Name: Author Spotlight: Advancing Male Infertility Research by Unraveling Sperm Metabolism and Mitochondrial Function
Uploaded: 2023-06-23T14:35:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Advancing Male Infertility Research by Unraveling Sperm Metabolism and Mitochondrial Function at JoVE.com

Vi vill tacka Fertilab Andrology-kliniken, särskilt José María Montes och Andrea Torrents, för att de gav oss tillgång till donatorer. Finansiering: A.C. stöds av bidrag från Universidad de la República (CSIC_2018, Espacio Interdisciplinario_2021). Ytterligare finansiering erhölls från Programa de Desarrollo de Ciencias Básicas (PEDECIBA, Uruguay). P.I. och R.S. stöds av Universidad de la República (I+D, CSIC 2014; I+D, CSIC 2016, Iniciación a la Investigación, CSIC 2019 och FMV_1_2017_1_136490 ANII- Uruguay). P.I. stöds av POS_FMV_2018_1_1007814 och CAP-UDELAR 2020. Siffrorna illustrerades med hjälp av Biorender.com.

Experimenten godkändes av den etiska kommittén vid Facultad de Medicina de la Universidad de la República, Montevideo, Uruguay.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65493/65493fig01.jpg"> Figur 1: Arbetsflöde för högupplöst respirometri för att bedöma mitokondriell funktion i intakta och permeabiliserade mänskliga spermier. Protokollet delades in i fyra olika steg: 1) be...

Determining Respiration in Human Sperm Cells by High-Resolution Respirometry

<ol>
	<li>Agarwal, A., Mulgund, A., Hamada, A., Chyatte, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+unique+view+on+male+infertility+around+the+globe.">A unique view on male infertility around the globe.</a> Reproductive Biology and Endocrinology. 13, 37 (2015).</li><li>Guzick, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sperm+morphology,+motility,+and+concentration+in+fertile+and+infertile+men.">Sperm morphology, motility, and concentration in fertile and infertile men.</a> The New England Journal of Medicine. 345 (19), 1388-1393 (2001).</li><li>Wang, C., Swerdloff, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limitations+of+semen+analysis+as+a+test+of+male+fertility+and+anticipated+needs+from+newer+tests.">Limitations of semen analysis as a test of male fertility and anticipated needs from newer tests.</a> Fertility and Sterility. 102 (6), 1502-1507 (2014).</li><li>Amaral, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Energy+metabolism+in+mammalian+sperm+motility.">Energy metabolism in mammalian sperm motility.</a> WIREs Mechanisms of Disease. 14 (5), e1569 (2022).</li><li>Leung, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-cell+structures+of+conserved+supramolecular+protein+arrays+at+the+mitochondria-cytoskeleton+interface+in+mammalian+sperm.">In-cell structures of conserved supramolecular protein arrays at the mitochondria-cytoskeleton interface in mammalian sperm.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (45), e2110996118 (2021).</li><li>Moraes, C. R., Meyers, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+sperm+mitochondrion:+Organelle+of+many+functions.">The sperm mitochondrion: Organelle of many functions.</a> Animal Reproduction Science. 194, 71-80 (2018).</li><li>Cassina, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defective+human+sperm+cells+are+associated+with+mitochondrial+dysfunction+and+oxidant+production.">Defective human sperm cells are associated with mitochondrial dysfunction and oxidant production.</a> Biology of Reproduction. 93 (5), 119 (2015).</li><li>Marchetti, C., Obert, G., Deffosez, A., Formstecher, P., Marchetti, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Study+of+mitochondrial+membrane+potential,+reactive+oxygen+species,+DNA+fragmentation+and+cell+viability+by+flow+cytometry+in+human+sperm.">Study of mitochondrial membrane potential, reactive oxygen species, DNA fragmentation and cell viability by flow cytometry in human sperm.</a> Human Reproduction. 17 (5), 1257-1265 (2002).</li><li>Amaral, A., Louren&#231;o, B., Marques, M., Ramalho-Santos, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+functionality+and+sperm+quality.">Mitochondria functionality and sperm quality.</a> Reproduction. 146 (5), R163-R174 (2013).</li><li>Durairajanayagam, D., Singh, D., Agarwal, A., Henkel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Causes+and+consequences+of+sperm+mitochondrial+dysfunction.">Causes and consequences of sperm mitochondrial dysfunction.</a> Andrologia. 53 (1), e13666 (2021).</li><li>Uribe, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+the+fluorescent+dye+tetramethylrhodamine+methyl+ester+perchlorate+for+mitochondrial+membrane+potential+assessment+in+human+spermatozoa.">Use of the fluorescent dye tetramethylrhodamine methyl ester perchlorate for mitochondrial membrane potential assessment in human spermatozoa.</a> Andrologia. 49 (9), e12753 (2017).</li><li>Storey, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+sperm+metabolism:+Oxygen+and+sugar,+friend+and+foe.">Mammalian sperm metabolism: Oxygen and sugar, friend and foe.</a> The International Journal of Developmental Biology. 52 (5-6), 427-437 (2008).</li><li>Tourmente, M., Sansegundo, E., Rial, E., Roldan, E. R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capacitation+promotes+a+shift+in+energy+metabolism+in+murine+sperm.">Capacitation promotes a shift in energy metabolism in murine sperm.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 950979 (2022).</li><li>Gnaiger, E., Dykens, J. A., Will, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+12+-+Polarographic+oxygen+sensors,+the+oxygraph,+and+high-resolution+respirometry+to+assess+mitochondrial+function.">Chapter 12 - Polarographic oxygen sensors, the oxygraph, and high-resolution respirometry to assess mitochondrial function.</a> Drug-Induced Mitochondrial Dysfunction. , 325-352 (2008).</li><li>Brand, M. D., Nicholls, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+mitochondrial+dysfunction+in+cells.">Assessing mitochondrial dysfunction in cells.</a> Biochemical Journal. 435 (2), 297-312 (2011).</li><li>Awadhpersad, R., Jackson, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+respirometry+to+assess+bioenergetics+in+cells+and+tissues+using+chamber-+and+plate-based+respirometers.">High-resolution respirometry to assess bioenergetics in cells and tissues using chamber- and plate-based respirometers.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (176), e63000 (2021).</li><li>Chance, B., Williams, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+and+rapid+assay+of+oxidative+phosphorylation.">A simple and rapid assay of oxidative phosphorylation.</a> Nature. 175 (4469), 1120-1121 (1955).</li><li>Li, Z., Graham, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+mitochondrial+oxygen+consumption+using+a+Clark+electrode.">Measurement of mitochondrial oxygen consumption using a Clark electrode.</a> Methods in Molecular Biology. 837, 63-72 (2012).</li><li>Stendardi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+mitochondrial+respiratory+efficiency+during+in+vitro+capacitation+of+human+spermatozoa.">Evaluation of mitochondrial respiratory efficiency during in vitro capacitation of human spermatozoa.</a> International Journal of Andrology. 34 (3), 247-255 (2011).</li><li>Ferramosca, A., Focarelli, R., Piomboni, P., Coppola, L., Zara, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen+uptake+by+mitochondria+in+demembranated+human+spermatozoa:+A+reliable+tool+for+the+evaluation+of+sperm+respiratory+efficiency.">Oxygen uptake by mitochondria in demembranated human spermatozoa: A reliable tool for the evaluation of sperm respiratory efficiency.</a> International Journal of Andrology. 31 (3), 337-345 (2008).</li><li>Ferramosca, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+human+sperm+mitochondrial+respiration+efficiency+by+plant+polyphenols.">Modulation of human sperm mitochondrial respiration efficiency by plant polyphenols.</a> Antioxidants. 10 (2), 217 (2021).</li><li>Gnaiger, E., Steinlechner-Maran, R., M&#233;ndez, G., Eberl, T., Margreiter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+mitochondrial+and+cellular+respiration+by+oxygen.">Control of mitochondrial and cellular respiration by oxygen.</a> Journal of Bioenergetics and Biomembranes. 27 (6), 583-596 (1995).</li><li>. O2k Quality Control 1: Polarographic oxygen sensors and accuracy of calibration Available from: <a target="_blank" href="https://www.bioblst.at/images/archive/7/77/20210819114548%21MiPNet06.03_POS-Calibration-SOP.pdf">https://www.bioblst.at/images/archive/7/77/20210819114548%21MiPNet06.03_POS-Calibration-SOP.pdf</a> (2020)</li><li>WHO Laboratory Manual for the Examination and Processing of Human Semen. World Health Organization Available from: <a target="_blank" href="https://www.who.int/publications/i/item/9789240030787">https://www.who.int/publications/i/item/9789240030787</a> (2010)</li><li>. O2k-protocols SOP: O2k quality control 1 Available from: <a target="_blank" href="https://www.bioblast.at/images/9/9c/MiPNet06.03_POS-Calibration-SOP_DatLab8.pdf">https://www.bioblast.at/images/9/9c/MiPNet06.03_POS-Calibration-SOP_DatLab8.pdf</a> (2021)</li><li>Gnaiger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Mitochondrial Pathways and Respiratory Control. , (2012).</li><li>Steinlechner-Maran, R., Eberl, T., Kunc, M., Margreiter, R., Gnaiger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen+dependence+of+respiration+in+coupled+and+uncoupled+endothelial+cells.">Oxygen dependence of respiration in coupled and uncoupled endothelial cells.</a> The American Journal of Physiology. 271, C2053-C2061 (1996).</li><li>Holt, W. V., Van Look, K. J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concepts+in+sperm+heterogeneity,+sperm+selection+and+sperm+competition+as+biological+foundations+for+laboratory+tests+of+semen+quality.">Concepts in sperm heterogeneity, sperm selection and sperm competition as biological foundations for laboratory tests of semen quality.</a> Reproduction. 127 (5), 527-535 (2004).</li><li>Sousa, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Not+all+sperm+are+equal:+Functional+mitochondria+characterize+a+subpopulation+of+human+sperm+with+better+fertilization+potential.">Not all sperm are equal: Functional mitochondria characterize a subpopulation of human sperm with better fertilization potential.</a> PloS One. 6 (3), e18112 (2011).</li><li>Moscatelli, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell-based+evaluation+of+sperm+progressive+motility+via+fluorescent+assessment+of+mitochondria+membrane+potential.">Single-cell-based evaluation of sperm progressive motility via fluorescent assessment of mitochondria membrane potential.</a> Scientific Reports. 7, 17931 (2017).</li><li>Ferreira, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+mitochondrial+activity+upon+CatSper+channel+activation+is+required+for+mouse+sperm+capacitation.">Increased mitochondrial activity upon CatSper channel activation is required for mouse sperm capacitation.</a> Redox Biology. 48, 102176 (2021).</li><li>Irigoyen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+metabolism+determines+the+functional+status+of+human+sperm+and+correlates+with+semen+parameters.">Mitochondrial metabolism determines the functional status of human sperm and correlates with semen parameters.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 926684 (2022).</li></ol>

HRR är kritiskt beroende av flera steg: (a) underhållet av utrustningen, (b) noggrann kalibrering av syresensorerna, (c) titreringen av frånkopplaren26, och slutligen, (d) adekvat användning av index som representerar mitokondriell funktion. Underhållet av utrustningen är avgörande. Det rekommenderas att byta ut membranen på den polarografiska syresensorn regelbundet och att korrigera den instrumentella bakgrunden. Omfattande tvättning efter insamling av spermier från kamrarna är avgör...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/65493">High-Resolution Respirometry to Assess Mitochondrial Function in Human Spermatozoa</a>. The Protocol and Representative Result&#160;sections were&#160;updated.
Step 2.4.12 of the Protocol was updated from:
Finally, inject 1 &#181;L of 5 mM antimycin A (2.5 &#181;M final concentration). This is a complex II inhibitor to discriminate between the mitochondrial and residual oxygen consumption (non-mitochondrial respiration). For the analysis of complex I, add 1 &#181;L of 1 mM rotenone (0.5 &#181;M final concentration), an inhibitor of this complex, instead of AA. Measure the oxygen consumption until the signal decreases and stabilizes.
to:
Finally, inject 1 &#181;L of 5 mM antimycin A (2.5 &#181;M final concentration). This is a complex III inhibitor to discriminate between the mitochondrial and residual oxygen consumption (non-mitochondrial respiration). For the analysis of complex I, add 1 &#181;L of 1 mM rotenone (0.5 &#181;M final concentration), an inhibitor of this complex, instead of AA. Measure the oxygen consumption until the signal decreases and stabilizes.
Figure 3 in the Representative Results section was updated from:
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65493/65493fig03.jpg" /> 
Figure 3: Determination of the optimal concentration of digitonin for the permeabilization of human sperm cells. The respiration rates were measured at 37 &#176;C in MRM medium with glutamate, malate, and adenosine diphosphate. (A) Representative respiratory trace. The blue line is the O2 concentration, and the red line represents the O2 flow per volume correlated. (B) Mitochondria respiration rate means &#177; standard error, n = 4. The red arrow represents the optimal concentration. Abbreviation: dig = digitonin. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65493/65493fig03large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
to:
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65493/65493fig3v2.jpg" /> 
Figure 3: Determination of the optimal concentration of digitonin for the permeabilization of human sperm cells. The respiration rates were measured at 37 &#176;C in MRM medium with glutamate, malate, and adenosine diphosphate. (A) Representative respiratory trace. The blue line is the O2 concentration, and the red line represents the O2 flow per volume correlated. (B) Mitochondria respiration rate means &#177; standard error, n = 4. The red arrow represents the optimal concentration. Abbreviation: dig = digitonin. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65493/65493fig3v2large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/65493">High-Resolution Respirometry to Assess Mitochondrial Function in Human Spermatozoa</a>. The Protocol and Representative Result&#160;sections were&#160;updated.

Erratum: High-Resolution Respirometry to Assess Mitochondrial Function in Human Spermatozoa

Manlig infertilitet beräknas stå för 40-50 % av alla fall av infertilitet hos par1. Konventionell spermaanalys spelar en avgörande roll för att bestämma manlig fertilitet; Cirka 15 % av infertila män har dock normala spermieparametrar2. Dessutom ger rutinmässig spermaanalys begränsad information om spermiernas funktion och återspeglar inte subtila spermiedefekter3.
Spermiernas mitokondrier har en speciell struktur, eftersom de är ordnade som ett spiralformat hölje runt flagellen. Mitokondrierskidan innehåller ett varierande antal mitokondrier som är förbundna med intermitokondriella länkar och förankrade i cytoskelettet genom ordnade proteinarrangemang på det yttre mitokondriemembranet 4,5. Denna struktur gör det särskilt svårt att isolera spermiernas mitokondrier. Därför använder de flesta studier av spermiers mitokondriella funktion in situ-analyser eller demembranerade spermier6.
Spermiernas mitokondriella struktur och funktion har konsekvent kopplats till manlig infertilitet 7,8,9,10,11, vilket tyder på att analys av strukturen och funktionen hos dessa organeller kan vara en bra kandidat för att ingå i spermieanalys.
Mitokondrier spelar en viktig roll i cellulär energimetabolism, särskilt genom att använda syre för att producera adenosintrifosfat (ATP) genom oxidativ fosforylering (OXPHOS). I synnerhet när det gäller spermier är källan till ATP (glykolys vs. OXPHOS) omtvistad, och mycket av data är fortfarande kontroversiella och beror på olika experimentella metoder 4,12,13. Mätningar av andning med oximetri ger betydande insikter om cellens mitokondriella andningskapacitet, mitokondriella integritet och energimetabolism14,15,16. Traditionellt har denna teknik utförts med hjälp av Clarks syrgaselektrod – ett instrument som har använts för att mäta mitokondriell andning i mer än 50 år17,18. Dessutom har spermiernas mitokondriella syreförbrukning analyserats med hjälp av den klassiska Clark-syrgaselektroden 19,20,21. Högupplöst respirometri (HRR) med hjälp av oxigrafer (Oroboros) ger högre känslighet än användning av klassiska respirometriapparater22. Oxigraferna består av två kammare med injektionsportar, och varje kammare har en polarografisk syresensor. Med denna teknik är det möjligt att analysera vävnadsglas, celler och isolerade mitokondriella suspensioner. Provet rörs kontinuerligt om i kammaren, och under experimentet mäts syreförbrukningen och syrehastigheterna beräknas med hjälp av specifik programvara. Kamrarna visar minskat syreläckage, vilket är en fördel jämfört med de konventionella syrgaselektroderna14,23.
Liksom för andra celler är känsligheten hos HRR-utrustning högre när det gäller spermier än för konventionell respirometri, vilket innebär att HRR-utrustning kan användas för analys av ett begränsat antal intakta eller permeabiliserade spermier. Det finns två huvudstrategier för att bedöma spermiernas mitokondriella funktion med HRR: (a) mätning av syreförbrukningen i intakta celler, vilket innebär att reproducera andningsfunktionen i ett medium som innehåller substrat såsom glukos, eller (b) mätning av syreförbrukningen i permeabiliserade celler med hjälp av ett av OXPHOS-komplexen, med tillägg av specifika substrat för att övervaka varje funktion separat.
I den aktuella studien beskriver vi användningen av HRR för att bestämma mitokondriell andning i humana spermier.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acid free- Bovine serum albumine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A8806</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#39;-diphosphate monopotassium salt dihydrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A5285</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animycin A from streptomyces sp.</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A8674</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C4901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>carbonyl cyanide-P- trifluoromethoxy-phenylhydrazone</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C2920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DatLab sofware version 4,2</td>
			<td>Oroboros Instruments GmbH</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digitonin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E4378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L glutamic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G1251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L malic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulphate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M7506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microliter Syringes</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>87900 or 80400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope camera</td>
			<td>Basler</td>
			<td>acA780-75gc</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Eclipse E200 with phase contrast 10X Ph+</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monopotassium phosphate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M1254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligomycin A</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>75351</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygraph-2 K</td>
			<td>Oroboros Instruments GmbH</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P3911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power O2k-Respirometer</td>
			<td>Oroboros Intruments</td>
			<td>10033-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotenone</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>R8875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saccharose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S0389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium lactate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L7022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P2256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sperm class analyzer 6.3.0.59 Evolution-SCA Research</td>
			<td>Microptic</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sperm Counting Chamber DRM-600</td>
			<td>Millennium Sciences CELL-VU</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Succinate disodium salt</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>W327700</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-resolution respirometry to assess mitochondrial function in human spermatozoa

Spermakvaliteten studeras ofta genom rutinmässig spermaanalys, som är beskrivande och ofta ofullständig. Manlig infertilitet är förknippad med förändrad mitokondriell aktivitet hos spermier, så mätningen av spermiernas mitokondriella funktion är en indikator på spermiekvalitet. Högupplöst respirometri är en metod för att mäta syreförbrukningen hos celler eller vävnader i ett slutet kammarsystem. Denna teknik kan implementeras för att mäta andning i mänskliga spermier och ger information om kvaliteten och integriteten hos spermiernas mitokondrier. Högupplöst respirometri gör att cellerna kan röra sig fritt, vilket är en a priori-fördel när det gäller spermier. Denna teknik kan tillämpas med intakta eller permeabiliserade spermier och möjliggör studier av intakta spermiers mitokondriella funktion och aktiviteten hos enskilda andningskedjekomplex. Det högupplösta oxigrafinstrumentet använder sensorer för att mäta syrekoncentrationen i kombination med känslig programvara för att beräkna syreförbrukningen. Uppgifterna används för att beräkna andningsindex baserat på syreförbrukningskvoterna. Följaktligen är indexen proportionerna av två syreförbrukningshastigheter och är internt normaliserade till cellantalet eller proteinmassan. De respiratoriska indexen är en indikator på spermiernas mitokondriella funktion och dysfunktion.

Male infertility is estimated to account for 40%-50% of all cases of infertility in couples1. Conventional semen analysis plays a crucial part in determining male fertility; however, approximately 15% of infertile men have normal sperm parameters2. In addition, routine semen analysis provides limited information about sperm function and does not reflect subtle sperm defects3.
Sperm mitochondria have a special structure, as they are arranged as a helical sheath around the flagella. The mitochondrial sheath contains a variable number of mitochondria connected by intermitochondrial linkers and anchored to the cytoskeleton by ordered protein arrangements on the outer mitochondrial membrane4,5. This structure makes it particularly difficult to isolate sperm mitochondria. Therefore, most studies of sperm mitochondrial function use in situ analyses or demembranated sperm6.
Sperm mitochondrial structure and function have been consistently linked to male infertility7,8,9,10,11, suggesting that analysis of the structure and function of these organelles may be a good candidate for inclusion in sperm analysis.
Mitochondria play an important role in cellular energy metabolism, particularly by using oxygen to produce adenosine triphosphate (ATP) through oxidative phosphorylation (OXPHOS). In spermatozoa, in particular, the source of ATP (glycolysis vs. OXPHOS) is disputed, and much of the data remains controversial and depends on different experimental approaches4,12,13. Measurements of respiration by oximetry offer significant insights into the mitochondrial respiratory capacity, mitochondrial integrity, and energy metabolism of the cell14,15,16. Traditionally, this technique has been performed using the Clark oxygen electrode-an instrument that has been used to measure mitochondrial respiration for more than 50 years17,18. In addition, sperm mitochondrial oxygen consumption has been analyzed using the classic Clark oxygen electrode19,20,21. High-resolution respirometry (HRR) using oxygraphs (Oroboros) provides higher sensitivity than using classical respirometry devices22. The oxygraphs are composed of two chambers with injection ports, and each chamber has a polarographic oxygen sensor. With this technique, it is possible to analyze tissue slides, cells, and isolated mitochondrial suspensions. The specimen is continuously stirred in the chamber, and during the experiment, the oxygen consumption is measured, and the oxygen rates are calculated using specific software. The chambers show reduced oxygen leakage, which is an advantage over the conventional oxygen electrode devices14,23.
As with other cells, in the case of spermatozoa, the sensitivity of HRR equipment is higher than for conventional respirometry, meaning that HRR equipment can be used for the analysis of a limited number of intact or permeabilized sperm cells. There are two main strategies for assessing sperm mitochondrial function by HRR: (a) measuring the oxygen consumption in intact cells, which involves reproducing the respiratory function in a medium containing substrates such as glucose, or (b) measuring the oxygen consumption in permeabilized cells using one of the OXPHOS complexes, with the addition of specific substrates to monitor each function separately.
In the present study, we describe the use of HRR to determine mitochondrial respiration in human sperm cells.

Author Spotlight: Advancing Male Infertility Research by Unraveling Sperm Metabolism and Mitochondrial Function 

Högupplöst respirometri för att bedöma mitokondriell funktion hos humana spermier

Bestämning av den optimala koncentrationen av digitonin i spermier I detta protokoll presenterar vi användningen av HRR för att övervaka realtidsförändringar i OXPHOS i humana spermier. Eftersom metoden kan användas för att analysera intakta eller digitoninpermeabiliserade spermier, presenterar vi först den standardisering av digitoninkoncentrationen som krävs för att permeabilisera spermier (Figur 3).
Digitonin används för kemisk ...

Watch this Scientific Journal Video about Advancing Male Infertility Research by Unraveling Sperm Metabolism and Mitochondrial Function at JoVE.com

Analys av spermiernas mitokondriella funktion med högupplöst respirometri gör det möjligt att mäta syreförbrukningen hos fritt rörliga spermier i ett system med sluten kammare. Tekniken kan användas för att mäta andning i mänskliga spermier, vilket ger information om spermiernas mitokondriella egenskaper och integritet.

Semen quality is often studied by routine semen analysis, which is descriptive and often inconclusive. Male infertility is associated with altered sperm ...

Vårt arbete är inriktat på manlig infertilitet, särskilt på spermiers mitokondrier. Spermier förlorar det mesta av sin cytoplast och organeller under spermatogenesen, men de behåller mitokondrierna. Förutom sin huvudsakliga roll i ATP-produktionen deltar mitokondrier i produktionen av reaktiva syrearter, kalciumlagring och apoptos.Spermiernas mitokondriers roll är inte helt klarlagd. Att förstå mitokondriernas funktion i spermier är nyckeln till att upplysa om spermiernas energimetabolism och manlig infertilitet. Vi har visat att mitokondriell funktion hos mänskliga spermier korrelerar med spermiogramparametrar.Vår grupp visar att mitokondrier är den huvudsakliga källan till superoxid vid normala och patologiska tillstånd. Dessutom har vi kunnat fastställa metabola cutoff-värden med hjälp av högupplöst respirometri som kan skilja mellan män med onormalt och normalt spermiogram. Spermiogram är den gyllene standardlaboratoriestudien för att analysera manlig infertilitet.Den ger mycket information, men återspeglar inte septala spermiedefekter. Även om många studier har föreslagits, ingår för närvarande inte mätning av mitokondriell funktion i studien. Högupplöst respirometri har en högre känslighet än konventionella Clark-elektroder.Med detta experimentella tillvägagångssätt kan vi analysera varje steg i mitokondriell aktivitet. Vi fastställer ATP-produktion, andningsreservkapacitet och efterlevnadsstatus. Dessutom gör det att vi kan studera experimentfjädring utan att påverka rörelse och funktion.