Name: vertical immobilization method for time-lapse microscopy analysis in filamentous cyanobacteria
Uploaded: 2023-09-25T14:30:00
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Agradecemos às bolsas nacionais de doutorado (ANID 21211333; 21191389) pelo financiamento. Grant Fondecyt 1161232.
Este trabalho foi apoiado pelo Advanced Microscopy Facility UMA UC.

1. Considerações e seleção do modelo celular
NOTA: As cianobactérias têm uma forte autofluorescência devido à presença de pigmentos fotossintéticos. Este sinal está na parte vermelha do espectro, portanto, as proteínas fluorescentes adequadas para imageamento em cianobactérias são as que estão longe da emissão vermelha. Por exemplo, GFP, YFP, Vênus, Turquesa e BFP.
<ol><li>Selecione um componente divisômico presente na cepa de cianobactéria filamentosa alv...

<ol>
	<li>L&#246;we, J., Amos, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+the+bacterial+cell-division+protein+FtsZ.">Crystal structure of the bacterial cell-division protein FtsZ.</a> Nature. 391 (6663), 203-206 (1998).</li><li>Erickson, H. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Movement+dynamics+of+divisome+proteins+and+PBP2x:FtsW+in+cells+of+Streptococcus+pneumoniae.">Movement dynamics of divisome proteins and PBP2x:FtsW in cells of Streptococcus pneumoniae.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (8), 3211-3220 (2019).</li><li>Bisson-Filho, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treadmilling+by+FtsZ+filaments+drives+peptidoglycan+synthesis+and+bacterial+cell+division.">Treadmilling by FtsZ filaments drives peptidoglycan synthesis and bacterial cell division.</a> Science. 355 (6326), 739-743 (2017).</li><li>Yang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GTPase+activity-coupled+treadmilling+of+the+bacterial+tubulin+FtsZ+organizes+septal+cell+wall+synthesis.">GTPase activity-coupled treadmilling of the bacterial tubulin FtsZ organizes septal cell wall synthesis.</a> Science. 355 (6326), 744-747 (2017).</li><li>Whitley, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FtsZ+treadmilling+is+essential+for+Z-ring+condensation+and+septal+constriction+initiation+in+Bacillus+subtilis+cell+division.">FtsZ treadmilling is essential for Z-ring condensation and septal constriction initiation in Bacillus subtilis cell division.</a> Nature Communications. 12 (1), (2021).</li><li>Maz&#243;n, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LexA-binding+sequences+in+Gram-positive+and+cyanobacteria+are+closely+related.">LexA-binding sequences in Gram-positive and cyanobacteria are closely related.</a> Molecular Genetics and Genomics. 271 (1), 40-49 (2004).</li><li>Mandakovic, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CyDiv,+a+conserved+and+novel+filamentous+cyanobacterial+cell+division+protein+involved+in+septum+localization.">CyDiv, a conserved and novel filamentous cyanobacterial cell division protein involved in septum localization.</a> Frontiers in Microbiology. 7 (FEB), 1-11 (2016).</li><li>Camargo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ZipN+is+an+essential+FtsZ+membrane+tether+and+contributes+to+the+septal+localization+of+SepJ+in+the+filamentous+cyanobacterium+Anabaena.">ZipN is an essential FtsZ membrane tether and contributes to the septal localization of SepJ in the filamentous cyanobacterium Anabaena.</a> Scientific Reports. 9 (1), 1-15 (2019).</li><li>Thiel, T., Peter Wolk, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conjugal+Transfer+of+Plasmids+to+Cyanobacteria.">Conjugal Transfer of Plasmids to Cyanobacteria.</a> Methods in Enzymology. 153 (C), 232-243 (1987).</li><li>Moffitt, J. R., Lee, J. B., Cluzel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+single-cell+chemostat:+An+agarose-based,+microfluidic+device+for+high-throughput,+single-cell+studies+of+bacteria+and+bacterial+communities.">The single-cell chemostat: An agarose-based, microfluidic device for high-throughput, single-cell studies of bacteria and bacterial communities.</a> Lab on a Chip. 12 (8), 1487-1494 (2012).</li></ol>

O estudo da dinâmica das proteínas divisômicas é, sem dúvida, um desafio. Particularmente, nas cianobactérias filamentosas, um dos desafios é a visualização do anel Z no plano horizontal, para o qual as células devem ser orientadas verticalmente. O método aqui descrito permite o posicionamento do anel Z no plano XY para realizar as diferentes análises. Este é o primeiro método simples para cianobactérias filamentosas que permite a visualização completa do anel Z. 
Embora este ...

A divisão celular bacteriana é o processo no qual uma célula-mãe gera duas células-filhas, na maioria dos casos pelo mecanismo conhecido como fissão binária. Um dos eventos mais precoces no processo de septação é a localização de FtsZ no meio da célula1. Essa proteína, estruturalmente homóloga à tubulina2, é conservada e amplamente distribuída na maioria das bactérias, e sua polimerização gera uma estrutura contrátil conhecida como anel Z3. Este anel serve como um andaime para outras proteínas de divisão e juntos eles formam uma maquinaria molecular chamada divisome. Vários estudos têm demonstrado que o anel Z é altamente dinâmico e que os protofilamentos FtsZ se movem por esteira 4,5,6. Para estudar o anel Z em experimentos de lapso de tempo, é aconselhável registrar o local de divisão no plano XY para melhor resolução e amostragem rápida. Para isso, é necessário desenvolver métodos de imobilização celular vertical que comumente incluam a nanofabricação de armadilhas celulares de microfuros e dispositivos microfluídicos complexos7.
Cianobactérias são microrganismos fotossintéticos classificados como gram-negativos por sua morfologia celular. Entretanto, filogeneticamente estão mais próximas de bactériasgram-positivas8. Esses organismos possuem genes de divisão celular que são comuns dentro de bactérias gram-positivas e gram-negativas, mas seu divisômio também contém elementos únicos9. PCC 7120 (doravante Anabaena sp.) é cianobactéria filamentosa com um plano de divisão e é um modelo para o estudo da divisão celular em cianobactérias multicelulares. Nessa linhagem, foi possível determinar o posicionamento da FtsZ no meio das células10. No entanto, não há estudos mostrando a dinâmica in vivo da FtsZ neste modelo. Em nosso laboratório, através de acasalamento triparental e recombinação homóloga, obtivemos um mutante totalmente segregado de Anabaena sp., que expressa a proteína FtsZ fusionada à sfGFP, que substituiu o gene ftsZ endógeno completo. Desenvolvemos um método rápido e simples de imobilização celular que favorece a orientação vertical dos filamentos de deformação mutantes para experimentos de time-lapse para visualizar a divisão de proteínas em cianobactérias filamentosas. Este método não necessita de dispositivos microfluídicos que podem ser caros e difíceis de desenvolver. Como exemplo, usamos este protocolo para visualizar o anel Z no mutante FtsZ-sfGFP por microscopia confocal.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 ml syringe</td>
			<td>Qingdao Agna Medical Technology Co., Ltd.</td>
			<td>-</td>
			<td>The disposable medical plastic syringe with 1 ml needle generally used to pump liquid or injection liquid, in this experiment it is used to suck the sample and make it polymerize.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Attofluor Cell Chamber</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>A7816</td>
			<td>The Attofluor Cell Camera is a durable and practical coverslip holder designed for viewing live cell samples in upright or inverted microscopes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axygen MaxyGene II Thermal Cycler with 96 well block</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>THERM-1001</td>
			<td>The new MaxyGene II Thermal Cycler increased speed and advanced features, providing the premium performance you have come to expect from Axygen brand products. Unique flexible programming. Rapid run times. Improved workflow over traditional gradient cyclers. Ramping rates up to 5&#176;C/sec. Adjustable heated lid accommodates strips, tubes and microplates.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Cover Glasses: Circles</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>12-546-2P</td>
			<td>Made of finest optical borosilicate glass, with uniform thickness and size. Circular shape. Corrosion-resistant.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Melting Point agarose</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V3841</td>
			<td>Agarose, Low Melting Point, Analytical Grade, is ideal for applications that require recovery of intact DNA fragments after gel electrophoresis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM 880 microscope from Zeiss Airyscan</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>-</td>
			<td>The Zeiss Airyscan LSM 880 microscope is a laser scanning focal microscope that can acquire images under the resolution limit (lateral resolution ~ 120nm and axial resolution ~ 350nm). The detectors are highly sensitive making it possible to acquire super-resolution images at high speed.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentr&#237;fuga Fresco 17</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>75002402</td>
			<td>Speed up routine sample preparation processes up to 17,000 &#215; g with our standard microcentrifuge, available with refrigeration. These microcentrifuges offer productivity, versatility, safety and convenience in an easy-to-use, compact design laboratory instrument.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Timelapse Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>-</td>
			<td>The Nikon C2 laser scanning confocal microscope is an ideal microscope for long-term timelapse, because thanks to its incubation chamber it is possible to keep samples in optimal conditions for more than 8 hours.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thin razor blades Schick Super Chromium</td>
			<td>Farmazon</td>
			<td>SKU: 401146</td>
			<td>&#160;The thin razor blades is used to cut the agarose matrix, allowing us to obtain the disks with the sample while maintaining the integrity of the matrix.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

vertical immobilization method for time-lapse microscopy analysis in filamentous cyanobacteria

Um evento principal na divisão celular bacteriana é o processo de septação, onde a proteína FtsZ é o elemento chave. O FtsZ polimeriza-se formando uma estrutura semelhante a um anel (anel Z) no meio da célula que serve de arcabouço para outras proteínas de divisão. A microscopia de super-resolução em modelos bacterianos de Escherichia coli e Bacillus subtilis mostrou que o anel Z é descontínuo, enquanto estudos de imagem de células vivas demonstraram que o FtsZ se move ao longo do anel por um mecanismo conhecido como esteira. Para estudar a dinâmica da FtsZ in vivo, uma colocação especial de células em posição vertical é necessária para obter imagens da estrutura completa do anel no plano XY. No caso da imagem por FtsZ em cianobactérias multicelulares, como Anabaena sp.PCC7120, manter os filamentos em posição vertical é um desafio devido ao tamanho das células e ao comprimento dos filamentos. Neste artigo, descrevemos um método que permite a imobilização vertical de filamentos de Anabaena sp., PCC 7120, usando agarose de baixo ponto de fusão e seringas, para registrar o anel Z em um mutante que expressa uma proteína de fusão FtsZ-sfGFP. Este método é uma maneira rápida e barata de registrar a dinâmica de proteínas no local de divisão usando microscopia confocal.

Visualização do anel Z em Anabaena sp., pelo método de imobilização vertical Para estudar a dinâmica dos componentes do anel Z em bactérias, é necessário adquirir imagens em células orientadas verticalmente. Nesta posição, é possível visualizar o anel Z e as principais proteínas do divisômio para monitorar a dinâmica proteica por microscopia de lapso de tempo. A preparação clássica de amostras para bactérias não funciona para cianobactérias filamentosas. No caso de ...

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Vertical Immobilization Method for Time-Lapse Microscopy Analysis in Filamentous Cyanobacteria

Apresentamos um método simples e acessível para visualização de cianobactérias filamentosas no plano XY. Foi utilizada uma matriz de agarose de baixo ponto de fusão, permitindo a aquisição de imagens das proteínas envolvidas na divisão, na orientação vertical. Portanto, esta metodologia pode ser aplicada a qualquer organismo filamentoso e diferentes tipos de proteínas.

Método de imobilização vertical para análise de microscopia time-lapse em cianobactérias filamentosas

A main event in bacterial cell division is the septation process, where the protein FtsZ is the key element. FtsZ polymerizes forming a ring-like ...

Em bactérias, o estudo da dinâmica de proteínas de divisão celular requer uma orientação espacial das células. Por exemplo, no caso do anel Z, o principal componente na divisão celular bacteriana, uma orientação vertical é fundamental para registrar toda a estrutura no plano XY. Neste vídeo, desenvolvemos um método para alcançar essa orientação particular na cianobactéria filamentosa Anabaena.Anabaena é um organismo fotossintético multicelular, e compartilhar com outras bactérias a capacidade de usar dinitrogênio atmosférico como fonte de nitrogênio. Na ausência deste elemento, Anabaena diferenciar células especializadas na fixação de nitrogênio. Portanto, fornece um excelente modelo para analisar a relação entre divisão celular e multicelularidade.Primeiro, selecione um componente divisômico presente na cepa de cianobactéria filamentosa alvo. Para o experimento, é necessário construir um mutante cianobacteriano filamentoso que expresse o componente divisômico selecionado fundido a uma proteína fluorescente. Neste protocolo, usamos um mutante Anabaena que expressa FtsZ fundido à GFP como exemplo.Primeiro, faça uma nova subcultura do mutante com 10 mililitros de uma cultura em fase estacionária e 90 mililitros de meio líquido. Em seguida, cultivar a nova cultura celular em luz constante e na temperatura ideal, até atingir a fase exponencial. Em nosso exemplo, o mutante foi cultivado a 25 graus Celsius por sete dias.Agora pegue dois mililitros da cultura de crescimento e coloque-a em um tubo de centrífuga. Centrifugar a 2, 500 x g durante 10 minutos à temperatura ambiente. Após a centrifugação, verifique se todas as células estão no fundo do tubo.Tenha cuidado ao manusear as amostras, para evitar a ressuspensão. Aqueça a solução de agarose de baixo ponto de fusão a 3% no micro-ondas. É importante fazer isso em curtos intervalos de tempo, e verificar a solução até ficar completamente líquida.Depois de derretido, reserve para esfriar. Pegue os tubos de centrífuga da etapa anterior, descarte 1,9 mililitros do sobrenadante e ressuspenda as células no volume restante pipetando pelo menos três vezes para cima e para baixo. No seu local de trabalho, coloque o tubo com as células, a solução de agarose derretida, uma seringa de um mililitro cortada na ponta e um bisturi com uma lâmina nova e limpa.Em seguida, misturar as células com 900 microlitros da solução de agarose a 3%, pipetando pelo menos três vezes. É realmente importante certificar-se de que a solução de agarose não é muito quente, mas permanece líquida. Com isso, estamos evitando danos celulares durante esse processo.O próximo passo deve ser feito rapidamente, e antes que a solução de agarose gelifique. Sugue a matriz de agarose em uma seringa de um mililitro, cuidadosamente. É importante evitar a geração de bolhas enquanto a amostra está sendo sugada.Em seguida, incubar a amostra, colocando a seringa na posição horizontal à temperatura ambiente por duas horas. Após a incubação, remova cuidadosamente a matriz com as células usando o êmbolo em uma superfície limpa e plana. Com o bisturi, corte a amostra de gel em fatias o mais finas possível, mantendo a integridade da matriz.Em seguida, deposite as amostras na tampa correspondente, lado a lado. Como mostrado no vídeo, nesta etapa, você pode usar uma dica para auxiliar no processo de manuseio da amostra. Para experimentos de lapso de tempo, recomenda-se o uso de uma câmara celular feita para análise de microscopia.Neste caso, utilizamos tampas circulares que se encaixam neste tipo de câmaras, como pode ver no vídeo. Finalmente, para evitar a desidratação da amostra, adicione um volume extra de solução de agarose 3% derretida dentro da câmara. Antes de fazer exames de imagem, aguarde até que a agarose esteja completamente gelificada.Agora coloque a câmara com as células no microscópio para geração de imagens. É recomendável utilizar um equipamento com controle de temperatura e umidade. Visualize a amostra em campo brilhante com ampliação máxima e procure um filamento orientado verticalmente.Você pode encontrar o local de divisão de interesse com uma varredura inicial usando o sinal de autofluorescência ao longo do plano Z. Com isso, use os parâmetros do seu marcador de proteína fluorescente para visualizar o sinal da sua proteína de interesse no local de divisão. Agora você pode realizar experimentos de lapso de tempo de acordo com o modelo biológico e a proteína de interesse.Neste caso, podemos ver toda a estrutura do anel Z no mutante FtsZ-GFP, no plano XY. Com nosso método, conseguimos registrar a dinâmica desses anéis em um longo período de tempo. Finalmente, com as mudanças na intensidade da fluorescência, concluímos que esta estrutura é altamente dinâmica em nosso modelo.Este método é um protocolo rápido e de baixo custo para registrar a dinâmica de proteínas no sítio de divisão por meio de microscopia confocal aplicada a morfologias complexas como cianobactérias filamentosas, usando Anabaena como modelo.

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