Name: vertical immobilization method for time-lapse microscopy analysis in filamentous cyanobacteria
Uploaded: 2023-09-25T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Vertical Immobilization Method for Time-Lapse Microscopy Analysis in Filamentous Cyanobacteria at JoVE.com

Vi er taknemmelige for nationale ph.d.-stipendier (ANID 21211333; 21191389) for finansieringen. Grant Fondecyt 1161232.
Dette arbejde blev støttet af de Advanced Microscopy Facility UMA UC.

1. Overvejelser og valg af den cellulære model
BEMÆRK: Cyanobakterier har en stærk autofluorescens på grund af tilstedeværelsen af fotosyntetiske pigmenter. Dette signal er i den røde del af spektret, derfor er de fluorescerende proteiner, der er egnede til billeddannelse i cyanobakterier, dem, der langt fra den røde emission. For eksempel GFP, YFP, Venus, turkis og BFP.
<ol><li>Vælg en divisom komponent til stede i målet filamentøs cyanobakteriel stamme. Til fors?...

<ol>
	<li>L&#246;we, J., Amos, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+the+bacterial+cell-division+protein+FtsZ.">Crystal structure of the bacterial cell-division protein FtsZ.</a> Nature. 391 (6663), 203-206 (1998).</li><li>Erickson, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FtsZ,+a+prokaryotic+homolog+of+tubulin.">FtsZ, a prokaryotic homolog of tubulin.</a> Cell. 80 (3), 367-370 (1995).</li><li>Huang, K., Mychack, A., Tchorzewski, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+FtsZ+C-terminal+variable+(+CTV+)+region+in+Z-ring+assembly+and+interaction+with+the+Z-ring+stabilizer+ZapD+in+E.">Characterization of the FtsZ C-terminal variable ( CTV ) region in Z-ring assembly and interaction with the Z-ring stabilizer ZapD in E.</a> coli cytokinesis. , 1-24 (2016).</li><li>Perez, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Movement+dynamics+of+divisome+proteins+and+PBP2x:FtsW+in+cells+of+Streptococcus+pneumoniae.">Movement dynamics of divisome proteins and PBP2x:FtsW in cells of Streptococcus pneumoniae.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (8), 3211-3220 (2019).</li><li>Bisson-Filho, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treadmilling+by+FtsZ+filaments+drives+peptidoglycan+synthesis+and+bacterial+cell+division.">Treadmilling by FtsZ filaments drives peptidoglycan synthesis and bacterial cell division.</a> Science. 355 (6326), 739-743 (2017).</li><li>Yang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GTPase+activity-coupled+treadmilling+of+the+bacterial+tubulin+FtsZ+organizes+septal+cell+wall+synthesis.">GTPase activity-coupled treadmilling of the bacterial tubulin FtsZ organizes septal cell wall synthesis.</a> Science. 355 (6326), 744-747 (2017).</li><li>Whitley, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FtsZ+treadmilling+is+essential+for+Z-ring+condensation+and+septal+constriction+initiation+in+Bacillus+subtilis+cell+division.">FtsZ treadmilling is essential for Z-ring condensation and septal constriction initiation in Bacillus subtilis cell division.</a> Nature Communications. 12 (1), (2021).</li><li>Maz&#243;n, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LexA-binding+sequences+in+Gram-positive+and+cyanobacteria+are+closely+related.">LexA-binding sequences in Gram-positive and cyanobacteria are closely related.</a> Molecular Genetics and Genomics. 271 (1), 40-49 (2004).</li><li>Mandakovic, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CyDiv,+a+conserved+and+novel+filamentous+cyanobacterial+cell+division+protein+involved+in+septum+localization.">CyDiv, a conserved and novel filamentous cyanobacterial cell division protein involved in septum localization.</a> Frontiers in Microbiology. 7 (FEB), 1-11 (2016).</li><li>Camargo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ZipN+is+an+essential+FtsZ+membrane+tether+and+contributes+to+the+septal+localization+of+SepJ+in+the+filamentous+cyanobacterium+Anabaena.">ZipN is an essential FtsZ membrane tether and contributes to the septal localization of SepJ in the filamentous cyanobacterium Anabaena.</a> Scientific Reports. 9 (1), 1-15 (2019).</li><li>Thiel, T., Peter Wolk, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conjugal+Transfer+of+Plasmids+to+Cyanobacteria.">Conjugal Transfer of Plasmids to Cyanobacteria.</a> Methods in Enzymology. 153 (C), 232-243 (1987).</li><li>Moffitt, J. R., Lee, J. B., Cluzel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+single-cell+chemostat:+An+agarose-based,+microfluidic+device+for+high-throughput,+single-cell+studies+of+bacteria+and+bacterial+communities.">The single-cell chemostat: An agarose-based, microfluidic device for high-throughput, single-cell studies of bacteria and bacterial communities.</a> Lab on a Chip. 12 (8), 1487-1494 (2012).</li></ol>

Studiet af dynamikken i divisome proteiner er uden tvivl en udfordring. Især i filamentøse cyanobakterier er en af udfordringerne visualiseringen af Z-ringen i det vandrette plan, hvor cellerne skal være lodret orienterede. Den metode, vi beskrev her, gør det muligt for placeringen af Z-ringen i XY-planet at udføre de forskellige analyser. Dette er den første enkle metode til filamentøse cyanobakterier, der muliggør fuldstændig visualisering af Z-ringen. 
Selvom denne protokol er enke...

Bakteriel celledeling er den proces, hvor en modercelle genererer to datterceller, i de fleste tilfælde ved mekanismen kendt som binær fission. En af de tidligste begivenheder i septeringsprocessen er lokaliseringen af FtsZ i midten af celle1. Dette protein, som er strukturelt homologt med tubulin2, bevares og fordeles bredt i de fleste bakterier, og dets polymerisation genererer en kontraktil struktur kendt som Z-ring3. Denne ring fungerer som et stillads for andre divisionsproteiner, og sammen danner de et molekylært maskineri kaldet et divisom. Flere undersøgelser har vist, at Z-ringen er meget dynamisk, og at FtsZ-protofilamenter bevæger sig ved løbebånd 4,5,6. For at studere Z-ringen i time-lapse-eksperimenter anbefales det at registrere divisionsstedet i XY-planet for bedre opløsning og hurtig prøveudtagning. For at opnå dette er det nødvendigt at udvikle vertikale celleimmobiliseringsmetoder, der almindeligvis omfatter nanofabrikation af mikrohulcellefælder og komplekse mikrofluidiske enheder7.
Cyanobakterier er fotosyntetiske mikroorganismer, der klassificeres som gram-negative ved deres cellulære morfologi. Imidlertid fylogenetisk er de tættere på gram-positive bakterier8. Disse organismer har celledelingsgener, der er almindelige inden for gram-positive og gram-negative bakterier, men deres divisome indeholder også unikke elementer9. Anabaena sp. PCC 7120 (herefter Anabaena sp.) er filamentøse cyanobakterier med et divisionsplan og er en model for studiet af celledeling i flercellede cyanobakterier. I denne stamme har det været muligt at bestemme placeringen af FtsZ i midten af cellerne10. Ikke desto mindre er der ingen undersøgelser, der viser in vivo-dynamikken i FtsZ i denne model. I vores laboratorium opnåede vi gennem triparental parring og homolog rekombination en totalt adskilt mutant af Anabaena sp., der udtrykker FtsZ-proteinet fusioneret med sfGFP, som erstattede det komplette endogene ftsZ-gen . Vi udviklede en hurtig og enkel celleimmobiliseringsmetode, der favoriserer den lodrette orientering af de mutante stammefilamenter til time-lapse-eksperimenter for at visualisere divisionsproteinerne i filamentøse cyanobakterier. Denne metode behøver ikke mikrofluidiske enheder, der kan være dyre og vanskelige at udvikle. Som et eksempel brugte vi denne protokol til at visualisere Z-ringen i FtsZ-sfGFP-mutanten ved konfokal mikroskopi.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 ml syringe</td>
			<td>Qingdao Agna Medical Technology Co., Ltd.</td>
			<td>-</td>
			<td>The disposable medical plastic syringe with 1 ml needle generally used to pump liquid or injection liquid, in this experiment it is used to suck the sample and make it polymerize.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Attofluor Cell Chamber</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>A7816</td>
			<td>The Attofluor Cell Camera is a durable and practical coverslip holder designed for viewing live cell samples in upright or inverted microscopes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axygen MaxyGene II Thermal Cycler with 96 well block</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>THERM-1001</td>
			<td>The new MaxyGene II Thermal Cycler increased speed and advanced features, providing the premium performance you have come to expect from Axygen brand products. Unique flexible programming. Rapid run times. Improved workflow over traditional gradient cyclers. Ramping rates up to 5&#176;C/sec. Adjustable heated lid accommodates strips, tubes and microplates.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Cover Glasses: Circles</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>12-546-2P</td>
			<td>Made of finest optical borosilicate glass, with uniform thickness and size. Circular shape. Corrosion-resistant.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Melting Point agarose</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V3841</td>
			<td>Agarose, Low Melting Point, Analytical Grade, is ideal for applications that require recovery of intact DNA fragments after gel electrophoresis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM 880 microscope from Zeiss Airyscan</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>-</td>
			<td>The Zeiss Airyscan LSM 880 microscope is a laser scanning focal microscope that can acquire images under the resolution limit (lateral resolution ~ 120nm and axial resolution ~ 350nm). The detectors are highly sensitive making it possible to acquire super-resolution images at high speed.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentr&#237;fuga Fresco 17</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>75002402</td>
			<td>Speed up routine sample preparation processes up to 17,000 &#215; g with our standard microcentrifuge, available with refrigeration. These microcentrifuges offer productivity, versatility, safety and convenience in an easy-to-use, compact design laboratory instrument.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Timelapse Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>-</td>
			<td>The Nikon C2 laser scanning confocal microscope is an ideal microscope for long-term timelapse, because thanks to its incubation chamber it is possible to keep samples in optimal conditions for more than 8 hours.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thin razor blades Schick Super Chromium</td>
			<td>Farmazon</td>
			<td>SKU: 401146</td>
			<td>&#160;The thin razor blades is used to cut the agarose matrix, allowing us to obtain the disks with the sample while maintaining the integrity of the matrix.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

vertical immobilization method for time-lapse microscopy analysis in filamentous cyanobacteria

En hovedbegivenhed i bakteriel celledeling er septationsprocessen, hvor proteinet FtsZ er nøgleelementet. FtsZ polymeriserer og danner en ringlignende struktur (Z-ring) i midten af cellen, der tjener som et stillads for andre divisionsproteiner. Superopløsningsmikroskopi i bakteriemodeller Escherichia coli og Bacillus subtilis viste, at Z-ringen er diskontinuerlig, mens levende cellebilleddannelsesundersøgelser viste, at FtsZ bevæger sig langs ringen ved en mekanisme kendt som løbebånd. For at studere dynamikken i FtsZ in vivo er en speciel celleplacering i lodret position nødvendig for at afbilde ringens komplette struktur i XY-planet. I tilfælde af FtsZ-billeddannelse i flercellede cyanobakterier, såsom Anabaena sp. PCC7120, er det udfordrende at opretholde filamenterne lodret på grund af cellernes størrelse og filamenternes længde. I denne artikel beskriver vi en metode, der tillader lodret immobilisering af Anabaena sp. PCC 7120-filamenter ved hjælp af agarose og sprøjter med lavt smeltepunkt til registrering af Z-ringen i en mutant, der udtrykker et FtsZ-sfGFP-fusionsprotein. Denne metode er en hurtig og billig måde at registrere proteindynamik på divisionsstedet ved hjælp af konfokal mikroskopi.

Visualisering af Z-ringen i Anabaena sp. ved hjælp af den vertikale immobiliseringsmetode For at studere dynamikken i Z-ringkomponenter i bakterier er det nødvendigt at erhverve billeder i lodret orienterede celler. I denne position er det muligt at visualisere Z-ringen og de vigtigste proteiner i divisomet for at overvåge proteindynamikken ved time-lapse-mikroskopi. Det klassiske prøvepræparat til bakterier virker ikke for filamentøse cyanobakterier. I tilfælde af Anabaena sp...

Watch this Scientific Journal Video about Vertical Immobilization Method for Time-Lapse Microscopy Analysis in Filamentous Cyanobacteria at JoVE.com

Vertical Immobilization Method for Time-Lapse Microscopy Analysis in Filamentous Cyanobacteria

Vi præsenterer en enkel og tilgængelig metode til filamentøs cyanobakteriel visualisering i XY-planet. En agarosematrix med lavt smeltepunkt blev anvendt, hvilket tillod erhvervelse af billeder af proteiner involveret i divisionen i lodret orientering. Derfor kan denne metode anvendes på enhver filamentøs organisme og forskellige slags proteiner.

Vertikal immobiliseringsmetode til time-lapse mikroskopi analyse i filamentøse cyanobakterier

A main event in bacterial cell division is the septation process, where the protein FtsZ is the key element. FtsZ polymerizes forming a ring-like ...

I bakterier kræver undersøgelsen af dynamikken i celledelingsproteiner en rumlig orientering af cellerne. For eksempel i tilfælde af Z-ringen, hovedkomponenten i bakteriel celledeling, er en lodret orientering grundlæggende for at registrere hele strukturen i XY-planet. I denne video udvikler vi en metode til at opnå denne særlige orientering i de trådformede cyanobakterier Anabaena.Anabaena er en multicellulær fotosyntetisk organisme, og deler med andre bakterier evnen til at bruge atmosfærisk dinitrogen som nitrogenkilde. I mangel af dette element differentierer Anabaena celler specialiseret i nitrogenfiksering. Derfor giver det en fremragende model til at analysere forholdet mellem cellulær division og multicellularitet.Vælg først en divisom komponent, der findes i målfilamentøs cyanobakteriel stamme. Til eksperimentet er det nødvendigt at konstruere en filamentøs cyanobakteriel mutant, der udtrykker den valgte divisomkomponent smeltet sammen med et fluorescerende protein. I denne protokol bruger vi en Anabaena-mutant, der udtrykker FtsZ smeltet sammen med GFP som et eksempel.Først lav en frisk subkultur af mutanten med 10 ml af en kultur i stationær fase og 90 ml flydende medium. Derefter vokser den nye cellekultur i konstant lys og ved den optimale temperatur, indtil den når den eksponentielle fase. I vores eksempel blev mutanten dyrket ved 25 Celsius grader i syv dage.Tag nu to ml af vækstkulturen og læg den i et centrifugerør. Centrifuger ved 2.500 x g i 10 minutter ved stuetemperatur. Efter centrifugeringen skal du kontrollere, at alle cellerne er på bunden af røret.Vær forsigtig, når du håndterer prøverne, for at undgå resuspension. Agaroseopløsningen med 3 % lavt smeltepunkt opvarmes i mikrobølgeovn. Det er vigtigt at gøre dette i korte tidsintervaller og kontrollere opløsningen, indtil den er helt flydende.Når det er smeltet, skal du sætte det til side for at køle ned. Der udtages centrifugeglas fra det foregående trin, 1,9 ml supernatanten kasseres, og cellerne i det resterende rumfang opslæmmes igen ved pipettering mindst tre gange op og ned. På din arbejdsplads skal du sætte røret med cellerne, den smeltede agaroseopløsning, en milliliter sprøjte skåret i spidsen og en skalpel med et nyt og rent blad.Bland derefter cellerne med 900 mikroliter af 3%agaroseopløsningen ved pipettering mindst tre gange. Det er virkelig vigtigt at sikre, at agaroseopløsningen ikke er for varm, men forbliver flydende. Med dette undgår vi celleskader under denne proces.Det næste trin skal udføres hurtigt, og før agaroseopløsningen gelificerer. Sug agarosematrixen forsigtigt op i en milliliter sprøjte. Det er vigtigt at undgå dannelse af bobler, mens prøven suges op.Derefter inkuberes prøven og sætter sprøjten i vandret position ved stuetemperatur i to timer. Efter inkubationen fjernes matrixen forsigtigt med cellerne ved hjælp af stemplet i en ren og flad overflade. Brug skalpellen til at skære gelprøven i skiver så tynde som muligt og opretholde matrixens integritet.Derefter deponeres prøverne i den tilsvarende dækseddel side om side. Som vist i videoen kan du i dette trin bruge et tip til at hjælpe med håndteringsprocessen af prøven. Til time-lapse-eksperimenter anbefales det at bruge et cellekammer lavet til mikroskopianalyse.I dette tilfælde bruger vi cirkulære dæksedler, der passer ind i denne type kamre, som du kan se i videoen. Endelig, for at forhindre dehydrering af prøven, tilsættes et ekstra volumen smeltet 3% agaroseopløsning inde i kammeret. Før billeddannelse skal du vente, indtil agarosen er fuldstændig gelificeret.Sæt nu kammeret med cellerne i mikroskopet til billeddannelse. Det anbefales at bruge et udstyr med temperatur- og fugtighedsregulering. Visualiser prøven i lyst felt med maksimal forstørrelse, og søg i et lodret orienteret filament.Du kan finde divisionsstedet af interesse med en indledende scanning ved hjælp af autofluorescenssignalet langs Z-planet. Med dette skal du bruge parametrene for din fluorescerende proteinmarkør til at visualisere signalet fra dit protein af interesse på divisionsstedet. Nu kan du udføre time-lapse eksperimenter i henhold til den biologiske model og proteinet af interesse.I dette tilfælde kan vi se hele strukturen af Z-ringen i FtsZ-GFP-mutanten i XY-planet. Med vores metode var vi i stand til at registrere dynamikken i disse ringe i lang tid. Endelig konkluderer vi med ændringerne i fluorescensintensitet, at denne struktur er meget dynamisk i vores model.Denne metode er en hurtig og billig protokol til registrering af proteindynamikken på divisionsstedet ved hjælp af konfokalmikroskopi anvendt på komplekse morfologier som filamentøse cyanobakterier ved hjælp af Anabaena som model.

Research

JoVE Journal

Biology

Monitoring Actin Disassembly with Time-lapse Microscopy

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes.  The transparency of the 
embryos, the genetic ...

Quantitative Analysis of Random Migration of Cells Using Time-lapse Video Microscopy

Kvantitativ analyse af Random migration af celler Brug af Time-lapse Video Microscopy

Cell migration is a dynamic process, which is important for embryonic development, tissue repair, immune system function, and tumor invasion 1, 2. During ...

Use of Time Lapse Microscopy to Visualize Anoxia-induced Suspended Animation in C. elegans Embryos

Use of Time Lapse Microscopy to Visualize Anoxia-induced Suspended Animation in C. elegans Embryos

Brug af Time Lapse Microscopy at Visualiser Anoxia-induceret Suspended Animation i<em&gt; C. elegans</em&gt; Embryoner

Caenorhabdits elegans has been used extensively in the study of stress resistance, which is facilitated by the transparency of the adult and embryo stages ...

Visualization of Craniofacial Development in the sox10: kaede Transgenic Zebrafish Line Using Time-lapse Confocal Microscopy

Visualisering af kraniofaciale udvikling i sox10: Kaede Transgene zebrafisk linje ved hjælp af Time-lapse konfokal mikroskopi

Vertebrate palatogenesis is a highly choreographed and complex developmental process, which involves migration of cranial neural crest (CNC) cells, ...

Time-Lapse Video Microscopy for Assessment of EYFP-Parkin Aggregation as a Marker for Cellular Mitophagy

Time-Lapse Video mikroskopi for Vurdering af EYFP-Parkin Aggregering som markør for Cellulær Mitophagy

Time-lapse video microscopy can be defined as the real time imaging of living cells. This technique relies on the collection of images at different time ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

Høj opløsning Time-lapse Imaging og Automatiseret analyse af mikrotubulusdynamik i levende menneske navlestrengsveneendotelceller

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

A Versatile Method for Mounting Arabidopsis Leaves for Intravital Time-lapse Imaging

A Versatile Method for Mounting Arabidopsis Leaves for Intravital Time-lapse Imaging

En alsidig metode til montering Arabidopsis blade til Intravital Time-lapse Imaging

The plant immune response associated with a genome-wide transcriptional reprogramming is initiated at the site of infection. Thus, the immune response is ...

Specific Labeling of Mitochondrial Nucleoids for Time-lapse Structured Illumination Microscopy

Specifik mærkning af mitokondrielle nukleoider til tidsforfald struktureret belysning mikroskopi

Mitochondrial nucleoids are compact particles formed by mitochondrial DNA molecules coated with proteins. Mitochondrial DNA encodes tRNAs, rRNAs, and ...