Name: vertical immobilization method for time-lapse microscopy analysis in filamentous cyanobacteria
Uploaded: 2023-09-25T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Vertical Immobilization Method for Time-Lapse Microscopy Analysis in Filamentous Cyanobacteria at JoVE.com

Vi er takknemlige for nasjonale doktorgradsstipend (ANID 21211333; 21191389) for finansieringen. Grant Fondecyt 1161232.
Dette arbeidet ble støttet av de Advanced Microscopy Facility UMA UC.

1. Vurderinger og valg av mobilmodell
MERK: Cyanobakterier har en sterk autofluorescens på grunn av tilstedeværelsen av fotosyntetiske pigmenter. Dette signalet er i den røde delen av spekteret, derfor er fluorescerende proteiner egnet for avbildning i cyanobakterier de som langt fra den røde utslippet. For eksempel GFP, YFP, Venus, Turkis og BFP.
<ol><li>Velg en divisomkomponent som finnes i målfilamentøs cyanobakteriestamme. For forsøkene er det nødvendig å konstr...

<ol>
	<li>L&#246;we, J., Amos, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+the+bacterial+cell-division+protein+FtsZ.">Crystal structure of the bacterial cell-division protein FtsZ.</a> Nature. 391 (6663), 203-206 (1998).</li><li>Erickson, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FtsZ,+a+prokaryotic+homolog+of+tubulin.">FtsZ, a prokaryotic homolog of tubulin.</a> Cell. 80 (3), 367-370 (1995).</li><li>Huang, K., Mychack, A., Tchorzewski, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+FtsZ+C-terminal+variable+(+CTV+)+region+in+Z-ring+assembly+and+interaction+with+the+Z-ring+stabilizer+ZapD+in+E.">Characterization of the FtsZ C-terminal variable ( CTV ) region in Z-ring assembly and interaction with the Z-ring stabilizer ZapD in E.</a> coli cytokinesis. , 1-24 (2016).</li><li>Perez, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Movement+dynamics+of+divisome+proteins+and+PBP2x:FtsW+in+cells+of+Streptococcus+pneumoniae.">Movement dynamics of divisome proteins and PBP2x:FtsW in cells of Streptococcus pneumoniae.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (8), 3211-3220 (2019).</li><li>Bisson-Filho, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treadmilling+by+FtsZ+filaments+drives+peptidoglycan+synthesis+and+bacterial+cell+division.">Treadmilling by FtsZ filaments drives peptidoglycan synthesis and bacterial cell division.</a> Science. 355 (6326), 739-743 (2017).</li><li>Yang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GTPase+activity-coupled+treadmilling+of+the+bacterial+tubulin+FtsZ+organizes+septal+cell+wall+synthesis.">GTPase activity-coupled treadmilling of the bacterial tubulin FtsZ organizes septal cell wall synthesis.</a> Science. 355 (6326), 744-747 (2017).</li><li>Whitley, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FtsZ+treadmilling+is+essential+for+Z-ring+condensation+and+septal+constriction+initiation+in+Bacillus+subtilis+cell+division.">FtsZ treadmilling is essential for Z-ring condensation and septal constriction initiation in Bacillus subtilis cell division.</a> Nature Communications. 12 (1), (2021).</li><li>Maz&#243;n, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LexA-binding+sequences+in+Gram-positive+and+cyanobacteria+are+closely+related.">LexA-binding sequences in Gram-positive and cyanobacteria are closely related.</a> Molecular Genetics and Genomics. 271 (1), 40-49 (2004).</li><li>Mandakovic, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CyDiv,+a+conserved+and+novel+filamentous+cyanobacterial+cell+division+protein+involved+in+septum+localization.">CyDiv, a conserved and novel filamentous cyanobacterial cell division protein involved in septum localization.</a> Frontiers in Microbiology. 7 (FEB), 1-11 (2016).</li><li>Camargo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ZipN+is+an+essential+FtsZ+membrane+tether+and+contributes+to+the+septal+localization+of+SepJ+in+the+filamentous+cyanobacterium+Anabaena.">ZipN is an essential FtsZ membrane tether and contributes to the septal localization of SepJ in the filamentous cyanobacterium Anabaena.</a> Scientific Reports. 9 (1), 1-15 (2019).</li><li>Thiel, T., Peter Wolk, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conjugal+Transfer+of+Plasmids+to+Cyanobacteria.">Conjugal Transfer of Plasmids to Cyanobacteria.</a> Methods in Enzymology. 153 (C), 232-243 (1987).</li><li>Moffitt, J. R., Lee, J. B., Cluzel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+single-cell+chemostat:+An+agarose-based,+microfluidic+device+for+high-throughput,+single-cell+studies+of+bacteria+and+bacterial+communities.">The single-cell chemostat: An agarose-based, microfluidic device for high-throughput, single-cell studies of bacteria and bacterial communities.</a> Lab on a Chip. 12 (8), 1487-1494 (2012).</li></ol>

Studien av dynamikken til divisomproteiner er uten tvil en utfordring. Spesielt i trådformede cyanobakterier er en utfordring visualiseringen Z-ringen i horisontalplanet, for hvilken cellene må være vertikalt orientert. Metoden vi beskrev her tillater posisjonering av Z-ringen i XY-planet for å utføre de forskjellige analysene. Dette er den første enkle metoden for trådformede cyanobakterier som muliggjør fullstendig visualisering av Z-ringen. 
Selv om denne protokollen er enkel og ras...

Bakteriell celledeling er prosessen der en morcelle genererer to datterceller, i de fleste tilfeller av mekanismen kjent som binær fisjon. En av de tidligste hendelsene i septasjonsprosessen er lokaliseringen av FtsZ i midten av cellen1. Dette proteinet, som er strukturelt homologt med tubulin2, er konservert og bredt fordelt i de fleste bakterier, og polymerisasjonen genererer en kontraktil struktur kjent som Z-ring3. Denne ringen fungerer som et stillas for andre delingsproteiner, og sammen danner de et molekylært maskineri kalt et divisom. Flere studier har vist at Z-ringen er svært dynamisk og at FtsZ-protofilamenter beveger seg ved tredemølle 4,5,6. For å studere Z-ringen i time-lapse-eksperimenter, anbefales det å registrere divisjonsstedet i XY-planet for bedre oppløsning og rask prøvetaking. For å oppnå dette er det nødvendig å utvikle vertikale celleimmobiliseringsmetoder som vanligvis inkluderer nanofabrikasjon av mikrohullcellefeller og komplekse mikrofluidiske enheter7.
Cyanobakterier er fotosyntetiske mikroorganismer som er klassifisert som gram-negative ved deres cellulære morfologi. Imidlertid er de fylogenetisk nærmere gram-positive bakterier8. Disse organismene har celledelingsgener som er vanlige i gram-positive og gram-negative bakterier, men deres divisome inneholder også unike elementer9. Anabaena sp. PCC 7120 (heretter Anabaena sp.) er trådformede cyanobakterier med ett divisjonsplan og er en modell for studier av celledeling i flercellede cyanobakterier. I denne stammen har det vært mulig å bestemme plasseringen av FtsZ i midten av cellene10. Likevel er det ingen studier som viser in vivo-dynamikken til FtsZ i denne modellen. I vårt laboratorium, gjennom triparental parring og homolog rekombinasjon, oppnådde vi en helt segregert mutant av Anabaena sp. som uttrykker FtsZ-proteinet fusjonert til sfGFP, som erstattet det komplette endogene ftsZ-genet. Vi utviklet en rask og enkel celleimmobiliseringsmetode som favoriserer den vertikale orienteringen av mutantstammefilamentene for time-lapse-eksperimenter for å visualisere delingsproteinene i filamentøse cyanobakterier. Denne metoden trenger ikke mikrofluidiske enheter som kan være dyre og vanskelige å utvikle. Som et eksempel brukte vi denne protokollen til å visualisere Z-ringen i FtsZ-sfGFP-mutanten ved konfokalmikroskopi.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 ml syringe</td>
			<td>Qingdao Agna Medical Technology Co., Ltd.</td>
			<td>-</td>
			<td>The disposable medical plastic syringe with 1 ml needle generally used to pump liquid or injection liquid, in this experiment it is used to suck the sample and make it polymerize.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Attofluor Cell Chamber</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>A7816</td>
			<td>The Attofluor Cell Camera is a durable and practical coverslip holder designed for viewing live cell samples in upright or inverted microscopes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axygen MaxyGene II Thermal Cycler with 96 well block</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>THERM-1001</td>
			<td>The new MaxyGene II Thermal Cycler increased speed and advanced features, providing the premium performance you have come to expect from Axygen brand products. Unique flexible programming. Rapid run times. Improved workflow over traditional gradient cyclers. Ramping rates up to 5&#176;C/sec. Adjustable heated lid accommodates strips, tubes and microplates.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Cover Glasses: Circles</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>12-546-2P</td>
			<td>Made of finest optical borosilicate glass, with uniform thickness and size. Circular shape. Corrosion-resistant.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Melting Point agarose</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V3841</td>
			<td>Agarose, Low Melting Point, Analytical Grade, is ideal for applications that require recovery of intact DNA fragments after gel electrophoresis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM 880 microscope from Zeiss Airyscan</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>-</td>
			<td>The Zeiss Airyscan LSM 880 microscope is a laser scanning focal microscope that can acquire images under the resolution limit (lateral resolution ~ 120nm and axial resolution ~ 350nm). The detectors are highly sensitive making it possible to acquire super-resolution images at high speed.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentr&#237;fuga Fresco 17</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>75002402</td>
			<td>Speed up routine sample preparation processes up to 17,000 &#215; g with our standard microcentrifuge, available with refrigeration. These microcentrifuges offer productivity, versatility, safety and convenience in an easy-to-use, compact design laboratory instrument.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Timelapse Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>-</td>
			<td>The Nikon C2 laser scanning confocal microscope is an ideal microscope for long-term timelapse, because thanks to its incubation chamber it is possible to keep samples in optimal conditions for more than 8 hours.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thin razor blades Schick Super Chromium</td>
			<td>Farmazon</td>
			<td>SKU: 401146</td>
			<td>&#160;The thin razor blades is used to cut the agarose matrix, allowing us to obtain the disks with the sample while maintaining the integrity of the matrix.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

vertical immobilization method for time-lapse microscopy analysis in filamentous cyanobacteria

En hovedhendelse i bakteriell celledeling er septasjonsprosessen, hvor proteinet FtsZ er nøkkelelementet. FtsZ polymeriserer og danner en ringlignende struktur (Z-ring) i midten av cellen som tjener som et stillas for andre delingsproteiner. Superoppløsningsmikroskopi i bakteriemodeller Escherichia coli og Bacillus subtilis viste at Z-ringen er diskontinuerlig, mens levende cellebildestudier viste at FtsZ beveger seg langs ringen ved en mekanisme kjent som tredemølle. For å studere dynamikken til FtsZ in vivo, er en spesiell celleplassering i vertikal stilling nødvendig for avbildning av ringens komplette struktur i XY-planet. Når det gjelder FtsZ-avbildning i flercellede cyanobakterier, som Anabaena sp. PCC7120, er det utfordrende å opprettholde filamentene i vertikal stilling på grunn av størrelsen på cellene og filamentens lengde. I denne artikkelen beskriver vi en metode som tillater vertikal immobilisering av Anabaena sp. PCC 7120-filamenter ved bruk av agarose og sprøyter med lavt smeltepunkt, for å registrere Z-ringen i en mutant som uttrykker et FtsZ-sfGFP-fusjonsprotein. Denne metoden er en rask og billig måte å registrere proteindynamikk på divisjonsstedet ved hjelp av konfokalmikroskopi.

Visualisering av Z-ringen i Anabaena sp. ved bruk av den vertikale immobiliseringsmetoden For å studere dynamikken til Z-ringkomponenter i bakterier, er det nødvendig å skaffe bilder i vertikalt orienterte celler. I denne posisjonen er det mulig å visualisere Z-ringen og hovedproteinene i divisomet for å overvåke proteindynamikken ved time-lapse-mikroskopi. Det klassiske prøvepreparatet for bakterier virker ikke for filamentøse cyanobakterier. Når det gjelder Anabaena sp., e...

Watch this Scientific Journal Video about Vertical Immobilization Method for Time-Lapse Microscopy Analysis in Filamentous Cyanobacteria at JoVE.com

Vertical Immobilization Method for Time-Lapse Microscopy Analysis in Filamentous Cyanobacteria

Vi presenterer en enkel og tilgjengelig metode for trådformet cyanobakteriell visualisering i XY-planet. En agarosematrise med lavt smeltepunkt ble brukt, noe som muliggjorde oppkjøp av bilder av proteiner involvert i divisjonen, i vertikal orientering. Derfor kan denne metoden brukes på enhver filamentøs organisme og forskjellige typer proteiner.

Vertikal immobiliseringsmetode for time-lapse-mikroskopianalyse i trådformede cyanobakterier

A main event in bacterial cell division is the septation process, where the protein FtsZ is the key element. FtsZ polymerizes forming a ring-like ...

I bakterier krever studien av dynamikken til celledelingsproteiner en romlig orientering av cellene. For eksempel, når det gjelder Z-ringen, hovedkomponenten i bakteriell celledeling, er en vertikal orientering grunnleggende for å registrere hele strukturen i XY-planet. I denne videoen utvikler vi en metode for å oppnå denne spesielle orienteringen i de trådformede cyanobakteriene Anabaena.Anabaena er en flercellet fotosyntetisk organisme, og deler med andre bakterier evnen til å bruke atmosfærisk dinitrogen som nitrogenkilde. I fravær av dette elementet skiller Anabaena celler spesialisert på nitrogenfiksering. Derfor gir den en utmerket modell for å analysere forholdet mellom cellulær deling og multicellularitet.Velg først en divisomkomponent som er tilstede i målfilamentøs cyanobakteriestamme. For forsøket er det nødvendig å konstruere en filamentøs cyanobakteriell mutant som uttrykker den valgte divisomkomponenten fusjonert til et fluorescerende protein. I denne protokollen bruker vi en Anabaena mutant som uttrykker FtsZ smeltet til GFP som et eksempel.Først lager du en ny subkultur av mutanten med 10 ml av en kultur i stasjonær fase og 90 ml flytende medium. Deretter vokser den nye cellekulturen i konstant lys og ved optimal temperatur, til den når eksponentiell fase. I vårt eksempel ble mutanten dyrket ved 25 Celsius grader i syv dager.Ta nå to milliliter av vekstkulturen og legg den i et sentrifugerør. Sentrifuge ved 2.500 x g i 10 minutter ved romtemperatur. Etter sentrifugeringen, kontroller at alle cellene er på bunnen av røret.Vær forsiktig når du håndterer prøvene for å unngå ny suspensjon. Varm den 3% lavsmeltepunkt agaroseoppløsningen i en mikrobølgeovn. Det er viktig å gjøre dette i korte tidsintervaller, og kontroller løsningen til den er helt flytende.Når den er smeltet, sett til side for å kjøle seg ned. Ta sentrifugerørene fra forrige trinn, kast 1,9 ml av supernatanten, og resuspender cellene i gjenværende volum ved å pipettere minst tre ganger opp og ned. På arbeidsplassen din, legg røret med cellene, den smeltede agaroseoppløsningen, en en-milliliter sprøyte kuttet i spissen og en skalpell med et nytt og rent blad.Bland deretter cellene med 900 mikroliter av 3% agaroseoppløsningen ved å pipettere minst tre ganger. Det er veldig viktig å sørge for at agaroseoppløsningen ikke er for varm, men forblir flytende. Med dette unngår vi celleskader under denne prosessen.Det neste trinnet må gjøres raskt, og før agaroseoppløsningen gelifiseres. Sug opp agarosematrisen i en en-milliliter sprøyte, forsiktig. Det er viktig å unngå generering av bobler mens prøven suges opp.Deretter inkuberer prøven og setter sprøyten i horisontal stilling ved romtemperatur i to timer. Etter inkubasjonen, fjern forsiktig matrisen med cellene ved hjelp av stempelet i en ren og flat overflate. Bruk skalpellen til å kutte gelprøven i skiver så tynne som mulig, og opprettholde matrisens integritet.Legg deretter prøvene i den tilsvarende omslagsseddelen, side om side. Som vist i videoen, i dette trinnet, kan du bruke et tips for å hjelpe til med håndteringsprosessen av prøven. For time-lapse-eksperimenter anbefales det bruk av et cellekammer laget for mikroskopianalyse.I dette tilfellet bruker vi sirkulære deksler som passer i denne typen kamre, som du kan se i videoen. Til slutt, for å forhindre dehydrering av prøven, tilsett et ekstra volum smeltet 3% agaroseoppløsning inne i kammeret. Før avbildning, vent til agarose er helt gelifisert.Sett nå kammeret med cellene i mikroskopet for avbildning. Det anbefales å bruke et utstyr med temperatur- og fuktighetskontroll. Visualiser prøven i lyse felt med maksimal forstørrelse, og søk i et vertikalt orientert filament.Du kan finne delingsstedet av interesse med en innledende skanning ved hjelp av autofluorescenssignalet langs Z-planet. Med dette, bruk parametrene til din fluorescerende proteinmarkør for å visualisere signalet om proteinet ditt av interesse på delingsstedet. Nå kan du utføre time-lapse-eksperimenter i henhold til den biologiske modellen og proteinet av interesse.I dette tilfellet kan vi se hele strukturen til Z-ringen i FtsZ-GFP-mutanten, i XY-planet. Med vår metode var vi i stand til å registrere dynamikken til disse ringene på lang tid. Til slutt, med endringene i fluorescensintensitet, konkluderer vi med at denne strukturen er svært dynamisk i vår modell.Denne metoden er en rask og billig protokoll for å registrere proteindynamikken i divisjonsstedet ved hjelp av konfokalmikroskopi anvendt på komplekse morfologier som trådformede cyanobakterier, ved å bruke Anabaena som modell.

Research

JoVE Journal

Biology

Monitoring Actin Disassembly with Time-lapse Microscopy

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes.  The transparency of the 
embryos, the genetic ...

Quantitative Analysis of Random Migration of Cells Using Time-lapse Video Microscopy

Kvantitativ analyse av Random migrasjon av celler ved hjelp av Time-lapse video Mikroskopi

Cell migration is a dynamic process, which is important for embryonic development, tissue repair, immune system function, and tumor invasion 1, 2. During ...

Use of Time Lapse Microscopy to Visualize Anoxia-induced Suspended Animation in C. elegans Embryos

Use of Time Lapse Microscopy to Visualize Anoxia-induced Suspended Animation in C. elegans Embryos

Bruk av Time Lapse Mikroskopi å visualisere anoxia-indusert suspendert animasjon i<em&gt; C. elegans</em&gt; Embryoer

Caenorhabdits elegans has been used extensively in the study of stress resistance, which is facilitated by the transparency of the adult and embryo stages ...

Visualization of Craniofacial Development in the sox10: kaede Transgenic Zebrafish Line Using Time-lapse Confocal Microscopy

Visualisering av Kraniofacial Development i sox10: kaede Transgenic Sebrafisk linjen ved hjelp av Time-lapse konfokalmikroskopi

Vertebrate palatogenesis is a highly choreographed and complex developmental process, which involves migration of cranial neural crest (CNC) cells, ...

Time-Lapse Video Microscopy for Assessment of EYFP-Parkin Aggregation as a Marker for Cellular Mitophagy

Time-Lapse Video Mikros for Vurdering av EYFP-Parkin Aggregation som en markør for Cellular Mitophagy

Time-lapse video microscopy can be defined as the real time imaging of living cells. This technique relies on the collection of images at different time ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

Høy oppløsning Time-lapse Imaging og automatisk analyse av mikrotubulidynamikk i levende menneske navleveneendotel Cells

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

A Versatile Method for Mounting Arabidopsis Leaves for Intravital Time-lapse Imaging

A Versatile Method for Mounting Arabidopsis Leaves for Intravital Time-lapse Imaging

En allsidig metode for montering Arabidopsis forlater Intravital tidsinnstilt bildebehandling

The plant immune response associated with a genome-wide transcriptional reprogramming is initiated at the site of infection. Thus, the immune response is ...

Specific Labeling of Mitochondrial Nucleoids for Time-lapse Structured Illumination Microscopy

Spesifikk merking av mitokondrienukleoider for tidsforløp strukturert belysningsmikroskopi

Mitochondrial nucleoids are compact particles formed by mitochondrial DNA molecules coated with proteins. Mitochondrial DNA encodes tRNAs, rRNAs, and ...