Vores protokol kvantificerer adeno-associerede virale vektorer i komplekse matricer. Nøjagtig detektion og kvantificering er afgørende for at vurdere deres ydeevne i kliniske forsøg. Denne protokol søger specifikt at udfylde de nuværende lovgivningsmæssige huller i udformningen af molekylære undersøgelser, der er i overensstemmelse med god laboratoriepraksis.
Som en del af viral vektorudvikling kræver reguleringsagenturer vurdering af vektorbioafgivelse. ddPCR er en lovende teknologi til denne vurdering, da den giver mulighed for nøjagtig kvantificering uden brug af en standardkurve og forbedret følsomhed sammenlignet med qPCR. Nøjagtig kvantificering i de komplekse matricer, der opstår i kliniske omgivelser, såsom tårer, kan være udfordrende at validere på grund af PCR-interferens og hæmning.
Begrænsede kliniske prøvemængder kan også begrænse evnen til at påvise sjældne hændelser, hvis analysen ikke er tilstrækkelig følsom. Vores tilgang udvikler en repeterbar og tilpasningsdygtig ddPCR-baseret ramme til validering af assays til brug i regulerede undersøgelser. Denne metode undgår et specifikt DNA-ekstraktionstrin, hvilket giver mulighed for mere strømlinet validering og giver klare kriterier for evaluering af analyseydelse for at sikre robusthed og repeterbarhed.
Denne protokol har potentialet til at blive anvendt på enhver viral vektorafgivelsesundersøgelse, ikke kun påvisning af AAV i tårer, som præsenteret her. Det skaber en robust og gentagelig ramme, hvorpå flere formålstjenlige, regulerede programmer kan udvikles.