Name: Författare Spotlight: Undersöker effekterna av föreningar på tarmvävnad med hjälp av 3D mänskliga cellinjemodeller
Uploaded: 2023-09-01T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Investigating the Effects of Compounds on Intestinal Tissue Using 3D Human Cell Line Models at JoVE.com

Tack till Umberto Veronesi-stiftelsen för ett stipendium som stöder forskararbete.

1. Förberedelse av den grundläggande 3D-rekonstruerade tarmslemhinnemodellen
OBS: Hela proceduren måste utföras i en steril laminär flödeshuv. Alla steg i förfarandet med användning av cellinkubatorn innebär att odlingarna inkuberas vid 37 °C i en fuktad atmosfär som innehåller 5 % CO2 (om inte annat anges i protokollet).
<ol><li>Förberedelse av de cellinjer som används i tarmmodellsystemet<ol><li>Frö L929 musfibroblastceller i en koncentration av 5 x 10<...

Konstruktion av en 3D-tarmslemhinnemodell med paraffininbäddning

<ol>
	<li>Chelakkot, C., Ghim, J., Ryu, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+regulating+intestinal+barrier+integrity+and+its+pathological+implications.">Mechanisms regulating intestinal barrier integrity and its pathological implications.</a> Experimental &amp; Molecular Medicine. 50 (8), 1-9 (2018).</li><li>Schoultz, I., Keita, &. #. 1. 9. 7. ;. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+intestinal+barrier+and+current+techniques+for+the+assessment+of+gut+permeability.">The intestinal barrier and current techniques for the assessment of gut permeability.</a> Cells. 9 (8), 1909 (1909).</li><li>Bednarek, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+methods+for+measuring+the+permeability+of+cell+monolayers.">In vitro methods for measuring the permeability of cell monolayers.</a> Methods and Protocols. 5 (1), 17 (2022).</li><li>Suzuki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+intestinal+barrier+by+nutrients:+The+role+of+tight+junctions.">Regulation of the intestinal barrier by nutrients: The role of tight junctions.</a> Animal Science Journal. 91 (1), e13357 (2020).</li><li>Guibourdenche, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Food+contaminants+effects+on+an+in+vitro+model+of+human+intestinal+epithelium.">Food contaminants effects on an in vitro model of human intestinal epithelium.</a> Toxics. 9 (6), 135 (2021).</li><li>Panwar, S., Sharma, S., Tripathi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+barrier+integrity+and+dysfunctions+in+maintaining+the+healthy+gut+and+their+health+outcomes.">Role of barrier integrity and dysfunctions in maintaining the healthy gut and their health outcomes.</a> Frontiers in Physiology. 12, 715611 (2021).</li><li>Truzzi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pro-inflammatory+effect+of+gliadins+and+glutenins+extracted+from+different+wheat+cultivars+on+an+in+vitro+3D+intestinal+epithelium+model.">Pro-inflammatory effect of gliadins and glutenins extracted from different wheat cultivars on an in vitro 3D intestinal epithelium model.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (1), 172 (2020).</li><li>Fedi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+models+replicating+the+human+intestinal+epithelium+for+absorption+and+metabolism+studies:+A+systematic+review.">In vitro models replicating the human intestinal epithelium for absorption and metabolism studies: A systematic review.</a> Journal of Controlled Release. 335, 247-268 (2021).</li><li>De Fazio, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Necrotizing+enterocolitis:+Overview+on+in+vitro+models.">Necrotizing enterocolitis: Overview on in vitro models.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (13), 6761 (2021).</li><li>Jubelin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+in+vitro+culture+models+in+oncology+research.">Three-dimensional in vitro culture models in oncology research.</a> Cell &amp; Bioscience. 12 (1), 155 (2022).</li><li>Russell, W., Burch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+principles+of+humane+experimental+technique.">The principles of humane experimental technique.</a> Available online. , (2023).</li><li>Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+it+time+for+reviewer+3+to+request+human+organ+chip+experiments+instead+of+animal+validation+studies.">Is it time for reviewer 3 to request human organ chip experiments instead of animal validation studies.</a> Advanced Science. 7 (22), 2002030 (2020).</li><li>Jung, S. M., Kim, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+models+of+the+small+intestine+for+studying+intestinal+diseases.">In vitro models of the small intestine for studying intestinal diseases.</a> Frontiers in Microbiology. 12, 767038 (2022).</li><li>Nitsche, K. S., M&#252;ller, I., Malcomber, S., Carmichael, P. L., Bouwmeester, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implementing+organ-on-chip+in+a+next-generation+risk+assessment+of+chemicals:+a+review.">Implementing organ-on-chip in a next-generation risk assessment of chemicals: a review.</a> Archives of Toxicology. 96 (3), 711-741 (2022).</li><li>Kekilli, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Midkine+level+may+be+used+as+a+noninvasive+biomarker+in+Crohn's+disease.">Midkine level may be used as a noninvasive biomarker in Crohn's disease.</a> Turkish Journal of Medical Sciences. 50, 324-329 (2020).</li><li>Truzzi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spermidine-eugenol+supplement+preserved+inflammation-challenged+intestinal+cells+by+stimulating+autophagy.">Spermidine-eugenol supplement preserved inflammation-challenged intestinal cells by stimulating autophagy.</a> International Journal of Molecular Sciences. 24 (4), 4131 (2023).</li><li>Truzzi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Are+supplements+safe?+Effects+of+gallic+and+ferulic+acids+on+in+vitro+cell+models.">Are supplements safe? Effects of gallic and ferulic acids on in vitro cell models.</a> Nutrients. 12 (6), 1591 (2020).</li><li>Buckley, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualisation+of+multiple+tight+junctional+complexes+in+human+airway+epithelial+cells.">Visualisation of multiple tight junctional complexes in human airway epithelial cells.</a> Biological Procedures. Online. 20, 3 (2018).</li><li>Ghosh, R., Gilda, J. E., Gomes, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+necessity+of+and+strategies+for+improving+confidence+in+the+accuracy+of+western+blots.">The necessity of and strategies for improving confidence in the accuracy of western blots.</a> Expert Review of Proteomics. 11 (5), 549-560 (2014).</li></ol>

Det grundläggande rekonstruerade modellsystemet för tarmslemhinnan som presenteras här (Figur 6) kombinerar fysiologisk komplexitet (mer fysiologiskt relevanta 3D-cellkulturer som innehåller ett Caco-2-monolager med ett ECM-rikt lamina propria-stöd som innehåller fibroblaster och monocyter) med experimentell enkelhet (med hjälp av kommersiella mänskliga cellinjer för att producera standardiserade och lätt repeterbara system)13. Som sådant anses detta modell...

Tarmepitelbarriären, en encellig tjock inre beklädnad som innehåller olika typer av epitelceller, utgör den första fysiska försvarsbarriären eller gränssnittet mellan kroppens yttre och inre miljö 1,2. Enterocyter av kolumntyp utgör den vanligaste typen av epitelceller. Dessa är ansvariga för att upprätthålla epitelbarriärens integritet genom interaktioner mellan flera barriärkomponenter, inklusive täta korsningar (TJ), som spelar en viktig roll vid barriäråtdragning 1,3. TJ-strukturen består av intracellulära plackproteiner, såsom zonula occludens (ZO) och cingulin, som samarbetar med transmembranproteiner, inklusive ockludiner, claudiner och junctional adhesion molecules (JAMs) som bildar blixtlåsliknande struktur som tätt förbinder de närliggande cellerna 3,4. De transmembrana proteinerna reglerar den passiva paracellulära diffusionen av små föreningar och utesluter giftiga stora molekyler.
Potentiellt giftiga livsmedelsföreningar och livsmedelsföroreningar stimulerar inflammatorisk cytokinproduktion som stör epitelpermeabiliteten, aktiverar immunceller och orsakar kronisk tarmvävnadsinflammation 5,6,7. Däremot har olika antioxidanter och antiinflammatoriska fytokemikalier rapporterats minska inflammatoriskt cytokinuttryck och förbättra tarmens TJ-barriärintegritet genom återställande av TJ-proteinuttryck och sammansättning 4,6,8. Därför har regleringen av epitelbarriärens integritet av både fördelaktiga och skadliga föreningar lett till en ökad användning av både in vivo- och in vitro-modeller som syftar till att efterlikna tarmbarriären för läkemedelsscreening och toxicitetsstudier. Detta är särskilt relevant med tanke på det ökande intresset för att förstå patofysiologin för tarmsjukdomar (IBD), nekrotiserande enterokolit och cancer, som kan simuleras i experimentella modeller 8,9,10.
Det har funnits en efterfrågan på utveckling av cellbaserade in vitro-modeller för att uppnå målet med "3R" i djurförsök. Det handlar bland annat om ersättningsalternativ till användning av djur, minskning av antalet djur som används och förfining när det gäller att införa metoder som lindrar lidande 11,12,13. Dessutom är de underliggande molekylära, cellulära och fysiologiska mekanismerna mellan mänskliga och murina modeller (gnagare är den mest använda arten) distinkta, vilket leder till kontroverser om murina modellers effektivitet som prediktorer för mänskliga svar12,13. Många fördelar med in vitro-modeller av humana cellinjer inkluderar målbegränsade experiment, direkt observation och kontinuerlig analys13.
Monolager av encellig typ i tvådimensionella (2D) kulturer har fungerat som kraftfulla modeller. Dessa kan dock inte exakt reproducera den fysiologiska komplexiteten hos mänskliga vävnader 8,13,14. Som ett resultat av detta utvecklas 3D-odlingssystem med ständigt ökande förbättringar för att rekapitulera den fysiologiska komplexiteten hos både friska och sjuka tarmvävnader som nästa generations verktygslådor för riskbedömning13,14. Dessa modeller inkluderar 3D Transwell-ställningar med olika cellinjer, organoidkulturer och mikrofluidiska enheter (intestine-on-chip) med både cellinjer och organoider (härledda från både friska och sjuka vävnader)8,13,14.
Det 3D-protokoll för tarmekvivalent "frisk vävnad" som presenterades i den aktuella studien baserades på att hitta en balans mellan fysiologisk komplexitet och experimentell enkelhet13. Modellen är representativ för en 3D Transwell-struktur, bestående av tre cellinjer (enterocyter [guldstandarden kolonadenokarcinom Caco-2-linjen] med en stödjande immunkomponent [U937-monocyter och L929-fibroblaster]), som utgör ett standardiserat och lätt repeterbart system som är tillämpligt för preliminär screening av dietmolekyler av intresse för tarmepitelbarriärens integritet och immunsvar. Protokollet inkluderar paraffininbäddning för ljusmikroskopisk utvärdering av epitelbarriärens integritet med hjälp av fasta tarmekvivalenter. Fördelen med det nuvarande tillvägagångssättet är att många sektioner av de inbäddade vävnaderna kan fås att färgas för flera parametrar från ett enda experiment.

basic three-dimensional (3d) intestinal model system with an immune component

Det har skett en ökad användning av in vivo - och in vitro-tarmmodeller för att studera patofysiologin vid inflammatoriska tarmsjukdomar, för farmakologisk screening av potentiellt fördelaktiga ämnen och för toxicitetsstudier av potentiellt skadliga livsmedelskomponenter. Av relevans finns det för närvarande en efterfrågan på utveckling av cellbaserade in vitro-modeller för att ersätta djurmodeller. Här presenteras ett protokoll för en grundläggande, "frisk vävnad" tredimensionell (3D) tarmekvivalent modell med hjälp av cellinjer med den dubbla fördelen att den ger både experimentell enkelhet (standardiserat och lätt repeterbart system) och fysiologisk komplexitet (Caco-2-enterocyter med en stödjande immunkomponent av U937-monocyter och L929-fibroblaster). Protokollet inkluderar också paraffininbäddning för ljusmikroskopisk utvärdering av fasta tarmekvivalenter, vilket ger fördelen att analysera flera visuella parametrar från ett enda experiment. Hematoxylin och eosin (H&E) färgade snitt som visar Caco-2 kolonnceller som bildar ett tätt och regelbundet monolager i kontrollbehandlingar används för att verifiera modellens effektivitet som ett experimentellt system. Genom att använda gluten som en proinflammatorisk livsmedelskomponent inkluderar parametrar som analyseras från sektioner minskad tjocklek på monolager, såväl som störning och avlossning från den underliggande matrisen (H&E), minskat tight junction-proteinuttryck som visas från ockludinfärgning (kvantifierbart statistiskt) och immunaktivering av migrerande U937-celler som framgår av kluster av differentiering 14 (CD14) färgning och CD11b-relaterad differentiering till makrofager. Som visats genom att använda lipopolysackarid för att simulera tarminflammation, är ytterligare parametrar som kan mätas ökad slemfärgning och cytokinuttryck (såsom midkine) som kan extraheras från mediet före fixering. Den grundläggande tredimensionella (3D) tarmslemhinnemodellen och fixerade sektioner kan rekommenderas för studier av inflammatorisk status och barriärintegritet med möjlighet att analysera flera visuella kvantifierbara parametrar.

The intestinal epithelial barrier, a one-cell-thick internal lining containing different types of epithelial cells, constitutes the first physical defensive barrier or interface between the outside and the internal milieu of the body1,2. Columnar-type enterocytes constitute the most abundant type of epithelial cells. These are&#160;responsible for maintaining epithelial barrier integrity through interactions between several barrier components, including tight junctions (TJs), playing a significant role in barrier tightening1,3. The TJ structure consists of intracellular plaque proteins, such as zonula occludens (ZO) and cingulin, cooperating with transmembrane proteins, including occludins, claudins, and junctional adhesion molecules (JAMs) that form zipper-like structure tightly linking the neighboring cells3,4. The transmembrane proteins regulate the passive paracellular diffusion of small compounds and exclude toxic large molecules.
Potentially toxic food compounds and food contaminants stimulate inflammatory cytokine production that disrupts the epithelial permeability, activating immune cells and causing chronic intestinal tissue inflammation5,6,7. In contrast, various anti-oxidant and anti-inflammatory phytochemicals have been reported to reduce inflammatory cytokine expression and enhance intestinal TJ barrier integrity through the restoration of TJ protein expression and assembly4,6,8. Hence, the regulation of epithelial barrier integrity by both beneficial and harmful compounds has seen an increase in the use of both in vivo and in vitro models aimed at mimicking the intestinal barrier for pharmaceutical screening and toxicity studies. This is particularly relevant given the increasing interest in understanding the pathophysiology of intestinal bowel diseases (IBD), necrotizing enterocolitis, and cancer, which can be simulated in experimental models8,9,10.
There has been a demand for the development of cell-based in vitro models in order to achieve the objective of the &#8220;3Rs&#8221; in animal testing. These include replacement alternatives to the use of animals, reduction in the number of animals used, and refinement in adopting methods that alleviate distress11,12,13. Moreover, the underlying molecular, cellular, and physiological mechanisms between human and murine models (rodents being the most widely used species) are distinctive, leading to controversy regarding the efficacy of the murine models as predictors in human responses12,13. Numerous advantages of in vitro human cell-line models include target-restricted experimentation, direct observation, and continuous analysis13.
Single-cell-type monolayers in two-dimensional (2D) cultures have served as powerful models. However, these cannot precisely reproduce the physiological complexity of human tissues8,13,14. As a result, 3D&#160;culture systems are being developed with ever-increasing improvements to recapitulate the physiological complexity of both healthy and diseased intestinal tissues as next-generation risk assessment toolboxes13,14. These models include 3D Transwell scaffolds with diverse cell lines, organoid cultures, and microfluidic devices (intestine-on-chip) using both cell lines and organoids (derived from both healthy and diseased tissues)8,13,14.&#160;
The 3D &#8220;healthy tissue&#8221; intestinal equivalent protocol presented in the present study was based on striking a balance between physiological complexity and experimental simplicity13. The model is representative of a 3D Transwell scaffold, comprised of three cell lines (enterocytes [the gold-standard colon adenocarcinoma Caco-2 line] with a supporting immune component [U937 monocytes and L929 fibroblasts]), constituting a standardized and easily repeatable system applicable for the preliminary screening of dietary molecules of interest on intestinal epithelial barrier integrity and immune response. The protocol includes paraffin embedding for light microscopic evaluation of epithelial barrier integrity using fixed intestinal equivalents. The advantage of the present approach is that numerous sections of the embedded tissues can be made to stain for multiple parameters from a single experiment.

Författare Spotlight: Undersöker effekterna av föreningar på tarmvävnad med hjälp av 3D mänskliga cellinjemodeller 

Grundläggande tredimensionellt (3D) tarmmodellsystem med en immunkomponent

The scope of the work is to use these in vitro three-dimensional human cell line models to investigate the fact of beneficial as well as helpful compounds on intestinal tissue. The models can be used to further research understanding and also as a basic drug model. Using the plant-derived compounds, spermidine and eugenol, both separately and together in supplement form, we measure beneficial increases in autophagy and decreases in inflammation using these models.Then we will also able to show the potentially harmful effect of gluten extracted from certain wheat varieties on intestinal tissues. We are currently using economically priced, standardized, and easily repeatable in vitro system that better reflect the physiology of the human intestine as an alternative to animal models. Since we also use commercial human cell line rather than plant-derived cells, the responses from the study are more applicable to the general population.The protocol is based entirely on the use of different lines. These renders the model most standardized and reproducible. Furthermore, the simultaneous cultivation of different cell lines, enterocytes, fibroblasts, and immune system cells, allows for cellular responses that are closer to what happens in the patient.

Den första viktiga aspekten är att bestämma acceptansen av den grundläggande 3D-tarmekvivalenta slemhinnan för experimentella ändamål. Detta utförs med den mest använda fläcken i histologiska och histopatologiska laboratorier, nämligen hematoxylin (fläckar kärnmaterial djupt blålila färg) och eosin (fläckar cytoplasmatiskt material i olika nyanser av rosa). H&E-färgningen utförs först på en obehandlad kontroll, som odlas under samma förhållanden och tidsram som de experimentella behandlingarna. Frå...

Watch this Scientific Journal Video about Investigating the Effects of Compounds on Intestinal Tissue Using 3D Human Cell Line Models at JoVE.com

Här beskriver vi hur man konstruerar ett grundläggande tredimensionellt (3D) testinalt cellinjemodellsystem och ett paraffininbäddningsprotokoll för ljusmikroskopisk utvärdering av fasta tarmekvivalenter. Färgning av utvalda proteiner möjliggör analys av flera visuella parametrar från ett enda experiment för potentiell användning i prekliniska läkemedelsscreeningstudier.

There has been an increase in the use of in vivo and in vitro intestinal models to study the pathophysiology of inflammatory intestinal diseases, for the ...

Omfattningen av arbetet är att använda dessa in vitro tredimensionella humana cellinjemodeller för att undersöka det faktum att det finns fördelaktiga såväl som användbara föreningar på tarmvävnad. Modellerna kan användas för att öka förståelsen för forskningen och även som en grundläggande läkemedelsmodell. Med hjälp av de växtbaserade föreningarna, spermidin och eugenol, både var för sig och tillsammans i form av kosttillskott, mäter vi positiva ökningar av autofagi och minskningar av inflammation med hjälp av dessa modeller.Då kommer vi också att kunna visa den potentiellt skadliga effekten av gluten utvunnet från vissa vetesorter på tarmvävnader. Vi använder för närvarande ekonomiskt prissatta, standardiserade och lätt repeterbara in vitro-system som bättre återspeglar fysiologin i den mänskliga tarmen som ett alternativ till djurmodeller. Eftersom vi också använder kommersiella mänskliga cellinjer snarare än växtbaserade celler, är svaren från studien mer tillämpliga på den allmänna befolkningen.Protokollet bygger helt och hållet på användningen av olika linjer. Dessa gör modellen mest standardiserad och reproducerbar. Dessutom möjliggör den samtidiga odlingen av olika cellinjer, enterocyter, fibroblaster och immunsystemceller cellulära svar som ligger närmare det som händer hos patienten.

basic-three-dimensional-3d-intestinal-model-system-with-an-immune

Research

JoVE Journal

Biology

Basic Three-Dimensional (3D) Intestinal Model System with an Immune Component

There has been an increase in the use of in vivo and in vitro intestinal models to study the pathophysiology of inflammatory intestinal diseases, for the pharmacological screening of potentially beneficial substances, and for toxicity studies on potentially harmful food components. Of relevance, there is a current demand for the development of cell-based in vitro models to substitute animal models. Here, a protocol for a basic, &#8220;healthy tissue&#8221; three-dimensional (3D) intestinal equivalent model using cell lines is presented with the dual benefit of providing both experimental simplicity (standardized and easily repeatable system) and physiological complexity (Caco-2 enterocytes with a supporting immune component of U937 monocytes and L929 fibroblasts). The protocol also includes paraffin embedding for light microscopic evaluation of fixed intestinal equivalents, thereby providing the advantage of analyzing multiple visual parameters from a single experiment. Hematoxylin and eosin (H&#38;E) stained sections showing the Caco-2 columnar cells forming a tight and regular monolayer in control treatments are used to verify the efficacy of the model as an experimental system. Using gluten as a pro-inflammatory food component, parameters analyzed from sections include reduced monolayer thickness, as well as disruption and detachment from the underlying matrix (H&#38;E), decreased tight junction protein expression as shown from occludin staining (quantifiable statistically), and immune-activation of migrating U937 cells as evidenced from the cluster of differentiation 14 (CD14) staining and CD11b-related differentiation into macrophages. As shown by using lipopolysaccharide to simulate intestinal inflammation, additional parameters that can be measured are increased mucus staining and cytokine expression (such as midkine) that can be extracted from the medium prior to fixation. The basic three-dimensional (3D) intestinal mucosa model and fixed sections can be recommended for inflammatory status and barrier integrity studies with the possibility of analyzing multiple visual quantifiable parameters.

Here we describe constructing a basic three-dimensional (3D) intestinal cell line model system and a paraffin embedding protocol for light microscopic evaluation of fixed intestinal equivalents. Staining of selected proteins permits the analysis of multiple visual parameters from a single experiment for potential use in preclinical drug screening studies.

Preparation of a Basic 3D Reconstructed Intestinal Mucosa Model for Microscopic Evaluation of Fixed Intestinal Equivalents

To begin, select a 24-well plate containing inserts with 0.4 micron filters. Using a pipette, add 500 microliters of HBSS below and above the filter inserts. Then close the multi-well plate and place it in an incubator for two hours.After incubation, carefully aspirate the HBSS from the plate. Prepare a cell-free collagen solution in a sterile 50 milliliter tube in DMEM on ice. Add 250 microliters of collagen above the membrane filter and place the lid on the plate.Allow the solution to polymerize at room temperature. Next, remove the L-929 fibroblast cell culture from the incubator. Add two milliliters of a pre-warmed trypsin EDTA solution to the flask and place it in an incubator for three to five minutes.Transfer the cell suspension to a sterile 15 milliliter tube and centrifuge at 645 G for five minutes. Using a vacuum pump, aspirate the supernatant and resuspend the pellet in one milliliter of DMEM. Add 20 microliters of cell suspension into a tube containing 20 microliters of Trypan Blue solution.And use a cell counting chamber to evaluate the cell density. Next, remove the U-937 monocyte cell culture from the incubator. Centrifuge the cell suspension and resuspend the pellet in one milliliter of RPMI.After ensuring cells are homogeneously suspended, count them using a cell counting chamber. Next, prepare cell suspensions containing 50, 000 L-929 and 15, 000 U-937 cells respectively in 50 microliters of DMEM. Add each 50 microliter cell suspension to 450 microliters of collagen and mix thoroughly.Overlay the pre-coded cell-free lamina propria with 500 microliters of the collagen cell solution. Close the plate and place it in an incubator for two hours to allow the solution to set. Next, remove the Caco-2 cell culture from the incubator.Using a vacuum pump, aspirate the medium and rinse the cells with 10 milliliters of PBS. Add five milliliters of PBS trypsin EDTA solution and place it in an incubator for five to eight minutes. Then centrifuge the cell suspension and resuspend the pellet in one milliliter of DMEM.After counting, prepare a cell suspension containing 150, 000 Caco-2 cells in 50 microliters of DMEM. Place the plate in a laminar flow hood for 10 minutes before transferring it to the incubator. After 30 minutes, add 500 microliters of the DMEM above the reconstructed model and 500 microliters below the filter and return the plate to the incubator.The next day, carefully replace the medium with 500 microliters of fresh DMEM above and below the filter respectively.

Framställning av en grundläggande 3D-rekonstruerad tarmslemhinnemodell för mikroskopisk utvärdering av fasta tarmekvivalenter

Paraffin Embedding of a Basic 3D Reconstructed Intestinal Mucosa Model for Immune-Histochemical Staining

For paraffin embedding of cells, set the paraffin machine to 58 degrees Celsius. Using pliers, transfer the membrane inserts to clean wells of a sterile 24-well plate. Add 500 microliters of 37%buffered formalin and PBS above the filter, and one milliliter below the filter.Close the lid and leave the plate in a fume hood for two hours. Once the lamina propria is detached from the membrane insert, transfer the intestinal mucosa into a beaker containing 25 milliliters of 35%ethanol, and incubate for 10 minutes. After dehydration in increasing ethanol concentrations, place the samples in 50 milliliters of xylene or a histological clearing agent for 10 to 20 minutes.Once the samples are transparent, place them in a metal tissue cassette holder and submerge them in liquid paraffin inside a heated machine. After 45 minutes, use a microtome to cut four micron sections. Place the cut section on the slides and dry them in an oven at 37 degrees Celsius for 24 hours.An acceptable 3-D intestinal equivalent mucosa model consists of Caco-2 cells formed in a tight and regular monolayer above the extracellular-matrix-rich lamina propria. Unacceptable models include those showing excessive growth, disorganized epithelial layers, malformation or lack of epithelial layer formation. The proinflammatory effect of wheat protein with a high gluten content disrupted the cellular monolayer and reduced the thickness of the epithelial layer compared to the control group.The occludin protein content was significantly higher in the control group than in the group exposed to gluten protein. CD14 and CD11b staining of U937 monocytes showed that wheat protein with a high gluten content activated the monocytes, and induced their migration and differentiation into macrophages. Under the lipopolysaccharide challenge, Caco-2 cells increased mucus production and the release of the inflammatory marker midkine.