Name: vertical immobilization method for time-lapse microscopy analysis in filamentous cyanobacteria
Uploaded: 2023-09-25T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Vertical Immobilization Method for Time-Lapse Microscopy Analysis in Filamentous Cyanobacteria at JoVE.com

Siamo grati alle borse di dottorato nazionali (ANID 21211333; 21191389) per il finanziamento. Grant Fondecyt 1161232.
Questo lavoro è stato sostenuto da de Advanced Microscopy Facility UMA UC.

1. Considerazioni e selezione del modello cellulare
NOTA: I cianobatteri hanno una forte autofluorescenza dovuta alla presenza di pigmenti fotosintetici. Questo segnale è nella parte rossa dello spettro, quindi, le proteine fluorescenti adatte per l'imaging nei cianobatteri sono quelle lontane dall'emissione rossa. Ad esempio, GFP, YFP, Venere, Turchese e BFP.
<ol><li>Selezionare un componente divisivo presente nel ceppo cianobatterico filamentoso bersaglio. Per gli esperim...

<ol>
	<li>L&#246;we, J., Amos, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+the+bacterial+cell-division+protein+FtsZ.">Crystal structure of the bacterial cell-division protein FtsZ.</a> Nature. 391 (6663), 203-206 (1998).</li><li>Erickson, H. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Movement+dynamics+of+divisome+proteins+and+PBP2x:FtsW+in+cells+of+Streptococcus+pneumoniae.">Movement dynamics of divisome proteins and PBP2x:FtsW in cells of Streptococcus pneumoniae.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (8), 3211-3220 (2019).</li><li>Bisson-Filho, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treadmilling+by+FtsZ+filaments+drives+peptidoglycan+synthesis+and+bacterial+cell+division.">Treadmilling by FtsZ filaments drives peptidoglycan synthesis and bacterial cell division.</a> Science. 355 (6326), 739-743 (2017).</li><li>Yang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GTPase+activity-coupled+treadmilling+of+the+bacterial+tubulin+FtsZ+organizes+septal+cell+wall+synthesis.">GTPase activity-coupled treadmilling of the bacterial tubulin FtsZ organizes septal cell wall synthesis.</a> Science. 355 (6326), 744-747 (2017).</li><li>Whitley, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FtsZ+treadmilling+is+essential+for+Z-ring+condensation+and+septal+constriction+initiation+in+Bacillus+subtilis+cell+division.">FtsZ treadmilling is essential for Z-ring condensation and septal constriction initiation in Bacillus subtilis cell division.</a> Nature Communications. 12 (1), (2021).</li><li>Maz&#243;n, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LexA-binding+sequences+in+Gram-positive+and+cyanobacteria+are+closely+related.">LexA-binding sequences in Gram-positive and cyanobacteria are closely related.</a> Molecular Genetics and Genomics. 271 (1), 40-49 (2004).</li><li>Mandakovic, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CyDiv,+a+conserved+and+novel+filamentous+cyanobacterial+cell+division+protein+involved+in+septum+localization.">CyDiv, a conserved and novel filamentous cyanobacterial cell division protein involved in septum localization.</a> Frontiers in Microbiology. 7 (FEB), 1-11 (2016).</li><li>Camargo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ZipN+is+an+essential+FtsZ+membrane+tether+and+contributes+to+the+septal+localization+of+SepJ+in+the+filamentous+cyanobacterium+Anabaena.">ZipN is an essential FtsZ membrane tether and contributes to the septal localization of SepJ in the filamentous cyanobacterium Anabaena.</a> Scientific Reports. 9 (1), 1-15 (2019).</li><li>Thiel, T., Peter Wolk, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conjugal+Transfer+of+Plasmids+to+Cyanobacteria.">Conjugal Transfer of Plasmids to Cyanobacteria.</a> Methods in Enzymology. 153 (C), 232-243 (1987).</li><li>Moffitt, J. R., Lee, J. B., Cluzel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+single-cell+chemostat:+An+agarose-based,+microfluidic+device+for+high-throughput,+single-cell+studies+of+bacteria+and+bacterial+communities.">The single-cell chemostat: An agarose-based, microfluidic device for high-throughput, single-cell studies of bacteria and bacterial communities.</a> Lab on a Chip. 12 (8), 1487-1494 (2012).</li></ol>

Lo studio della dinamica delle proteine divisive è senza dubbio una sfida. In particolare, nei cianobatteri filamentosi, una delle sfide è la visualizzazione dell'anello Z nel piano orizzontale, per il quale le cellule devono essere orientate verticalmente. Il metodo che abbiamo descritto qui consente il posizionamento dell'anello Z nel piano XY per eseguire le diverse analisi. Questo è il primo metodo semplice per cianobatteri filamentosi che consente la visualizzazione completa dell'anello Z. 
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La divisione cellulare batterica è il processo in cui una cellula madre genera due cellule figlie, nella maggior parte dei casi dal meccanismo noto come fissione binaria. Uno dei primi eventi nel processo di settazione è la localizzazione di FtsZ nel mezzo della cella1. Questa proteina, che è strutturalmente omologa alla tubulina2, è conservata e ampiamente distribuita nella maggior parte dei batteri e la sua polimerizzazione genera una struttura contrattile nota come Z-ring3. Questo anello funge da impalcatura per altre proteine di divisione e insieme formano un meccanismo molecolare chiamato divisomia. Diversi studi hanno dimostrato che l'anello Z è altamente dinamico e che i protofilamenti FtsZ si muovono per tapis roulant 4,5,6. Per studiare l'anello Z in esperimenti time-lapse, è consigliabile registrare il sito di divisione nel piano XY per una migliore risoluzione e un campionamento rapido. Per raggiungere questo obiettivo, è necessario sviluppare metodi di immobilizzazione cellulare verticale che includano comunemente la nanofabbricazione di trappole cellulari microforate e dispositivi microfluidici complessi7.
I cianobatteri sono microrganismi fotosintetici classificati come gram-negativi dalla loro morfologia cellulare. Tuttavia, filogeneticamente sono più vicini ai batteri gram-positivi8. Questi organismi hanno geni di divisione cellulare che sono comuni all'interno dei batteri gram-positivi e gram-negativi, ma il loro divisore contiene anche elementi unici9. PCC 7120 (di seguito Anabaena sp.) è un cianobatterio filamentoso con un piano di divisione ed è un modello per lo studio della divisione cellulare nei cianobatteri multicellulari. In questo ceppo, è stato possibile determinare il posizionamento di FtsZ al centro delle celle10. Tuttavia, non ci sono studi che mostrano la dinamica in vivo di FtsZ in questo modello. Nel nostro laboratorio, attraverso l'accoppiamento triparentale e la ricombinazione omologa, abbiamo ottenuto un mutante totalmente segregato di Anabaena sp. che esprime la proteina FtsZ fusa a sfGFP, che ha sostituito il gene ftsZ endogeno completo. Abbiamo sviluppato un metodo di immobilizzazione cellulare rapido e semplice che favorisce l'orientamento verticale dei filamenti di ceppo mutanti per esperimenti time-lapse per visualizzare le proteine di divisione nei cianobatteri filamentosi. Questo metodo non ha bisogno di dispositivi microfluidici che possono essere costosi e difficili da sviluppare. Ad esempio, abbiamo usato questo protocollo per visualizzare l'anello Z nel mutante FtsZ-sfGFP mediante microscopia confocale.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 ml syringe</td>
			<td>Qingdao Agna Medical Technology Co., Ltd.</td>
			<td>-</td>
			<td>The disposable medical plastic syringe with 1 ml needle generally used to pump liquid or injection liquid, in this experiment it is used to suck the sample and make it polymerize.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Attofluor Cell Chamber</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>A7816</td>
			<td>The Attofluor Cell Camera is a durable and practical coverslip holder designed for viewing live cell samples in upright or inverted microscopes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axygen MaxyGene II Thermal Cycler with 96 well block</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>THERM-1001</td>
			<td>The new MaxyGene II Thermal Cycler increased speed and advanced features, providing the premium performance you have come to expect from Axygen brand products. Unique flexible programming. Rapid run times. Improved workflow over traditional gradient cyclers. Ramping rates up to 5&#176;C/sec. Adjustable heated lid accommodates strips, tubes and microplates.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Cover Glasses: Circles</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>12-546-2P</td>
			<td>Made of finest optical borosilicate glass, with uniform thickness and size. Circular shape. Corrosion-resistant.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Melting Point agarose</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V3841</td>
			<td>Agarose, Low Melting Point, Analytical Grade, is ideal for applications that require recovery of intact DNA fragments after gel electrophoresis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM 880 microscope from Zeiss Airyscan</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>-</td>
			<td>The Zeiss Airyscan LSM 880 microscope is a laser scanning focal microscope that can acquire images under the resolution limit (lateral resolution ~ 120nm and axial resolution ~ 350nm). The detectors are highly sensitive making it possible to acquire super-resolution images at high speed.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentr&#237;fuga Fresco 17</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>75002402</td>
			<td>Speed up routine sample preparation processes up to 17,000 &#215; g with our standard microcentrifuge, available with refrigeration. These microcentrifuges offer productivity, versatility, safety and convenience in an easy-to-use, compact design laboratory instrument.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Timelapse Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>-</td>
			<td>The Nikon C2 laser scanning confocal microscope is an ideal microscope for long-term timelapse, because thanks to its incubation chamber it is possible to keep samples in optimal conditions for more than 8 hours.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thin razor blades Schick Super Chromium</td>
			<td>Farmazon</td>
			<td>SKU: 401146</td>
			<td>&#160;The thin razor blades is used to cut the agarose matrix, allowing us to obtain the disks with the sample while maintaining the integrity of the matrix.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

vertical immobilization method for time-lapse microscopy analysis in filamentous cyanobacteria

Un evento principale nella divisione cellulare batterica è il processo di settizione, dove la proteina FtsZ è l'elemento chiave. FtsZ polimerizza formando una struttura ad anello (Z-ring) nel mezzo della cellula che funge da impalcatura per altre proteine di divisione. La microscopia a super-risoluzione in modelli batterici Escherichia coli e Bacillus subtilis ha mostrato che l'anello Z è discontinuo, mentre studi di imaging cellulare vivo hanno dimostrato che FtsZ si muove lungo l'anello con un meccanismo noto come tapis roulant. Per studiare la dinamica di FtsZ in vivo, è necessario uno speciale posizionamento delle celle in posizione verticale per l'imaging della struttura completa dell'anello nel piano XY. Nel caso dell'imaging FtsZ nei cianobatteri multicellulari, come Anabaena sp. PCC7120, mantenere i filamenti in posizione verticale è difficile a causa delle dimensioni delle cellule e della lunghezza dei filamenti. In questo articolo, descriviamo un metodo che consente l'immobilizzazione verticale dei filamenti di Anabaena sp. PCC 7120 utilizzando agarosio a basso punto di fusione e siringhe, per registrare l'anello Z in un mutante che esprime una proteina di fusione FtsZ-sfGFP. Questo metodo è un modo rapido ed economico per registrare la dinamica delle proteine nel sito di divisione utilizzando la microscopia confocale.

Visualizzazione dell'anello Z in Anabaena sp. utilizzando il metodo dell'immobilizzazione verticale Per studiare la dinamica dei componenti dell'anello Z nei batteri, è necessario acquisire immagini in cellule orientate verticalmente. In questa posizione, è possibile visualizzare l'anello Z e le principali proteine del divisore per monitorare la dinamica delle proteine mediante microscopia time-lapse. La classica preparazione del campione per i batteri non funziona per i cianobatteri filame...

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Vertical Immobilization Method for Time-Lapse Microscopy Analysis in Filamentous Cyanobacteria

Presentiamo un metodo semplice e accessibile per la visualizzazione cianobatterica filamentosa nel piano XY. È stata utilizzata una matrice di agarosio a basso punto di fusione, che consente l'acquisizione di immagini di proteine coinvolte nella divisione, con orientamento verticale. Pertanto, questa metodologia può essere applicata a qualsiasi organismo filamentoso e diversi tipi di proteine.

Metodo di immobilizzazione verticale per l'analisi al microscopio time-lapse in cianobatteri filamentosi

A main event in bacterial cell division is the septation process, where the protein FtsZ is the key element. FtsZ polymerizes forming a ring-like ...

Nei batteri, lo studio della dinamica delle proteine di divisione cellulare richiede un orientamento spaziale delle cellule. Ad esempio, nel caso dell'anello Z, il componente principale nella divisione cellulare batterica, un orientamento verticale è fondamentale per registrare l'intera struttura nel piano XY. In questo video, sviluppiamo un metodo per ottenere questo particolare orientamento nei cianobatteri filamentosi Anabaena.Anabaena è un organismo fotosintetico multicellulare e condivide con altri batteri la capacità di utilizzare il diazoto atmosferico come fonte di azoto. In assenza di questo elemento, Anabaena differenzia le cellule specializzate nella fissazione dell'azoto. Pertanto, fornisce un modello eccellente in cui analizzare la relazione tra divisione cellulare e multicellularità.In primo luogo, selezionare un componente divisorio presente nel ceppo cianobatterico filamentoso bersaglio. Per l'esperimento, è necessario costruire un mutante cianobatterico filamentoso che esprima la componente divisiva selezionata fusa in una proteina fluorescente. In questo protocollo, usiamo un mutante Anabaena che esprime FtsZ fuso a GFP come esempio.In primo luogo, creare una nuova sottocultura del mutante con 10 millilitri di una coltura in fase stazionaria e 90 millilitri di mezzo liquido. Quindi coltivare la nuova coltura cellulare in luce costante e alla temperatura ottimale, fino a raggiungere la fase esponenziale. Nel nostro esempio, il mutante è cresciuto a 25 gradi Celsius per sette giorni.Ora prendi due millilitri della coltura di crescita e mettila in un tubo da centrifuga. Centrifugare a 2.500 x g per 10 minuti a temperatura ambiente. Dopo la centrifugazione, controllare che tutte le celle siano sul fondo del tubo.Prestare attenzione durante la manipolazione dei campioni, per evitare la risospensione. Riscaldare la soluzione di agarosio a basso punto di fusione al 3% in un forno a microonde. È importante farlo in brevi intervalli di tempo e controllare la soluzione fino a completa liquidità.Una volta sciolto, mettere da parte per raffreddare. Prendi le provette della centrifuga del passaggio precedente, scarta 1,9 millilitri di surnatante e risospendi le celle nel volume rimanente pipettando almeno tre volte su e giù. Sul posto di lavoro, metti il tubo con le cellule, la soluzione di agarosio fuso, una siringa da un millilitro tagliata nella punta e un bisturi con una lama nuova e pulita.Quindi mescolare le cellule con 900 microlitri della soluzione di agarosio al 3% pipettando almeno tre volte. È molto importante assicurarsi che la soluzione di agarosio non sia troppo calda, ma rimanga liquida. Con questo, stiamo evitando danni alle cellule durante questo processo.Il prossimo passo deve essere fatto velocemente e prima che la soluzione di agarosio gelifici. Aspirare la matrice di agarosio in una siringa da un millilitro, con attenzione. È importante evitare la generazione di bolle mentre il campione viene aspirato.Successivamente, incubare il campione, mettendo la siringa in posizione orizzontale a temperatura ambiente per due ore. Dopo l'incubazione, rimuovere con attenzione la matrice con le cellule usando lo stantuffo in una superficie pulita e piana. Usando il bisturi, tagliare il campione di gel a fette il più sottili possibile, mantenendo l'integrità della matrice.Quindi depositare i campioni nel foglietto corrispondente, fianco a fianco. Come mostrato nel video, in questo passaggio, è possibile utilizzare un suggerimento per assistere nel processo di gestione del campione. Per gli esperimenti time-lapse, si raccomanda l'uso di una camera cellulare fatta per l'analisi al microscopio.In questo caso, utilizziamo copertine circolari che si adattano a questo tipo di camere, come puoi vedere nel video. Infine, per prevenire la disidratazione del campione, aggiungere un volume extra di soluzione fusa di agarosio al 3% all'interno della camera. Prima di immaginare, attendere che l'agarosio sia completamente gelificato.Ora metti la camera con le cellule nel microscopio per l'imaging. Si consiglia di utilizzare un'apparecchiatura con controllo della temperatura e dell'umidità. Visualizza il campione in campo luminoso con il massimo ingrandimento e cerca un filamento orientato verticalmente.È possibile trovare il sito di divisione di interesse con una scansione iniziale utilizzando il segnale di autofluorescenza lungo il piano Z. Con questo, usa i parametri del tuo marcatore proteico fluorescente per visualizzare il segnale della tua proteina di interesse nel sito della divisione. Ora è possibile eseguire esperimenti time-lapse in base al modello biologico e alla proteina di interesse.In questo caso, possiamo vedere l'intera struttura dell'anello Z nel mutante FtsZ-GFP, nel piano XY. Con il nostro metodo, siamo stati in grado di registrare la dinamica di questi anelli in un lungo periodo di tempo. Infine, con i cambiamenti nell'intensità della fluorescenza, concludiamo che questa struttura è altamente dinamica nel nostro modello.Questo metodo è un protocollo rapido ed economico per registrare la dinamica proteica nel sito di divisione mediante microscopia confocale applicata a morfologie complesse come i cianobatteri filamentosi, utilizzando Anabaena come modello.

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