Name: Author Spotlight: Investigating the Blood Glucose Homeostasis in Murine Brain Using a Cost-Effective Hyperglycemic And Hypoglycemic Clamp Technique
Uploaded: 2024-01-26T13:10:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Hyperglycemic Clamp and Hypoglycemic Clamp in Conscious Mice at JoVE.com

Ce travail a été soutenu par la Leading Initiative for Excellent Young Researchers (du MEXT) ; une subvention pour la recherche scientifique (B) (numéro de subvention JP21H02352) ; Agence japonaise pour la recherche et le développement médicaux (AMED-RPIME, numéro de subvention JP21gm6510009h0001, JP22gm6510009h9901) ; la Fondation commémorative d’Uehara ; Fondation Astellas pour la recherche sur les troubles métaboliques ; Fondation commémorative Suzuken, Fondation des sciences de la vie Akiyama et Fondation de recherche en neurosciences de Narishige. Nous remercions également Nur Farehan Asgar, Ph.D, pour avoir édité une ébauche de ce manuscrit.

Toutes les procédures ont été approuvées par le Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux (IACUC) de l’Université de Kumamoto.
REMARQUE : Pour soulager la douleur, l’ibuprofène a été administré dans l’eau potable (0,11 mg/mL) pendant 48 h, et la buprénorphine (0,05-0,1 mg/kg i.p.) a été administrée 30 min avant la chirurgie. Les conditions stériles comprennent les gants, les masques et les instruments autoclavés stérilisés à l’oxyde d’éthylène ...

Surgical Installation of Hyperglycemic and Hypoglycemic Clamps in Mice

<ol>
	<li>Seaquist, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoglycemia+and+diabetes:+A+report+of+a+workgroup+of+the+american+diabetes+association+and+the+endocrine+society.">Hypoglycemia and diabetes: A report of a workgroup of the american diabetes association and the endocrine society.</a> Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 98 (5), 1845-1859 (2013).</li><li>Amiel, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoglycaemia,+cardiovascular+disease,+and+mortality+in+diabetes:+epidemiology,+pathogenesis,+and+management.">Hypoglycaemia, cardiovascular disease, and mortality in diabetes: epidemiology, pathogenesis, and management.</a> The Lancet Diabetes and Endocrinology. 7 (5), 385-396 (2019).</li><li>. Leanne Riley Mean fasting blood glucose Available from: <a target="_blank" href="https://www.who.int/data/gho/indicator-metadata-registry/imr-details/2380">https://www.who.int/data/gho/indicator-metadata-registry/imr-details/2380</a> (2022)</li><li>Umpierrez, G., Korytkowski, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diabetic+emergencies-ketoacidosis,+hyperglycaemic+hyperosmolar+state+and+hypoglycaemia.">Diabetic emergencies-ketoacidosis, hyperglycaemic hyperosmolar state and hypoglycaemia.</a> Nature Reviews Endocrinology. 12 (4), 222-232 (2016).</li><li>Sprague, J. E., Arbel&#225;ez, A. 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G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocrine+stress+responses+and+risk+of+type+2+diabetes+mellitus.">Endocrine stress responses and risk of type 2 diabetes mellitus.</a> Stress. 18 (5), 498-506 (2015).</li><li>Chan, O., Sherwin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+VMH+fuel+sensing+on+hypoglycemic+responses.">Influence of VMH fuel sensing on hypoglycemic responses.</a> Trends in Endocrinology &amp; Metabolism. 24 (12), 616-624 (2013).</li><li>Donovan, C. M., Watts, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+and+central+glucose+sensing+in+hypoglycemic+detection.">Peripheral and central glucose sensing in hypoglycemic detection.</a> Physiology. 29 (5), 314-324 (2014).</li><li>TeSlaa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+source+of+glycolytic+intermediates+in+mammalian+tissues.">The source of glycolytic intermediates in mammalian tissues.</a> Cell Metabolism. 33 (2), 367-378.e5 (2021).</li></ol>

La méthode décrite ici est simple et peut être réalisée avec des pointes de pipette, des seringues et d’autres articles trouvés dans les laboratoires ordinaires. Bien que les chercheurs puissent avoir besoin d’acheter des tubes et des pompes supplémentaires, aucun équipement coûteux n’est nécessaire. Ainsi, ce protocole de cathétérisme et de clampage est plus facile à démarrer par rapport aux rapports précédents 12,13,14.<sup clas...

Le glucose est une source d’énergie importante pour les cellules, et un manque de glucose peut entraîner divers symptômes et complications. En cas d’hypoglycémie (hypoglycémie, généralement inférieure à 70 mg/dL de glycémie à jeun, mais ne doit pas être déterminée par une seule valeur1), les symptômes les plus courants sont la faiblesse, la confusion, la transpiration et les maux de tête. Il peut également perturber la fonction cérébrale et augmenter le risque d’événements cardiovasculaires et de mortalité2. À l’inverse, l’hyperglycémie est une condition médicale dans laquelle la concentration plasmatique de glucose dépasse les niveaux normaux (généralement > 126 mg/dL en glycémie à jeun3). Cela peut se produire chez les personnes atteintes de diabète qui présentent un déficit de production ou d’utilisation d’insuline. L’hyperglycémie peut entraîner une acidocétose diabétique, qui se produit lorsque le corps ne peut pas utiliser le glucose comme énergie mais décompose les acides gras comme carburant. L’état hyperosmolaire hyperglycémique augmente également la mortalité4. L’hyperglycémie à long terme peut endommager les vaisseaux sanguins, les nerfs et les organes, entraînant le développement de plusieurs complications chroniques telles que les maladies cardiovasculaires, les rétinopathies et les maladies rénales. Ainsi, la glycémie doit être maintenue dans une fourchette étroite entre 100 mg/dL et 120 mg/dL.
La glycémie est régulée par l’équilibre entre l’entrée et la sortie de glucose dans un modèle à un compartiment (Figure 1A). L’apport en glucose comprend le glucose absorbé par les aliments et la production de glucose par le foie, les reins et l’intestin grêle. La production de glucose comprend l’absorption du glucose dans les tissus et l’élimination du glucose par les reins. La quantité de glucose entrant et sortant est régulée par les hormones endocriniennes. Par exemple, le glucagon, la corticostérone et les catécholamines, connus sous le nom d’hormones contre-régulatrices, sont libérés lorsque la glycémie diminue5. Ils stimulent la dégradation du glycogène et la synthèse du glucose, principalement du foie ; Ces processus sont connus sous le nom de glycogénolyse et de gluconéogenèse, respectivement. L’hyperglycémie augmente la libération d’insuline par les cellules β pancréatiques et stimule l’absorption du glucose dans les muscles, les tissus adipeux et le cœur 6,7,8,9. L’exercice augmente l’absorption de glucose indépendante de l’insuline10. Le système nerveux sympathique augmente l’absorption du glucose dans les muscles et le tissu adipeux brun 6,11. Pour mesurer la capacité à réguler le métabolisme du glucose dans les tissus périphériques, les chercheurs utilisent généralement le test de tolérance au glucose (GTT) et le test de tolérance à l’insuline (ITT) (Figure 1B,C). Dans le GTT, deux facteurs doivent être pris en compte : la libération d’insuline et la sensibilité à l’insuline (Figure 1B). Cependant, la courbe de concentration de glucose pendant le test de 120 minutes est différente chez chaque souris, ce qui peut affecter différentes quantités de libération d’hormones. Dans le cas de l’ITT, la glycémie est régulée à la fois par la sensibilité à l’insuline et la libération d’hormones contre-régulatrices. Par conséquent, il est difficile de déterminer la signification précise du métabolisme du glucose, de la libération d’insuline et de la sensibilité à l’insuline dans les situations où la glycémie n’est pas constante.
Pour surmonter ces problèmes, il est souhaitable de maintenir la glycémie à un niveau constant (ou « clamp »). Dans le clamp hyperglycémique, le glucose est infusé dans la circulation sanguine pour augmenter la glycémie à un niveau spécifique, puis maintenu à ce niveau pendant un certain temps. La quantité de glucose infusé est ajustée en fonction des mesures de la glycémie toutes les 5 à 10 minutes pour maintenir un état d’équilibre. Cette technique est particulièrement utile pour comprendre les paramètres de la sécrétion d’insuline à un taux de glucose clampé. Le clamp hypoglycémique est une méthode pour maintenir une glycémie basse en perfusant de l’insuline. Le glucose est perfusé à un rythme variable pour maintenir un taux de glucose sanguin spécifique. Si la souris ne peut pas se remettre de l’hypoglycémie, plus de glucose doit être perfusé.
Bien qu’il y ait de nombreux avantages à effectuer des pinces hyperglycémiques et hypoglycémiques, les procédures chirurgicales et expérimentales sont considérées comme techniquement difficiles. Ainsi, peu de groupes de recherche ont pu les faire. Nous avons cherché à décrire ces méthodes pour les chercheurs ayant des contraintes financières et de main-d’œuvre afin de démarrer ces expériences avec un budget inférieur.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Adhesive glue</td>
			<td>Henkel AG &#38; Co. KGaA</td>
			<td>LOCTITE 454</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ELISA kit (C-peptide)</td>
			<td>Morinaga Institute of Bilogical Science Inc</td>
			<td>M1304</td>
			<td>Mouse C-peptide ELISA Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ELISA kit (insulin)</td>
			<td>FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation</td>
			<td>633-03411</td>
			<td>LBIS Mouse Insulin ELISA Kit (U-type)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Handy glucose meter</td>
			<td>Nipro Co.</td>
			<td>11-777</td>
			<td>Free Style Freedom Lite</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin (100U/ml)</td>
			<td>Eli Lilly &#38; Co.</td>
			<td>428021014</td>
			<td>Humulin R (100U/ml)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse</td>
			<td>Japan SLC Inc.</td>
			<td>C57BL/6NCrSlc</td>
			<td>C57BL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suture</td>
			<td>Natsume seisakusho</td>
			<td>C-23S-560 No.2</td>
			<td>Sterilized</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Pump</td>
			<td>Pump Systems Inc.</td>
			<td>NE-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synthetic suture</td>
			<td>V&#214;MEL</td>
			<td>HR-17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing1</td>
			<td>AS ONE Corporation</td>
			<td>9-869-01</td>
			<td>LABORAN(R) Silicone Tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing2</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>427400</td>
			<td>BD Intramedic PE Tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing3</td>
			<td>IGARASHI IKA KOGYO CO., LTD.</td>
			<td>size5</td>
			<td>Polyethylene tubing size5</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

hyperglycemic clamp and hypoglycemic clamp in conscious mice

Le diabète sucré (DS) est causé par une libération insuffisante d’insuline par les cellules β pancréatiques (diabète de type 1) et une sensibilité à l’insuline dans les muscles, le foie et les tissus adipeux (diabète de type 2). L’injection d’insuline traite les patients atteints de diabète sucré mais entraîne une hypoglycémie comme effet secondaire. Le cortisol et les catécholamines sont libérés pour activer la production de glucose du foie afin de récupérer l’hypoglycémie, appelée réponse contre-régulatrice (CRR). Dans la recherche sur le diabète à l’aide de modèles de rongeurs, des tests de tolérance au glucose et l’injection de 2-désoxyglucose sont utilisés pour mesurer la libération d’insuline et la CRR, respectivement. Cependant, les concentrations de glucose dans le sang changent constamment au cours des expériences, ce qui rend difficile l’évaluation de la libération nette d’insuline et de la CRR. Cet article décrit une méthode dans laquelle la glycémie est maintenue à 250 mg/dL ou 50 mg/dL chez des souris conscientes pour comparer la libération d’insuline et d’hormones CRR, respectivement.
Un tube en polyéthylène est implanté dans l’artère carotide et la veine jugulaire des souris, et les souris sont autorisées à se remettre de la chirurgie. Le tube de la veine jugulaire est relié à une seringue Hamilton avec un pousse-seringue pour permettre la perfusion d’insuline ou de glucose à un débit constant et variable. Le tube de l’artère carotide sert à la collecte de sang. Pour le clamp hyperglycémique, 30 % de glucose est perfusé dans la veine et la glycémie est mesurée à partir du sang artériel toutes les 5 ou 10 minutes. Le débit de perfusion de 30 % de glucose est augmenté jusqu’à ce que la glycémie atteigne 250 mg/dL. Le sang est prélevé pour mesurer les concentrations d’insuline. Pour le clamp hypoglycémiant, 10 mU/kg/min d’insuline sont perfusés avec 30% de glucose, dont le débit de perfusion est variable pour maintenir 50 mg/dL de glycémie. Le sang est prélevé pour mesurer les hormones contre-régulatrices lorsque la perfusion de glucose et la glycémie atteignent un état d’équilibre. Les pinces hyperglycémiques et hypoglycémiques ont la même procédure chirurgicale et les mêmes configurations expérimentales. Ainsi, cette méthode est utile pour les chercheurs sur le métabolisme systémique du glucose.

Glucose is an important source of energy for cells, and a lack of glucose can lead to a variety of symptoms and complications. In the event of low glucose (hypoglycemia, generally less than 70 mg/dL in fasting blood glucose level, but should not be determined by a single value1), the most common symptoms include weakness, confusion, sweating, and headache. It can also disrupt cerebral function and increase the risk of cardiovascular events and mortality2. Conversely, hyperglycemia is a medical condition in which the plasma glucose concentration exceeds normal levels (generally &#62; 126 mg/dL in fasting blood glucose level3). This can occur in individuals with diabetes who have either a deficit in insulin production or utilization. Hyperglycemia can lead to diabetic ketoacidosis, which occurs when the body cannot use glucose for energy but instead breaks down fatty acids for fuel. The hyperglycemic hyperosmolar state also increases mortality4. Long-term hyperglycemia can cause damage to blood vessels, nerves, and organs, leading to the development of several chronic complications such as cardiovascular disease, retinopathies, and kidney diseases. Thus, the blood glucose concentration must be maintained in a tight range between 100 mg/dL and 120 mg/dL.
Blood glucose is regulated by the balance between glucose input and output in a one-compartment model (Figure 1A). Glucose input includes absorbed glucose from food and glucose production from the liver, kidneys, and small intestine. Glucose output comprises glucose uptake in tissues and glucose disposal from the kidneys. Both the amount of glucose input and output are regulated by endocrine hormones. For example, glucagon, corticosterone, and catecholamines, known as counter-regulatory hormones, are released when blood glucose levels decrease5. They stimulate the breakdown of glycogen and the synthesis of glucose, mainly from the liver; these processes are known as glycogenolysis and gluconeogenesis, respectively. Hyperglycemia increases insulin release from pancreatic &#946;-cells and stimulates glucose uptake in the muscles, adipose tissues, and heart6,7,8,9. Exercise increases insulin-independent glucose uptake10. The sympathetic nervous system increases glucose uptake in muscles and brown adipose tissue6,11. To measure the ability to regulate glucose metabolism in peripheral tissues, researchers typically use the glucose tolerance test (GTT) and the insulin tolerance test (ITT) (Figure 1B,C). In GTT, two factors must be considered: insulin release and insulin sensitivity (Figure 1B). However, the glucose concentration curve during the 120 min test is different in each mouse, which may affect different amounts of hormone release. In ITT, blood glucose is regulated by both insulin sensitivity and the release of counter-regulatory hormones. Therefore, it is difficult to determine the precise meaning of glucose metabolism, insulin release, and insulin sensitivity in GTT and ITT, in situations where blood glucose levels are not constant.
To overcome these problems, it is desirable to keep blood glucose at a constant level (or &#34;clamp&#34;). In hyperglycemic clamp, glucose is infused into the bloodstream to raise blood glucose levels to a specific level and then maintained at that level for a period of time. The amount of infused glucose is adjusted based on measurements of blood glucose levels every 5-10 min to maintain a steady state. This technique is particularly useful for understanding the parameters of insulin secretion at a clamped glucose level. Hypoglycemic clamp is a method to maintain low blood glucose levels by infusing insulin. Glucose is infused at a variable rate to maintain a specific blood glucose level. If the mouse cannot recover from hypoglycemia, more glucose should be infused.
Although there are many advantages to performing hyperglycemic and hypoglycemic clamps, the surgical and experimental procedures are considered technically difficult. Thus, few research groups have been able to do them. We aimed to describe these methods for researchers with financial and workforce constraints to start these experiments at a lower budget.

Author Spotlight: Investigating the Blood Glucose Homeostasis in Murine Brain Using a Cost-Effective Hyperglycemic And Hypoglycemic Clamp Technique

Pince hyperglycémique et pince hypoglycémique chez la souris consciente

L’étude sur l’hypoglycémie clamp a été réalisée chez des souris C57BL/6N mâles (âgées de 8 semaines, plus de 25 g p.c.) à jeun 3 h au début de l’expérience (figure 4A, B). La glycémie initiale était de 136 mg/dL (t = -15 min). S’il est inférieur à 90 mg/dL, cela peut être dû au fait que la chirurgie ne s’est pas bien déroulée, ou que le cathéter artériel a été inséré trop profondément, ou que des caillots sanguins ont pénétré dans le f...

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Une pince hyperglycémique est utilisée pour mesurer la libération d’insuline avec une concentration de glucose sanguin plus élevée. Un clamp hypoglycémique sert à mesurer la production de glucose induite par des réponses contre-régulatrices. Les deux méthodes utilisent la même procédure chirurgicale. Ici, nous présentons une technique de clamp pour évaluer le métabolisme systémique du glucose.

Diabetes mellitus (DM) is caused by insufficient insulin release from the pancreatic &#946;-cells (Type1 DM) and insulin sensitivity in muscles, liver, ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Hyperglycemic Clamp and Hypoglycemic Clamp in Conscious Mice

Recherche

Médecine

Surgery to Implant Hypoglycemic and Hyperglycemic Clamp Tubings in Mouse

Chirurgie pour implanter des tubes de clamp hypoglycémiques et hyperglycémiques chez la souris

Setup and Operation of the Hyperglycemic and Hypoglycemic Clamps in Mouse for Monitoring Blood Glucose and Insulin Release

Installation et fonctionnement des pinces hyperglycémiques et hypoglycémiques chez la souris pour la surveillance de la glycémie et de la libération d’insuline