Name: vertical immobilization method for time-lapse microscopy analysis in filamentous cyanobacteria
Uploaded: 2023-09-25T14:30:00
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자금 조달을 위해 국립 박사 장학금 (ANID 21211333; 21191389)에 감사드립니다. 그랜트 폰데시트 1161232.
이 작업은 고급 현미경 시설 UMA UC의 지원을 받았습니다.

1. 세포 모델의 고려 사항 및 선택
참고: 시아노박테리아는 광합성 색소의 존재로 인해 강력한 자가형광을 가지고 있습니다. 이 신호는 스펙트럼의 빨간색 부분에 있으므로 시아노박테리아의 이미징에 적합한 형광 단백질은 적색 방출과는 거리가 먼 단백질입니다. 예를 들어 GFP, YFP, 금성, 청록색 및 BFP가 있습니다.
<ol><li>표적 사상 시아노박테리아 균주에 존재?...

<ol>
	<li>L&#246;we, J., Amos, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+the+bacterial+cell-division+protein+FtsZ.">Crystal structure of the bacterial cell-division protein FtsZ.</a> Nature. 391 (6663), 203-206 (1998).</li><li>Erickson, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FtsZ,+a+prokaryotic+homolog+of+tubulin.">FtsZ, a prokaryotic homolog of tubulin.</a> Cell. 80 (3), 367-370 (1995).</li><li>Huang, K., Mychack, A., Tchorzewski, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+FtsZ+C-terminal+variable+(+CTV+)+region+in+Z-ring+assembly+and+interaction+with+the+Z-ring+stabilizer+ZapD+in+E.">Characterization of the FtsZ C-terminal variable ( CTV ) region in Z-ring assembly and interaction with the Z-ring stabilizer ZapD in E.</a> coli cytokinesis. , 1-24 (2016).</li><li>Perez, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Movement+dynamics+of+divisome+proteins+and+PBP2x:FtsW+in+cells+of+Streptococcus+pneumoniae.">Movement dynamics of divisome proteins and PBP2x:FtsW in cells of Streptococcus pneumoniae.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (8), 3211-3220 (2019).</li><li>Bisson-Filho, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treadmilling+by+FtsZ+filaments+drives+peptidoglycan+synthesis+and+bacterial+cell+division.">Treadmilling by FtsZ filaments drives peptidoglycan synthesis and bacterial cell division.</a> Science. 355 (6326), 739-743 (2017).</li><li>Yang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GTPase+activity-coupled+treadmilling+of+the+bacterial+tubulin+FtsZ+organizes+septal+cell+wall+synthesis.">GTPase activity-coupled treadmilling of the bacterial tubulin FtsZ organizes septal cell wall synthesis.</a> Science. 355 (6326), 744-747 (2017).</li><li>Whitley, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FtsZ+treadmilling+is+essential+for+Z-ring+condensation+and+septal+constriction+initiation+in+Bacillus+subtilis+cell+division.">FtsZ treadmilling is essential for Z-ring condensation and septal constriction initiation in Bacillus subtilis cell division.</a> Nature Communications. 12 (1), (2021).</li><li>Maz&#243;n, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LexA-binding+sequences+in+Gram-positive+and+cyanobacteria+are+closely+related.">LexA-binding sequences in Gram-positive and cyanobacteria are closely related.</a> Molecular Genetics and Genomics. 271 (1), 40-49 (2004).</li><li>Mandakovic, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CyDiv,+a+conserved+and+novel+filamentous+cyanobacterial+cell+division+protein+involved+in+septum+localization.">CyDiv, a conserved and novel filamentous cyanobacterial cell division protein involved in septum localization.</a> Frontiers in Microbiology. 7 (FEB), 1-11 (2016).</li><li>Camargo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ZipN+is+an+essential+FtsZ+membrane+tether+and+contributes+to+the+septal+localization+of+SepJ+in+the+filamentous+cyanobacterium+Anabaena.">ZipN is an essential FtsZ membrane tether and contributes to the septal localization of SepJ in the filamentous cyanobacterium Anabaena.</a> Scientific Reports. 9 (1), 1-15 (2019).</li><li>Thiel, T., Peter Wolk, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conjugal+Transfer+of+Plasmids+to+Cyanobacteria.">Conjugal Transfer of Plasmids to Cyanobacteria.</a> Methods in Enzymology. 153 (C), 232-243 (1987).</li><li>Moffitt, J. R., Lee, J. B., Cluzel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+single-cell+chemostat:+An+agarose-based,+microfluidic+device+for+high-throughput,+single-cell+studies+of+bacteria+and+bacterial+communities.">The single-cell chemostat: An agarose-based, microfluidic device for high-throughput, single-cell studies of bacteria and bacterial communities.</a> Lab on a Chip. 12 (8), 1487-1494 (2012).</li></ol>

나뭇잎 단백질의 역학에 대한 연구는 의심할 여지 없이 도전 과제입니다. 특히, 필라멘트 시아노박테리아에서 과제 중 하나는 세포가 수직 방향이어야 하는 수평면에서 Z-링을 시각화하는 것입니다. 여기에서 설명한 방법을 사용하면 XY 평면에서 Z-링을 배치하여 다양한 분석을 수행할 수 있습니다. 이것은 Z-링의 완전한 시각화를 가능하게 하는 사상 시아노박테리아에 대한 최초의 간단한 방법입?...

박테리아 세포 분열은 모세포가 두 개의 딸 세포를 생성하는 과정으로, 대부분의 경우 이분법으로 알려진 메커니즘에 의해 생성됩니다. 중격 과정에서 가장 초기의 사건 중 하나는 셀1의 중간에 FtsZ의 국소화입니다. 튜불린2와 구조적으로 상동성인 이 단백질은 보존되어 대부분의 박테리아에 널리 분포되어 있으며, 중합은 Z-링3으로 알려진 수축 구조를 생성합니다. 이 고리는 다른 분열 단백질의 스캐폴드 역할을 하며 함께 점쟁이라고 하는 분자 기계를 형성합니다. 여러 연구에 따르면 Z-링은 매우 역동적이며 FtsZ 프로토필라멘트는 트레드밀링 4,5,6에 의해 움직입니다. 타임랩스 실험에서 Z-링을 연구하려면 더 나은 해상도와 빠른 샘플링을 위해 XY 평면에 분할 부위를 기록하는 것이 좋습니다. 이를 달성하기 위해서는 일반적으로 마이크로홀 세포 트랩 및 복잡한 미세유체 장치의 나노 제조를 포함하는 수직 세포 고정화 방법을 개발할 필요가 있습니다(7).
시아노박테리아는 세포 형태에 따라 그람 음성으로 분류되는 광합성 미생물입니다. 그러나 계통발생학적으로 그들은 그람 양성균에 더 가깝다8. 이 유기체는 그람 양성균과 그람 음성균 내에서 흔히 볼 수 있는 세포 분열 유전자를 가지고 있지만, 그 점에는 독특한 원소도 포함되어 있다9. Anabaena sp. PCC 7120(이하 Anabaena sp.)은 하나의 분열면을 가진 필라멘트 시아노박테리아로 다세포 시아노박테리아의 세포 분열 연구를 위한 모델입니다. 이러한 변형에서, 셀(10)의 중간에서 FtsZ의 위치를 결정하는 것이 가능하였다. 그럼에도 불구하고 이 모델에서 FtsZ의 생체 내 역학을 보여주는 연구는 없습니다. 우리 실험실에서는 삼부모 짝짓기와 상동 재조합을 통해 완전히 분리된 Anabaena sp. 완전한 내인성 ftsZ 유전자를 대체한 sfGFP에 융합된 FtsZ 단백질을 발현합니다. 우리는 필라멘트 시아노박테리아의 분열 단백질을 시각화하기 위한 타임랩스 실험을 위해 돌연변이 균주 필라멘트의 수직 방향을 선호하는 빠르고 간단한 세포 고정화 방법을 개발했습니다. 이 방법은 비싸고 개발하기 어려울 수 있는 미세유체 장치가 필요하지 않습니다. 예를 들어, 이 프로토콜을 사용하여 공초점 현미경으로 FtsZ-sfGFP 돌연변이의 Z-링을 시각화했습니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 ml syringe</td>
			<td>Qingdao Agna Medical Technology Co., Ltd.</td>
			<td>-</td>
			<td>The disposable medical plastic syringe with 1 ml needle generally used to pump liquid or injection liquid, in this experiment it is used to suck the sample and make it polymerize.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Attofluor Cell Chamber</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>A7816</td>
			<td>The Attofluor Cell Camera is a durable and practical coverslip holder designed for viewing live cell samples in upright or inverted microscopes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axygen MaxyGene II Thermal Cycler with 96 well block</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>THERM-1001</td>
			<td>The new MaxyGene II Thermal Cycler increased speed and advanced features, providing the premium performance you have come to expect from Axygen brand products. Unique flexible programming. Rapid run times. Improved workflow over traditional gradient cyclers. Ramping rates up to 5&#176;C/sec. Adjustable heated lid accommodates strips, tubes and microplates.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Cover Glasses: Circles</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>12-546-2P</td>
			<td>Made of finest optical borosilicate glass, with uniform thickness and size. Circular shape. Corrosion-resistant.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Melting Point agarose</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V3841</td>
			<td>Agarose, Low Melting Point, Analytical Grade, is ideal for applications that require recovery of intact DNA fragments after gel electrophoresis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM 880 microscope from Zeiss Airyscan</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>-</td>
			<td>The Zeiss Airyscan LSM 880 microscope is a laser scanning focal microscope that can acquire images under the resolution limit (lateral resolution ~ 120nm and axial resolution ~ 350nm). The detectors are highly sensitive making it possible to acquire super-resolution images at high speed.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentr&#237;fuga Fresco 17</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>75002402</td>
			<td>Speed up routine sample preparation processes up to 17,000 &#215; g with our standard microcentrifuge, available with refrigeration. These microcentrifuges offer productivity, versatility, safety and convenience in an easy-to-use, compact design laboratory instrument.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Timelapse Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>-</td>
			<td>The Nikon C2 laser scanning confocal microscope is an ideal microscope for long-term timelapse, because thanks to its incubation chamber it is possible to keep samples in optimal conditions for more than 8 hours.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thin razor blades Schick Super Chromium</td>
			<td>Farmazon</td>
			<td>SKU: 401146</td>
			<td>&#160;The thin razor blades is used to cut the agarose matrix, allowing us to obtain the disks with the sample while maintaining the integrity of the matrix.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

vertical immobilization method for time-lapse microscopy analysis in filamentous cyanobacteria

박테리아 세포 분열의 주요 사건은 단백질 FtsZ가 핵심 요소인 중격 과정입니다. FtsZ는 중합되어 세포의 중간에 고리형 구조(Z-ring)를 형성하여 다른 분열 단백질의 스캐폴드 역할을 한다. 박테리아 모델 대장균(Escherichia coli) 과 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis )의 초고해상도 현미경은 Z-링이 불연속적이라는 것을 보여주었고, 라이브 셀 이미징 연구는 FtsZ가 트레드밀링으로 알려진 메커니즘에 의해 링을 따라 움직이는 것으로 나타났습니다. 생체 내에서 FtsZ의 역학을 연구하기 위해서는 XY 평면에서 링의 전체 구조를 이미징하기 위해 수직 위치에 특수 셀 배치가 필요합니다. Anabaena sp. PCC7120와 같은 다세포 시아노박테리아에서 FtsZ 이미징의 경우 세포의 크기와 필라멘트의 길이 때문에 필라멘트를 수직 위치로 유지하는 것이 어렵습니다. 이 기사에서는 Anabaena sp. PCC 7120 필라멘트는 저융점 아가로스와 주사기를 사용하여 FtsZ-sfGFP 융합 단백질을 발현하는 돌연변이에서 Z-링을 기록합니다. 이 방법은 컨포칼 현미경을 사용하여 분열 부위에서 단백질 역학을 빠르고 저렴하게 기록할 수 있는 방법입니다.

수직 고정화 방법을 사용한 Anabaena sp.의 Z-링 시각화 박테리아에서 Z-링 구성 요소의 역학을 연구하려면 수직 방향 세포에서 이미지를 획득해야 합니다. 이 위치에서 Z-링과 디비솜의 주요 단백질을 시각화하여 타임랩스 현미경으로 단백질 역학을 모니터링할 수 있습니다. 박테리아에 대한 고전적인 샘플 준비는 필라멘트 시아노박테리아에 대해 작동하지 않습니다. Anabaena<...

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Vertical Immobilization Method for Time-Lapse Microscopy Analysis in Filamentous Cyanobacteria

우리는 XY 평면에서 필라멘트 시아노박테리아 시각화를 위한 간단하고 접근 가능한 방법을 제시합니다. 저융점 아가로스 매트릭스가 사용되어 수직 방향에서 분열에 관여하는 단백질의 이미지를 획득할 수 있었습니다. 따라서 이 방법론은 모든 필라멘트 유기체와 다양한 종류의 단백질에 적용할 수 있습니다.

필라멘트 시아노박테리아의 타임랩스 현미경 분석을 위한 수직 고정화 방법

A main event in bacterial cell division is the septation process, where the protein FtsZ is the key element. FtsZ polymerizes forming a ring-like ...

박테리아에서 세포 분열 단백질의 역학에 대한 연구는 세포의 공간적 방향을 필요로합니다. 예를 들어, 박테리아 세포 분열의 주성분인 Z-링의 경우 수직 방향은 XY 평면의 전체 구조를 기록하는 데 기본입니다. 이 비디오에서 우리는 필라멘트 시아노박테리아 Anabaena에서 이러한 특정 방향을 달성하는 방법을 개발합니다.Anabaena는 다세포 광합성 유기체이며 대기 중 이질소를 질소 공급원으로 사용하는 능력을 다른 박테리아와 공유합니다. 이 요소가 없으면 Anabaena는 질소 고정에 특화된 세포를 분화시킵니다. 따라서 세포 분열과 다세포 사이의 관계를 분석할 수 있는 우수한 모델을 제공합니다.먼저, 표적 사상 시아노박테리아 균주에 존재하는 점유리 성분을 선택합니다. 실험을 위해서는 형광 단백질에 융합된 선택된 점쟁이 성분을 발현하는 필라멘트 시아노박테리아 돌연변이체를 구성할 필요가 있습니다. 이 프로토콜에서는 GFP에 융합된 FtsZ를 발현하는 Anabaena 돌연변이를 예로 사용합니다.먼저, 고정상에서 10 밀리리터의 배양 물과 90 밀리리터의 액체 배지로 돌연변이의 신선한 계대 배양을 만듭니다. 그런 다음 지수 단계에 도달할 때까지 일정한 빛과 최적의 온도에서 새로운 세포 배양을 성장시킵니다. 이 예에서 돌연변이는 섭씨 25도에서 7일 동안 성장했습니다.이제 성장 배양 물 2 밀리리터를 원심 분리기 튜브에 넣으십시오. 실온에서 10 분 동안 2, 500 x g에서 원심 분리한다. 원심분리 후 모든 셀이 튜브 바닥에 있는지 확인하십시오.s를 취급하는 동안 주의하십시오.amp재가 중단되지 않도록 합니다. 3% 저융점 아가로스 용액을 전자레인지에 가열합니다. 짧은 시간 간격으로이 작업을 수행하고 완전히 액체 상태가 될 때까지 용액을 확인하는 것이 중요합니다.녹으면 식히기 위해 따로 보관하십시오. 이전 단계의 원심분리기 튜브를 취하여 상청액 1.9밀리리터를 버리고 위아래로 최소 3회 피펫팅하여 나머지 부피의 세포를 다시 현탁합니다. 작업장에서 세포가 들어있는 튜브, 녹은 아가로스 용액, 팁에 잘린 1 밀리리터 주사기 및 새롭고 깨끗한 칼날이 달린 메스를 넣으십시오.이어서, 세포를 900 마이크로리터의 3%아가로스 용액과 적어도 3회 피펫팅하여 혼합한다. agarose 용액이 너무 뜨겁지 않고 액체로 남아 있는지 확인하는 것이 정말 중요합니다. 이를 통해 우리는 이 과정에서 세포 손상을 방지하고 있습니다.다음 단계는 아가로스 용액이 겔화되기 전에 신속하게 수행되어야합니다. 1 밀리리터 주사기에서 agarose 매트릭스를 조심스럽게 빨아들입니다. 샘플이 빨려 들어가는 동안 기포가 발생하지 않도록 하는 것이 중요합니다.그 후, 샘플을 배양하고, 주사기를 실온에서 2 시간 동안 수평 위치에 놓는다. 배양 후 깨끗하고 평평한 표면에서 플런저를 사용하여 세포가 있는 매트릭스를 조심스럽게 제거합니다. 메스를 사용하여 겔 샘플을 가능한 한 얇게 조각하여 매트릭스의 무결성을 유지합니다.그런 다음 샘플을 해당 커버슬립에 나란히 놓습니다. 비디오에서 볼 수 있듯이 이 단계에서는 팁을 사용하여 샘플 처리 프로세스를 지원할 수 있습니다. 타임랩스 실험의 경우 현미경 분석을 위해 만들어진 세포 챔버를 사용하는 것이 좋습니다.이 경우 비디오에서 볼 수 있듯이 이러한 유형의 챔버에 맞는 원형 커버 슬립을 사용합니다. 마지막으로, 샘플의 탈수를 방지하기 위해 챔버 내부에 용융된 3% 아가로스 용액을 추가합니다. 이미징하기 전에 아가로스가 완전히 겔화 될 때까지 기다리십시오.이제 이미징을 위해 현미경에 세포가 있는 챔버를 넣습니다. 온도 및 습도 조절이 가능한 장비를 사용하는 것이 좋습니다. 최대 배율로 명시야에서 샘플을 시각화하고 수직 방향의 필라멘트를 검색합니다.Z 평면을 따라 자가형광 신호를 사용하는 초기 스캔으로 관심 분할 부위를 찾을 수 있습니다. 이를 통해 형광 단백질 마커의 파라미터를 사용하여 분열 부위에서 관심 단백질의 신호를 시각화할 수 있습니다. 이제 생물학적 모델과 관심 단백질에 따라 타임랩스 실험을 수행할 수 있습니다.이 경우 XY 평면에서 FtsZ-GFP 돌연변이에서 Z-링의 전체 구조를 볼 수 있습니다. 우리의 방법으로, 우리는 오랜 시간 동안이 고리의 역학을 기록 할 수있었습니다. 마지막으로, 형광 강도의 변화와 함께, 우리는 이 구조가 우리 모델에서 매우 역동적이라는 결론을 내립니다.이 방법은 Anabaena를 모델로 사용하여 필라멘트 시아노박테리아와 같은 복잡한 형태에 적용된 컨포칼 현미경을 통해 분열 부위의 단백질 역학을 등록하는 빠르고 저렴한 프로토콜입니다.

Research

JoVE Journal

Biology

Monitoring Actin Disassembly with Time-lapse Microscopy

시간 경과 현미경과 분해 굴지 모니터링

연구

생물학

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siRNA Transfection 후의 유사 분열의 시간 저속 영상

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Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

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상순 Embryogenesis의 시간 경과 현미경 Caenorhabditis 엘레간스

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes.  The transparency of the 
embryos, the genetic ...

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Use of Time Lapse Microscopy to Visualize Anoxia-induced Suspended Animation in C. elegans Embryos

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Caenorhabdits elegans has been used extensively in the study of stress resistance, which is facilitated by the transparency of the adult and embryo stages ...

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sox10의 두개 안면 개발의 시각화 : 단풍 나무 형질 전환 제브라 피쉬의 선은 시간 경과 공 초점 현미경을 사용하여

Vertebrate palatogenesis is a highly choreographed and complex developmental process, which involves migration of cranial neural crest (CNC) cells, ...

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Mitochondrial nucleoids are compact particles formed by mitochondrial DNA molecules coated with proteins. Mitochondrial DNA encodes tRNAs, rRNAs, and ...