Name: Author Spotlight: Enhancing Bone Regeneration with Vascularized Artificial Cartilage Integration
Uploaded: 2023-07-14T13:20:00
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Este trabalho foi apoiado por um Grant-in-Aid for Scientific Research (KAKENHI) da Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) (grant nos. JP19K10259 e 22K10032 ao MAI).

Este protocolo usa camundongos machos nus de 4 semanas de idade. Aloja quatro ratos em uma gaiola sob um ciclo claro/escuro de 12 h a 22−24 °C e 50%−70% de umidade relativa. Todos os experimentos com animais foram conduzidos de acordo com as diretrizes aprovadas pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade Médica e Odontológica de Tóquio (ID de aprovação: A2019-204C, A2020-116A e A2021-121A).
1. Preparação de tampões e reagentes
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Artificial Cartilage Implants for Bone Regeneration via Endochondral Ossification

O uso de materiais apropriados que promovam a transição da cartilagem hipertrófica para o osso é uma abordagem promissora para ampliar enxertos de cartilagem hipertrófica projetados baseados em CTM e tratar defeitos ósseos de tamanho clinicamente significativo. Aqui, mostramos que o AH é um excelente material de arcabouço para auxiliar na diferenciação do tecido cartilaginoso hipertrófico baseado em CTM in vitro e promover a formação óssea endocondral in vivo38. Al?...

O osso autólogo ainda é o padrão-ouro para reparação de defeitos ósseos decorrentes de trauma, defeitos congênitos e ressecção cirúrgica. No entanto, o enxerto ósseo autógeno tem limitações significativas, incluindo dor do doador, risco de infecção e volume ósseo limitado que pode ser isolado dos pacientes 1,2,3,4. Inúmeros biomateriais têm sido desenvolvidos como substitutos ósseos, combinando polímeros naturais ou sintéticos com materiais mineralizados, como fosfato de cálcio ou hidroxiapatita 5,6. A formação óssea nesses materiais de engenharia é geralmente obtida usando o material mineralizado como material de priming para permitir que as células-tronco se diferenciem diretamente em osteoblastos através do processo de ossificação intramembrana (IMO)7. Esse processo carece do passo angiogênico, resultando em vascularização insuficiente in vivo do enxerto após o implante8,9,10 e, portanto, abordagens utilizando esse processo podem não ser ideais para o tratamento de grandes defeitos ósseos11.
Estratégias aplicadas para recapitular o processo de ossificação endocondral (ECO), um mecanismo inato na esquelética durante o desenvolvimento, têm demonstrado superar problemas significativos associados às abordagens tradicionais baseadas na IMO. Na ECO, os condrócitos do molde cartilaginoso liberam fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), que promove infiltração vascular e remodelamento do molde cartilaginoso emosso12. A abordagem ECO-mediada para osteogênese via remodelamento cartilaginoso e angiogênese, que também é ativada durante o reparo de fraturas, usa tecido cartilaginoso criado artificialmente derivado de CTMs como material de priming. Os condrócitos podem tolerar hipóxia em defeitos ósseos, induzir angiogênese e converter um enxerto de cartilagem livre de vasculares em tecido angiogênico. Numerosos estudos têm relatado que enxertos de cartilagem à base de CTM geram osso in vivo com a implementação de tal programa ECO13,14,15,16,17,18,19,20,21.
Um requisito essencial para a aplicação clínica desta abordagem mediada pela ECO é como preparar a quantidade desejada de enxerto de cartilagem em um ambiente clínico. Preparar cartilagem clínica de um tamanho que se adapte ao defeito ósseo real não é prático. Portanto, a cartilagem do enxerto deve formar osso integralmente quando múltiplos fragmentos são implantados22. Os hidrogéis podem ser uma ferramenta atraente para a ampliação de enxertos manipulados por tecidos para ossificação endocondral. Muitos hidrogéis de origem natural suportam a formação de cartilagem MSC in vitro e ECO in vivo 23,24,25,26,27,28,29,30,31,32; no entanto, o material de suporte ideal para atender aos requisitos de aplicação clínica permaneceu indeterminado. O ácido hialurônico (AH) é um polissacarídeo biodegradável e biocompatível presente na matriz extracelular da cartilagem33. O AH interage com as CTMs via receptores de superfície, como o CD44, para auxiliar a diferenciação condrogênica 25,26,28,30,31,32,34. Além disso, os scaffolds de AH promovem diferenciação osteogênica mediada pela IMO de células-tronco da polpa dentária humana35, e scaffolds combinados com colágeno promovem osteogênese mediada por ECO36,37.
Aqui, apresentamos um método para o preparo de hidrogéis de AH utilizando CTMs humanas adultas derivadas da medula óssea e seu uso para condrogênese hipertrófica in vitro e posterior ossificação endocondral in vivo38. Comparamos as características do AH com as do colágeno, um material amplamente aplicado na engenharia do tecido ósseo com CTMs e um material útil para a ampliação de enxertos artificiais para ossificação endocondral17. Em um modelo de camundongo imunocomprometido, construções de AH e colágeno semeadas com CTMs humanas foram avaliadas quanto ao potencial ECO in vivo por implante subcutâneo. Os resultados mostram que os hidrogéis de AH são excelentes como arcabouço para CTMs criarem enxertos de cartilagem artificial que permitem a formação óssea através de ECO.
O protocolo é dividido em duas etapas. Primeiro, construções de CTMs humanas semeadas com hidrogel de hialuronano são preparadas e diferenciadas em cartilagem hipertrófica in vitro. Em seguida, os construtos diferenciados são implantados subcutaneamente em um modelo nude para induzir a ossificação endocondral in vivo (Figura 1).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25w/v% Trypsin-1mmol/L EDTA.4Na Solution</td>
			<td>FUJIFILM Wako Pure Chemical&#160;</td>
			<td>209-16941</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antisedan</td>
			<td>Nippon Zenyaku Kogyo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ascorbate-2-phosphate</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>13571-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bambanker</td>
			<td>GC Lymphotec</td>
			<td>CS-02-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>basic fibroblastic growth factor</td>
			<td>Reprocell</td>
			<td>RCHEOT002&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bovine serum albumin</td>
			<td>FUJIFILM Wako Pure Chemical&#160;</td>
			<td>012-23881</td>
			<td>7.5 w/v%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess Automated Cell Counter with cell counting chamber slides and Trypan Blue stain 0.4%</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dexamethasone</td>
			<td>Merck</td>
			<td>D8893</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Domitor</td>
			<td>Nippon Zenyaku Kogyo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dormicum</td>
			<td>Astellas Pharma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>Merck</td>
			<td>D6429</td>
			<td>high glucose</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham</td>
			<td>Merck</td>
			<td>D6421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30396.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin sulfate</td>
			<td>FUJIFILM Wako Pure Chemical&#160;</td>
			<td>1676045</td>
			<td>&#160;10 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Haccpper Generator</td>
			<td>TechnoMax</td>
			<td>CH-400-5QB</td>
			<td>50 ppm hypochlorous acid water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Mesenchymal Stem Cells</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>PT-2501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyStem Cell Culture Scaffold Kit</td>
			<td>Merck</td>
			<td>HYS020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-1&#223;</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>AF-200-01B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITS-G supplement</td>
			<td>FUJIFILM Wako Pure Chemical&#160;</td>
			<td>090-06741</td>
			<td>&#215;100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Alanyl-L-Glutamine</td>
			<td>FUJIFILM Wako Pure Chemical&#160;</td>
			<td>016-21841</td>
			<td>200mmol/L (&#215;100)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-proline</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>29001-42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Thyroxine</td>
			<td>Merck</td>
			<td>T1775</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MSCGM Mesenchymal Stem Cell Growth Medium 
			BulletKit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>PT-3001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>paraffin</td>
			<td>FUJIFILM Wako Pure Chemical&#160;</td>
			<td>165-13375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS / pH7.4 100ml</td>
			<td>Medicago</td>
			<td>09-2051-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TGF-&#946;3&#160;</td>
			<td>Proteintech</td>
			<td>HZ-1090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vetorphale</td>
			<td>Meiji Seika Kaisha</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Visiocare Ointment</td>
			<td>SAVAVET/SAVA Healthcare</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-glycerophosphate</td>
			<td>FUJIFILM Wako Pure Chemical&#160;</td>
			<td>048-34332</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

integrated bone formation through in vivo endochondral ossification using mesenchymal stem cells

A terapia convencional de regeneração óssea utilizando células-tronco mesenquimais (CTMs) é de difícil aplicação em defeitos ósseos maiores que o tamanho crítico por não possuir um mecanismo para induzir angiogênese. A implantação de tecido cartilaginoso artificial fabricado a partir de CTMs induz angiogênese e formação óssea in vivo via ossificação endocondral (ECO). Portanto, esta abordagem mediada pela ECO pode ser uma terapia promissora de regeneração óssea no futuro. Um aspecto importante da aplicação clínica desta abordagem mediada pela ECO é o estabelecimento de um protocolo para preparar cartilagem suficiente para ser implantada para reparar o defeito ósseo. Especialmente não é prático projetar uma única massa de cartilagem enxertada de um tamanho que esteja de acordo com a forma do defeito ósseo real. Portanto, a cartilagem a ser transplantada deve ter a propriedade de formar osso integralmente quando múltiplos pedaços são implantados. Os hidrogéis podem ser uma ferramenta atraente para a ampliação de enxertos projetados para ossificação endocondral para atender às necessidades clínicas. Embora muitos hidrogéis naturalmente derivados suportem a formação de cartilagem MSC in vitro e ECO in vivo, o material de arcabouço ideal para atender às necessidades de aplicações clínicas ainda não foi determinado. O ácido hialurônico (AH) é um componente crucial da matriz extracelular cartilaginosa e é um polissacarídeo biodegradável e biocompatível. Aqui, mostramos que os hidrogéis de AH têm excelentes propriedades para apoiar a diferenciação in vitro do tecido cartilaginoso à base de CTM e promover a formação óssea endocondral in vivo.

Autologous bone is still the gold standard for repairing bone defects due to trauma, congenital defects, and surgical resection. However, autogenous bone grafting has significant limitations, including donor pain, risk of infection, and limited bone volume that can be isolated from the patients1,2,3,4. Numerous biomaterials have been developed as bone substitutes, combining natural or synthetic polymers with mineralized materials such as calcium phosphate or hydroxyapatite5,6. Bone formation in these engineered materials is usually achieved using the mineralized material as a priming material to allow stem cells to differentiate directly into osteoblasts through the intramembrane ossification (IMO) process7. This process lacks the angiogenic step, resulting in insufficient in vivo vascularization of the graft after implantation8,9,10, and therefore, approaches using such a process may not be optimal for treating large bone defects11.
Strategies applied to recapitulate the endochondral ossification (ECO) process, an innate mechanism in skeletogenesis during development, have been shown to overcome significant problems associated with traditional IMO-based approaches. In ECO, chondrocytes in the cartilage template release vascular endothelial growth factor (VEGF), which promotes vascular infiltration and remodeling of the cartilage template into bone12. The ECO-mediated approach to osteogenesis via cartilage remodeling and angiogenesis, which is also activated during fracture repair, uses artificially created cartilage tissue derived from MSCs as a priming material. Chondrocytes can tolerate hypoxia in bone defects, induce angiogenesis, and convert a vascular-free cartilage graft into angiogenic tissue. Numerous studies have reported that MSC-based cartilage grafts generate bone in vivo by implementing such an ECO program13,14,15,16,17,18,19,20,21.
An essential requirement for the clinical application of this ECO-mediated approach is how to prepare the desired amount of cartilage graft in a clinical setting. Preparing clinical cartilage of a size that fits the actual bone defect is not practical. Therefore, graft cartilage must form bone integrally when multiple fragments are implanted22. Hydrogels may be an attractive tool for scaling up tissue-engineered grafts for endochondral ossification. Many naturally derived hydrogels support MSC cartilage formation in vitro and ECO in vivo23,24,25,26,27,28,29,30,31,32; however, the optimal support material to meet the clinical application requirements has remained undetermined. Hyaluronic acid (HA) is a biodegradable and biocompatible polysaccharide present in the extracellular matrix of cartilage33. HA interacts with MSCs via surface receptors such as CD44 to support chondrogenic differentiation25,26,28,30,31,32,34. In addition, HA scaffolds promote IMO-mediated osteogenic differentiation of human dental pulp stem cells35, and scaffolds combined with collagen promote ECO-mediated osteogenesis36,37.
Here, we present a method for preparing HA hydrogels using bone marrow-derived adult human MSCs and their use for hypertrophic chondrogenesis in vitro and subsequent endochondral ossification in vivo38. We compared the characteristics of HA with those of collagen, a material widely applied in bone tissue engineering with MSCs and a useful material for scaling up artificial grafts for endochondral ossification17. In an immunocompromised mouse model, HA and collagen constructs seeded with human MSCs were evaluated for in vivo ECO potential by subcutaneous implantation. The results show that HA hydrogels are excellent as a scaffold for MSCs to create artificial cartilage grafts that allow bone formation through ECO.
The protocol is divided into two steps. First, constructs of human MSCs seeded on hyaluronan hydrogel are prepared and differentiated into hypertrophic cartilage in vitro. Next, the differentiated constructs are implanted subcutaneously in a nude model to induce endochondral ossification in vivo (Figure 1).

Author Spotlight: Enhancing Bone Regeneration with Vascularized Artificial Cartilage Integration 

Formação Óssea Integrada Através da Ossificação Endocondral In Vivo Usando Células-Tronco Mesenquimais

Our research intends to develop a method that improves the lack of blood flow and can be applied to large bone defects. The protocol presented here is one with the approaches we have taken to this end. The approach to bone formation using artificial cartilage the structure that mimics the natural process of skeletal development during the embryogenesis.This approach is relatively new in bone regeneration research. The advantage we inducing cartilage neogenesis, which is not an existent method currently used in clinical practice exists for vascularized bone grafts. Traditionally, bone regeneration research has used the techniques that combine stem cells, biomaterials, and growth factors alone or in combination.The method of bone formation by implanting artificial cartilage uses a techniques that makes artificial cartilage by mixing stem cells with biomaterials that serve the scaffolding material, and inducing cartilage differentiation. Healing our patients'bone defect clinically requires a large quantity of high quality artificial cartilage. Our protocol addresses the challenge of producing high quality artificial cartilage, and how to make multiple cartilage fuse with each other to form a unified bone.Our protocol helps generate larger, higher quality cartilage with fewer cells than protocols that use or do not use other scaffold materials to create artificial cartilage. Furthermore, the protocol can generate one integrated piece of bone, even with multiple pieces implanted in vivo. This is important because preparing clinical cartilage of a shape and size that fits the bone defect is impractical.

Hidrogéis de AH encapsulados em CTM foram cultivados em meio condrogênico suplementado com TGFβ3, um indutor da condrogênese41 (passo 4.1). Comparamos as propriedades do AH com as do colágeno, que tem se mostrado eficaz na criação de enxertos de cartilagem artificial à base de CTM para ossificação endocondral, como descrito anteriormente38. As CTMs indiferenciadas não foram incluídas como controles negativos neste estudo, pois foi demonstrado que as CTMs indifer...

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A terapia óssea via ossificação endocondral através da implantação de tecido cartilaginoso artificial produzido a partir de células-tronco mesenquimais tem o potencial de contornar os inconvenientes das terapias convencionais. Os hidrogéis de ácido hialurônico são eficazes na ampliação de enxertos de cartilagem uniformemente diferenciados, bem como na criação de osso integrado com vascularização entre enxertos fundidos in vivo.

Conventional bone regeneration therapy using mesenchymal stem cells (MSCs) is difficult to apply to bone defects larger than the critical size because it ...

Nossa pesquisa pretende desenvolver um método que melhore a falta de fluxo sanguíneo e possa ser aplicado em grandes defeitos ósseos. O protocolo aqui apresentado é um com as abordagens que adotamos para esse fim. A abordagem da formação óssea utilizando cartilagem artificial é a estrutura que mimetiza o processo natural de desenvolvimento esquelético durante a embriogênese.Essa abordagem é relativamente nova na pesquisa em regeneração óssea. A vantagem de induzirmos a neogênese da cartilagem, que não é um método existente atualmente na prática clínica, é que existe para os enxertos ósseos vascularizados. Tradicionalmente, a pesquisa em regeneração óssea tem usado as técnicas que combinam células-tronco, biomateriais e fatores de crescimento sozinhos ou em combinação.O método de formação óssea por meio da implantação de cartilagem artificial utiliza uma técnica que produz cartilagem artificial misturando células-tronco com biomateriais que servem ao material de scaffolding, e induzindo a diferenciação da cartilagem. A cura clínica do defeito ósseo de nossos pacientes requer uma grande quantidade de cartilagem artificial de alta qualidade. Nosso protocolo aborda o desafio de produzir cartilagem artificial de alta qualidade e como fazer várias cartilagens se fundirem umas com as outras para formar um osso unificado.Nosso protocolo ajuda a gerar cartilagem maior e de maior qualidade com menos células do que protocolos que usam ou não outros materiais de arcabouço para criar cartilagem artificial. Além disso, o protocolo pode gerar um pedaço de osso integrado, mesmo com várias peças implantadas in vivo. Isso é importante porque o preparo clínico de cartilagem de forma e tamanho que se adapte ao defeito ósseo é impraticável.