 효능에 대한 논란을 불러일으킨다12,13. in vitro 인간 세포주 모델의 수많은 장점으로는 표적 제한 실험, 직접 관찰 및 연속 분석13이 있습니다.
2차원(2D) 배양에서 단세포형 단층은 강력한 모델 역할을 했습니다. 그러나 이들은 인체 조직의 생리학적 복잡성을 정확하게 재현할 수 없다 8,13,14. 그 결과, 3D 배양 시스템은 건강한 장 조직과 병든 장 조직 모두의 생리학적 복잡성을 차세대 위험 평가 도구 상자로 요약하기 위해 지속적으로 개선되어 개발되고 있습니다13,14. 이러한 모델에는 다양한 세포주를 가진 3D Transwell 스캐폴드, 오가노이드 배양 및 세포주와 오가노이드(건강한 조직과 병든 조직 모두에서 유래)를 모두 사용하는 미세유체 장치(intestine-on-chip)가 포함됩니다8,13,14.
본 연구에서 제시된 3D "건강한 조직" 장 등가 프로토콜은 생리학적 복잡성과 실험적 단순성 사이의 균형을 맞추는 것을 기반으로 했다13. 이 모델은 3개의 세포주(면역 성분[U937 단핵구 및 L929 섬유아세포]가 있는 장세포[대장 선암종 Caco-2 계열])로 구성된 3D Transwell 스캐폴드를 대표하며, 장 상피 장벽 무결성 및 면역 반응에 대한 관심 식이 분자의 예비 스크리닝에 적용할 수 있는 표준화되고 쉽게 반복 가능한 시스템을 구성합니다. 이 프로토콜에는 고정 장 등가물을 사용하여 상피 장벽 무결성의 광현미경 평가를 위한 파라핀 임베딩이 포함됩니다. 현재 접근법의 장점은 단일 실험에서 여러 매개변수에 대해 묻힌 조직의 수많은 섹션을 염색할 수 있다는 것입니다.

basic three-dimensional (3d) intestinal model system with an immune component

염증성 장 질환의 병태생리학을 연구하고, 잠재적으로 유익한 물질의 약리학적 스크리닝을 위해, 잠재적으로 유해한 식품 성분에 대한 독성 연구를 위해 생체 내 및 체외 장 모델의 사용이 증가하고 있습니다. 관련하여, 동물 모델을 대체하기 위한 세포 기반 in vitro 모델의 개발에 대한 현재 수요가 있습니다. 여기서, 세포주를 사용하는 기본적인 "건강한 조직" 3차원(3D) 장 등가 모델에 대한 프로토콜은 실험적 단순성(표준화되고 쉽게 반복할 수 있는 시스템)과 생리학적 복잡성(U937 단핵구 및 L929 섬유아세포의 지지 면역 구성 요소를 가진 Caco-2 장세포)을 모두 제공하는 두 가지 이점을 제공합니다. 이 프로토콜에는 고정 장 등가물의 광학 현미경 평가를 위한 파라핀 임베딩도 포함되어 있어 단일 실험에서 여러 시각적 매개변수를 분석할 수 있는 이점을 제공합니다. 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 염색 절편은 대조군 처리에서 단단하고 규칙적인 단층을 형성하는 Caco-2 원주 세포를 보여주는 데 사용되어 실험 시스템으로서 모델의 효능을 검증합니다. 글루텐을 전염증성 식품 성분으로 사용하여 단층 두께 감소, 기저 매트릭스(H&E)로부터의 파괴 및 분리, 오클루딘 염색에서 볼 수 있듯이 밀착 접합 단백질 발현 감소(통계적으로 정량화 가능), 분화 14(CD14) 염색 클러스터 및 대식세포로의 CD11b 관련 분화에서 입증된 U937 세포 이동의 면역 활성화가 절편에서 분석된 매개변수가 포함됩니다. 장 염증을 시뮬레이션하기 위해 지질다당류를 사용하여 알 수 있듯이 측정할 수 있는 추가 매개변수는 고정 전에 배지에서 추출할 수 있는 점액 염색 증가 및 사이토카인 발현(예: 미드키네)입니다. 기본적인 3차원(3D) 장 점막 모델 및 고정 절편은 여러 시각적 정량화 가능한 매개변수를 분석할 수 있는 가능성과 함께 염증 상태 및 장벽 무결성 연구에 권장될 수 있습니다.

The intestinal epithelial barrier, a one-cell-thick internal lining containing different types of epithelial cells, constitutes the first physical defensive barrier or interface between the outside and the internal milieu of the body1,2. Columnar-type enterocytes constitute the most abundant type of epithelial cells. These are&#160;responsible for maintaining epithelial barrier integrity through interactions between several barrier components, including tight junctions (TJs), playing a significant role in barrier tightening1,3. The TJ structure consists of intracellular plaque proteins, such as zonula occludens (ZO) and cingulin, cooperating with transmembrane proteins, including occludins, claudins, and junctional adhesion molecules (JAMs) that form zipper-like structure tightly linking the neighboring cells3,4. The transmembrane proteins regulate the passive paracellular diffusion of small compounds and exclude toxic large molecules.
Potentially toxic food compounds and food contaminants stimulate inflammatory cytokine production that disrupts the epithelial permeability, activating immune cells and causing chronic intestinal tissue inflammation5,6,7. In contrast, various anti-oxidant and anti-inflammatory phytochemicals have been reported to reduce inflammatory cytokine expression and enhance intestinal TJ barrier integrity through the restoration of TJ protein expression and assembly4,6,8. Hence, the regulation of epithelial barrier integrity by both beneficial and harmful compounds has seen an increase in the use of both in vivo and in vitro models aimed at mimicking the intestinal barrier for pharmaceutical screening and toxicity studies. This is particularly relevant given the increasing interest in understanding the pathophysiology of intestinal bowel diseases (IBD), necrotizing enterocolitis, and cancer, which can be simulated in experimental models8,9,10.
There has been a demand for the development of cell-based in vitro models in order to achieve the objective of the &#8220;3Rs&#8221; in animal testing. These include replacement alternatives to the use of animals, reduction in the number of animals used, and refinement in adopting methods that alleviate distress11,12,13. Moreover, the underlying molecular, cellular, and physiological mechanisms between human and murine models (rodents being the most widely used species) are distinctive, leading to controversy regarding the efficacy of the murine models as predictors in human responses12,13. Numerous advantages of in vitro human cell-line models include target-restricted experimentation, direct observation, and continuous analysis13.
Single-cell-type monolayers in two-dimensional (2D) cultures have served as powerful models. However, these cannot precisely reproduce the physiological complexity of human tissues8,13,14. As a result, 3D&#160;culture systems are being developed with ever-increasing improvements to recapitulate the physiological complexity of both healthy and diseased intestinal tissues as next-generation risk assessment toolboxes13,14. These models include 3D Transwell scaffolds with diverse cell lines, organoid cultures, and microfluidic devices (intestine-on-chip) using both cell lines and organoids (derived from both healthy and diseased tissues)8,13,14.&#160;
The 3D &#8220;healthy tissue&#8221; intestinal equivalent protocol presented in the present study was based on striking a balance between physiological complexity and experimental simplicity13. The model is representative of a 3D Transwell scaffold, comprised of three cell lines (enterocytes [the gold-standard colon adenocarcinoma Caco-2 line] with a supporting immune component [U937 monocytes and L929 fibroblasts]), constituting a standardized and easily repeatable system applicable for the preliminary screening of dietary molecules of interest on intestinal epithelial barrier integrity and immune response. The protocol includes paraffin embedding for light microscopic evaluation of epithelial barrier integrity using fixed intestinal equivalents. The advantage of the present approach is that numerous sections of the embedded tissues can be made to stain for multiple parameters from a single experiment.

저자 스포트라이트: 3D 인간 세포주 모델을 사용하여 화합물이 장 조직에 미치는 영향 조사 

면역 성분이 있는 기본 3차원(3D) 장 모델 시스템

The scope of the work is to use these in vitro three-dimensional human cell line models to investigate the fact of beneficial as well as helpful compounds on intestinal tissue. The models can be used to further research understanding and also as a basic drug model. Using the plant-derived compounds, spermidine and eugenol, both separately and together in supplement form, we measure beneficial increases in autophagy and decreases in inflammation using these models.Then we will also able to show the potentially harmful effect of gluten extracted from certain wheat varieties on intestinal tissues. We are currently using economically priced, standardized, and easily repeatable in vitro system that better reflect the physiology of the human intestine as an alternative to animal models. Since we also use commercial human cell line rather than plant-derived cells, the responses from the study are more applicable to the general population.The protocol is based entirely on the use of different lines. These renders the model most standardized and reproducible. Furthermore, the simultaneous cultivation of different cell lines, enterocytes, fibroblasts, and immune system cells, allows for cellular responses that are closer to what happens in the patient.

첫 번째 중요한 측면은 실험 목적으로 기본 3D 장 등가 점막의 수용 가능성을 결정하는 것입니다. 이것은 조직학 및 조직 병리학 실험실에서 가장 널리 사용되는 염색, 즉 hematoxylin (핵 물질을 짙은 파란색-보라색으로 염색) 및 eosin (분홍색의 다양한 음영으로 세포질 물질을 염색)으로 수행됩니다. H&E 염색은 먼저 처리되지 않은 대조군에서 수행되며, 실험적 처리와 동일한 조건 및 시간 프레임에서 ...

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여기서는 기본 3차원(3D) 장 세포주 모델 시스템과 고정 장 등가물의 광학 현미경 평가를 위한 파라핀 임베딩 프로토콜을 구성하는 방법을 설명합니다. 선택한 단백질의 염색을 통해 단일 실험에서 여러 시각적 파라미터를 분석하여 전임상 약물 스크리닝 연구에 사용할 수 있습니다.

There has been an increase in the use of in vivo and in vitro intestinal models to study the pathophysiology of inflammatory intestinal diseases, for the ...

이 연구의 범위는 이러한 체외 3차원 인간 세포주 모델을 사용하여 장 조직에 유익하고 유용한 화합물의 사실을 조사하는 것입니다. 이 모델은 추가 연구, 이해 및 기본 약물 모델로 사용할 수 있습니다. 식물 유래 화합물인 스퍼미딘과 유제놀을 보충제 형태로 단독으로 또는 함께 사용하여 이러한 모델을 사용하여 자가포식의 유익한 증가와 염증 감소를 측정합니다.그런 다음 특정 밀 품종에서 추출한 글루텐이 장 조직에 미치는 잠재적으로 해로운 영향도 보여줄 수 있습니다. 우리는 현재 동물 모델의 대안으로 인간 장의 생리학을 더 잘 반영하는 경제적으로 가격이 책정되고 표준화되고 쉽게 반복할 수 있는 체외 시스템을 사용하고 있습니다. 우리는 또한 식물 유래 세포가 아닌 상업용 인간 세포주를 사용하기 때문에 연구의 반응은 일반 인구 집단에 더 적합합니다.프로토콜은 전적으로 다른 라인의 사용을 기반으로 합니다. 이를 통해 모델을 가장 표준화되고 재현 가능하게 렌더링할 수 있습니다. 또한 서로 다른 세포주, 장세포, 섬유아세포 및 면역계 세포를 동시에 배양하여 환자에게 일어나는 것과 더 가까운 세포 반응을 가능하게 합니다.

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Research

JoVE Journal

Biology

Basic Three-Dimensional (3D) Intestinal Model System with an Immune Component

There has been an increase in the use of in vivo and in vitro intestinal models to study the pathophysiology of inflammatory intestinal diseases, for the pharmacological screening of potentially beneficial substances, and for toxicity studies on potentially harmful food components. Of relevance, there is a current demand for the development of cell-based in vitro models to substitute animal models. Here, a protocol for a basic, &#8220;healthy tissue&#8221; three-dimensional (3D) intestinal equivalent model using cell lines is presented with the dual benefit of providing both experimental simplicity (standardized and easily repeatable system) and physiological complexity (Caco-2 enterocytes with a supporting immune component of U937 monocytes and L929 fibroblasts). The protocol also includes paraffin embedding for light microscopic evaluation of fixed intestinal equivalents, thereby providing the advantage of analyzing multiple visual parameters from a single experiment. Hematoxylin and eosin (H&#38;E) stained sections showing the Caco-2 columnar cells forming a tight and regular monolayer in control treatments are used to verify the efficacy of the model as an experimental system. Using gluten as a pro-inflammatory food component, parameters analyzed from sections include reduced monolayer thickness, as well as disruption and detachment from the underlying matrix (H&#38;E), decreased tight junction protein expression as shown from occludin staining (quantifiable statistically), and immune-activation of migrating U937 cells as evidenced from the cluster of differentiation 14 (CD14) staining and CD11b-related differentiation into macrophages. As shown by using lipopolysaccharide to simulate intestinal inflammation, additional parameters that can be measured are increased mucus staining and cytokine expression (such as midkine) that can be extracted from the medium prior to fixation. The basic three-dimensional (3D) intestinal mucosa model and fixed sections can be recommended for inflammatory status and barrier integrity studies with the possibility of analyzing multiple visual quantifiable parameters.

Here we describe constructing a basic three-dimensional (3D) intestinal cell line model system and a paraffin embedding protocol for light microscopic evaluation of fixed intestinal equivalents. Staining of selected proteins permits the analysis of multiple visual parameters from a single experiment for potential use in preclinical drug screening studies.

연구

생물학

Preparation of a Basic 3D Reconstructed Intestinal Mucosa Model for Microscopic Evaluation of Fixed Intestinal Equivalents

To begin, select a 24-well plate containing inserts with 0.4 micron filters. Using a pipette, add 500 microliters of HBSS below and above the filter inserts. Then close the multi-well plate and place it in an incubator for two hours.After incubation, carefully aspirate the HBSS from the plate. Prepare a cell-free collagen solution in a sterile 50 milliliter tube in DMEM on ice. Add 250 microliters of collagen above the membrane filter and place the lid on the plate.Allow the solution to polymerize at room temperature. Next, remove the L-929 fibroblast cell culture from the incubator. Add two milliliters of a pre-warmed trypsin EDTA solution to the flask and place it in an incubator for three to five minutes.Transfer the cell suspension to a sterile 15 milliliter tube and centrifuge at 645 G for five minutes. Using a vacuum pump, aspirate the supernatant and resuspend the pellet in one milliliter of DMEM. Add 20 microliters of cell suspension into a tube containing 20 microliters of Trypan Blue solution.And use a cell counting chamber to evaluate the cell density. Next, remove the U-937 monocyte cell culture from the incubator. Centrifuge the cell suspension and resuspend the pellet in one milliliter of RPMI.After ensuring cells are homogeneously suspended, count them using a cell counting chamber. Next, prepare cell suspensions containing 50, 000 L-929 and 15, 000 U-937 cells respectively in 50 microliters of DMEM. Add each 50 microliter cell suspension to 450 microliters of collagen and mix thoroughly.Overlay the pre-coded cell-free lamina propria with 500 microliters of the collagen cell solution. Close the plate and place it in an incubator for two hours to allow the solution to set. Next, remove the Caco-2 cell culture from the incubator.Using a vacuum pump, aspirate the medium and rinse the cells with 10 milliliters of PBS. Add five milliliters of PBS trypsin EDTA solution and place it in an incubator for five to eight minutes. Then centrifuge the cell suspension and resuspend the pellet in one milliliter of DMEM.After counting, prepare a cell suspension containing 150, 000 Caco-2 cells in 50 microliters of DMEM. Place the plate in a laminar flow hood for 10 minutes before transferring it to the incubator. After 30 minutes, add 500 microliters of the DMEM above the reconstructed model and 500 microliters below the filter and return the plate to the incubator.The next day, carefully replace the medium with 500 microliters of fresh DMEM above and below the filter respectively.

고정 장 등가물의 현미경 평가를 위한 기본 3D 재구성 장 점막 모델 준비

Paraffin Embedding of a Basic 3D Reconstructed Intestinal Mucosa Model for Immune-Histochemical Staining

For paraffin embedding of cells, set the paraffin machine to 58 degrees Celsius. Using pliers, transfer the membrane inserts to clean wells of a sterile 24-well plate. Add 500 microliters of 37%buffered formalin and PBS above the filter, and one milliliter below the filter.Close the lid and leave the plate in a fume hood for two hours. Once the lamina propria is detached from the membrane insert, transfer the intestinal mucosa into a beaker containing 25 milliliters of 35%ethanol, and incubate for 10 minutes. After dehydration in increasing ethanol concentrations, place the samples in 50 milliliters of xylene or a histological clearing agent for 10 to 20 minutes.Once the samples are transparent, place them in a metal tissue cassette holder and submerge them in liquid paraffin inside a heated machine. After 45 minutes, use a microtome to cut four micron sections. Place the cut section on the slides and dry them in an oven at 37 degrees Celsius for 24 hours.An acceptable 3-D intestinal equivalent mucosa model consists of Caco-2 cells formed in a tight and regular monolayer above the extracellular-matrix-rich lamina propria. Unacceptable models include those showing excessive growth, disorganized epithelial layers, malformation or lack of epithelial layer formation. The proinflammatory effect of wheat protein with a high gluten content disrupted the cellular monolayer and reduced the thickness of the epithelial layer compared to the control group.The occludin protein content was significantly higher in the control group than in the group exposed to gluten protein. CD14 and CD11b staining of U937 monocytes showed that wheat protein with a high gluten content activated the monocytes, and induced their migration and differentiation into macrophages. Under the lipopolysaccharide challenge, Caco-2 cells increased mucus production and the release of the inflammatory marker midkine.