Name: vertical immobilization method for time-lapse microscopy analysis in filamentous cyanobacteria
Uploaded: 2023-09-25T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Vertical Immobilization Method for Time-Lapse Microscopy Analysis in Filamentous Cyanobacteria at JoVE.com

Vi är tacksamma för nationella doktorandstipendier (ANID 21211333; 21191389) för finansieringen. Grant Fondecyt 1161232.
Detta arbete stöddes av de Advanced Microscopy Facility UMA UC.

1. Överväganden och val av mobilmodell
OBS: Cyanobakterier har en stark autofluorescens på grund av närvaron av fotosyntetiska pigment. Denna signal är i den röda delen av spektrumet, därför är de fluorescerande proteinerna som är lämpliga för avbildning i cyanobakterier de som långt ifrån den röda emissionen. Till exempel GFP, YFP, Venus, Turquoise och BFP.
<ol><li>Välj en divisomkomponent som finns i målfilamentös cyanobakteriestam. För experimenten är ...

<ol>
	<li>L&#246;we, J., Amos, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+the+bacterial+cell-division+protein+FtsZ.">Crystal structure of the bacterial cell-division protein FtsZ.</a> Nature. 391 (6663), 203-206 (1998).</li><li>Erickson, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FtsZ,+a+prokaryotic+homolog+of+tubulin.">FtsZ, a prokaryotic homolog of tubulin.</a> Cell. 80 (3), 367-370 (1995).</li><li>Huang, K., Mychack, A., Tchorzewski, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+FtsZ+C-terminal+variable+(+CTV+)+region+in+Z-ring+assembly+and+interaction+with+the+Z-ring+stabilizer+ZapD+in+E.">Characterization of the FtsZ C-terminal variable ( CTV ) region in Z-ring assembly and interaction with the Z-ring stabilizer ZapD in E.</a> coli cytokinesis. , 1-24 (2016).</li><li>Perez, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Movement+dynamics+of+divisome+proteins+and+PBP2x:FtsW+in+cells+of+Streptococcus+pneumoniae.">Movement dynamics of divisome proteins and PBP2x:FtsW in cells of Streptococcus pneumoniae.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (8), 3211-3220 (2019).</li><li>Bisson-Filho, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treadmilling+by+FtsZ+filaments+drives+peptidoglycan+synthesis+and+bacterial+cell+division.">Treadmilling by FtsZ filaments drives peptidoglycan synthesis and bacterial cell division.</a> Science. 355 (6326), 739-743 (2017).</li><li>Yang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GTPase+activity-coupled+treadmilling+of+the+bacterial+tubulin+FtsZ+organizes+septal+cell+wall+synthesis.">GTPase activity-coupled treadmilling of the bacterial tubulin FtsZ organizes septal cell wall synthesis.</a> Science. 355 (6326), 744-747 (2017).</li><li>Whitley, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FtsZ+treadmilling+is+essential+for+Z-ring+condensation+and+septal+constriction+initiation+in+Bacillus+subtilis+cell+division.">FtsZ treadmilling is essential for Z-ring condensation and septal constriction initiation in Bacillus subtilis cell division.</a> Nature Communications. 12 (1), (2021).</li><li>Maz&#243;n, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LexA-binding+sequences+in+Gram-positive+and+cyanobacteria+are+closely+related.">LexA-binding sequences in Gram-positive and cyanobacteria are closely related.</a> Molecular Genetics and Genomics. 271 (1), 40-49 (2004).</li><li>Mandakovic, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CyDiv,+a+conserved+and+novel+filamentous+cyanobacterial+cell+division+protein+involved+in+septum+localization.">CyDiv, a conserved and novel filamentous cyanobacterial cell division protein involved in septum localization.</a> Frontiers in Microbiology. 7 (FEB), 1-11 (2016).</li><li>Camargo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ZipN+is+an+essential+FtsZ+membrane+tether+and+contributes+to+the+septal+localization+of+SepJ+in+the+filamentous+cyanobacterium+Anabaena.">ZipN is an essential FtsZ membrane tether and contributes to the septal localization of SepJ in the filamentous cyanobacterium Anabaena.</a> Scientific Reports. 9 (1), 1-15 (2019).</li><li>Thiel, T., Peter Wolk, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conjugal+Transfer+of+Plasmids+to+Cyanobacteria.">Conjugal Transfer of Plasmids to Cyanobacteria.</a> Methods in Enzymology. 153 (C), 232-243 (1987).</li><li>Moffitt, J. R., Lee, J. B., Cluzel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+single-cell+chemostat:+An+agarose-based,+microfluidic+device+for+high-throughput,+single-cell+studies+of+bacteria+and+bacterial+communities.">The single-cell chemostat: An agarose-based, microfluidic device for high-throughput, single-cell studies of bacteria and bacterial communities.</a> Lab on a Chip. 12 (8), 1487-1494 (2012).</li></ol>

Studiet av dynamiken hos divisomproteiner är utan tvekan en utmaning. Särskilt i filamentösa cyanobakterier är en av utmaningarna visualiseringen av Z-ringen i horisontalplanet, för vilken cellerna måste vara vertikalt orienterade. Metoden vi beskrev här gör det möjligt att placera Z-ringen i XY-planet för att utföra de olika analyserna. Detta är den första enkla metoden för filamentösa cyanobakterier som möjliggör fullständig visualisering av Z-ringen. 
Även om detta protok...

Bakteriell celldelning är den process där en modercell genererar två dotterceller, i de flesta fall genom mekanismen som kallas binär fission. En av de tidigaste händelserna i septationsprocessen är lokaliseringen av FtsZ i mitten av cell1. Detta protein, som är strukturellt homologt med tubulin2, bevaras och distribueras i stor utsträckning i de flesta bakterier, och dess polymerisation genererar en kontraktil struktur som kallas Z-ring3. Denna ring fungerar som en byggnadsställning för andra delningsproteiner och tillsammans bildar de ett molekylärt maskineri som kallas en divisome. Flera studier har visat att Z-ringen är mycket dynamisk och att FtsZ-protofilament rör sig genomatt löpa 4,5,6. För att studera Z-ringen i time-lapse-experiment är det lämpligt att registrera delningsstället i XY-planet för bättre upplösning och snabb provtagning. För att uppnå detta är det nödvändigt att utveckla vertikala cellimmobiliseringsmetoder som vanligtvis inkluderar nanofabrikation av mikrohålscellfällor och komplexa mikrofluidiska anordningar7.
Cyanobakterier är fotosyntetiska mikroorganismer som klassificeras som gramnegativa av deras cellulära morfologi. Men fylogenetiskt är de närmare grampositiva bakterier8. Dessa organismer har celldelningsgener som är vanliga inom grampositiva och gramnegativa bakterier, men deras divisome innehåller också unika element9. PCC 7120 (nedan kallad Anabaena sp.) är filamentösa cyanobakterier med ett delningsplan och är en modell för studier av celldelning i flercelliga cyanobakterier. I denna stam har det varit möjligt att bestämma placeringen av FtsZ i mitten av cellerna10. Ändå finns det inga studier som visar in vivo-dynamiken hos FtsZ i denna modell. I vårt laboratorium, genom triparental parning och homolog rekombination, erhöll vi en helt segregerad mutant av Anabaena sp. som uttrycker FtsZ-proteinet smält till sfGFP, som ersatte den fullständiga endogena ftsZ-genen . Vi utvecklade en snabb och enkel cellimmobiliseringsmetod som gynnar den vertikala orienteringen av de muterade töjningsfilamenten för time-lapse-experiment för att visualisera delningsproteinerna i filamentösa cyanobakterier. Denna metod behöver inte mikrofluidiska enheter som kan vara dyra och svåra att utveckla. Som ett exempel använde vi detta protokoll för att visualisera Z-ringen i FtsZ-sfGFP-mutanten genom konfokalmikroskopi.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 ml syringe</td>
			<td>Qingdao Agna Medical Technology Co., Ltd.</td>
			<td>-</td>
			<td>The disposable medical plastic syringe with 1 ml needle generally used to pump liquid or injection liquid, in this experiment it is used to suck the sample and make it polymerize.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Attofluor Cell Chamber</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>A7816</td>
			<td>The Attofluor Cell Camera is a durable and practical coverslip holder designed for viewing live cell samples in upright or inverted microscopes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axygen MaxyGene II Thermal Cycler with 96 well block</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>THERM-1001</td>
			<td>The new MaxyGene II Thermal Cycler increased speed and advanced features, providing the premium performance you have come to expect from Axygen brand products. Unique flexible programming. Rapid run times. Improved workflow over traditional gradient cyclers. Ramping rates up to 5&#176;C/sec. Adjustable heated lid accommodates strips, tubes and microplates.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Cover Glasses: Circles</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>12-546-2P</td>
			<td>Made of finest optical borosilicate glass, with uniform thickness and size. Circular shape. Corrosion-resistant.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Melting Point agarose</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V3841</td>
			<td>Agarose, Low Melting Point, Analytical Grade, is ideal for applications that require recovery of intact DNA fragments after gel electrophoresis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM 880 microscope from Zeiss Airyscan</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>-</td>
			<td>The Zeiss Airyscan LSM 880 microscope is a laser scanning focal microscope that can acquire images under the resolution limit (lateral resolution ~ 120nm and axial resolution ~ 350nm). The detectors are highly sensitive making it possible to acquire super-resolution images at high speed.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentr&#237;fuga Fresco 17</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>75002402</td>
			<td>Speed up routine sample preparation processes up to 17,000 &#215; g with our standard microcentrifuge, available with refrigeration. These microcentrifuges offer productivity, versatility, safety and convenience in an easy-to-use, compact design laboratory instrument.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Timelapse Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>-</td>
			<td>The Nikon C2 laser scanning confocal microscope is an ideal microscope for long-term timelapse, because thanks to its incubation chamber it is possible to keep samples in optimal conditions for more than 8 hours.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thin razor blades Schick Super Chromium</td>
			<td>Farmazon</td>
			<td>SKU: 401146</td>
			<td>&#160;The thin razor blades is used to cut the agarose matrix, allowing us to obtain the disks with the sample while maintaining the integrity of the matrix.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

vertical immobilization method for time-lapse microscopy analysis in filamentous cyanobacteria

En viktig händelse i bakteriell celldelning är septationsprocessen, där proteinet FtsZ är nyckelelementet. FtsZ polymeriserar och bildar en ringliknande struktur (Z-ring) i mitten av cellen som fungerar som en ställning för andra delningsproteiner. Superupplösningsmikroskopi i bakteriemodellerna Escherichia coli och Bacillus subtilis visade att Z-ringen är diskontinuerlig, medan levande cellavbildningsstudier visade att FtsZ rör sig längs ringen genom en mekanism som kallas löpband. För att studera dynamiken hos FtsZ in vivo är en speciell cellplacering i vertikalt läge nödvändig för att avbilda ringens fullständiga struktur i XY-planet. När det gäller FtsZ-avbildning i flercelliga cyanobakterier, såsom Anabaena sp. PCC7120, är det utmanande att hålla filamenten i vertikalt läge på grund av cellernas storlek och filamentens längd. I den här artikeln beskriver vi en metod som möjliggör vertikal immobilisering av Anabaena sp. PCC 7120-filament med användning av agaros och sprutor med låg smältpunkt för att registrera Z-ringen i en mutant som uttrycker ett FtsZ-sfGFP-fusionsprotein. Denna metod är ett snabbt och billigt sätt att registrera proteindynamik på delningsstället med hjälp av konfokalmikroskopi.

Visualisering av Z-ringen i Anabaena sp. med hjälp av vertikal immobiliseringsmetod För att studera dynamiken hos Z-ringkomponenter i bakterier är det nödvändigt att förvärva bilder i vertikalt orienterade celler. I denna position är det möjligt att visualisera Z-ringen och huvudproteinerna i divisomen för att övervaka proteindynamiken genom time-lapse-mikroskopi. Den klassiska provberedningen för bakterier fungerar inte för filamentösa cyanobakterier. När det gäller Anaba...

Watch this Scientific Journal Video about Vertical Immobilization Method for Time-Lapse Microscopy Analysis in Filamentous Cyanobacteria at JoVE.com

Vertical Immobilization Method for Time-Lapse Microscopy Analysis in Filamentous Cyanobacteria

Vi presenterar en enkel och tillgänglig metod för filamentös cyanobakteriell visualisering i XY-planet. En agarosmatris med låg smältpunkt användes, vilket möjliggjorde förvärv av bilder av proteiner som är involverade i uppdelningen, i vertikal orientering. Därför kan denna metod tillämpas på alla filamentösa organismer och olika typer av proteiner.

Vertikal immobiliseringsmetod för time-lapse mikroskopianalys i filamentösa cyanobakterier

A main event in bacterial cell division is the septation process, where the protein FtsZ is the key element. FtsZ polymerizes forming a ring-like ...

I bakterier kräver studien av dynamiken hos celldelningsproteiner en rumslig orientering av cellerna. Till exempel, när det gäller Z-ringen, huvudkomponenten i bakteriell celldelning, är en vertikal orientering grundläggande för att registrera hela strukturen i XY-planet. I den här videon utvecklar vi en metod för att uppnå denna speciella orientering i de filamentösa cyanobakterierna Anabaena.Anabaena är en multicellulär fotosyntetisk organism och delar med andra bakterier förmågan att använda atmosfärisk dinitrogen som kvävekälla. I avsaknad av detta element differentierar Anabaena celler specialiserade på kvävefixering. Därför ger det en utmärkt modell för att analysera förhållandet mellan cellulär delning och multicellularitet.Välj först en divisomkomponent som finns i den trådlösa cyanobakteriestammen. För experimentet är det nödvändigt att konstruera en filamentös cyanobakteriell mutant som uttrycker den valda divisomkomponenten smält till ett fluorescerande protein. I detta protokoll använder vi en Anabaena-mutant som uttrycker FtsZ smält till GFP som ett exempel.Gör först en ny subkultur av mutanten med 10 ml av en kultur i stationär fas och 90 ml flytande medium. Odla sedan den nya cellkulturen i konstant ljus och vid optimal temperatur tills den når exponentiell fas. I vårt exempel odlades mutanten vid 25 grader Celsius i sju dagar.Ta nu två milliliter av tillväxtkulturen och lägg den i ett centrifugrör. Centrifugera vid 2 500 x g i 10 minuter vid rumstemperatur. Efter centrifugeringen, kontrollera att alla celler är på botten av röret.Var försiktig när du hanterar proverna för att undvika återsuspension. Värm agaroslösningen med 3% låg smältpunkt i en mikrovågsugn. Det är viktigt att göra detta i korta tidsintervall och kontrollera lösningen tills den är helt flytande.När det smälts, lägg åt sidan för att svalna. Ta centrifugrören i föregående steg, kassera 1,9 ml av supernatanten och suspendera cellerna igen i den återstående volymen genom pipettering minst tre gånger upp och ner. På din arbetsplats, sätt röret med cellerna, den smälta agaroslösningen, en milliliter spruta skuren i spetsen och en skalpell med ett nytt och rent blad.Blanda sedan cellerna med 900 mikroliter av 3%agaroslösningen genom pipettering minst tre gånger. Det är verkligen viktigt att se till att agaroslösningen inte är för varm, men förblir flytande. Med detta undviker vi cellskador under denna process.Nästa steg måste göras snabbt, och innan agaroslösningen gelifieras. Sug försiktigt upp agarosmatrisen i en en-milliliter spruta. Det är viktigt att undvika generering av bubblor medan provet sugs upp.Därefter inkubera provet och sätt sprutan i horisontellt läge vid rumstemperatur i två timmar. Efter inkubationen, avlägsna försiktigt matrisen med cellerna med kolven på en ren och plan yta. Skär gelprovet i skivor så tunna som möjligt med skalpellen, vilket bibehåller matrisens integritet.Lägg sedan proverna i motsvarande täckglas, sida vid sida. Som visas i videon kan du i det här steget använda ett tips för att hjälpa till med hanteringsprocessen för provet. För time-lapse-experiment rekommenderas användning av en cellkammare gjord för mikroskopianalys.I det här fallet använder vi cirkulära täckglas som passar in i denna typ av kamrar, som du kan se i videon. Slutligen, för att förhindra uttorkning av provet, tillsätt en extra volym smält 3%agaroslösning inuti kammaren. Innan du avlider, vänta tills agarosen är helt gelifierad.Lägg nu kammaren med cellerna i mikroskopet för avbildning. Det rekommenderas att använda en utrustning med temperatur- och luftfuktighetskontroll. Visualisera provet i ljust fält med maximal förstoring och sök i ett vertikalt orienterat filament.Du kan hitta divisionsplatsen av intresse med en första skanning med hjälp av autofluorescenssignalen längs Z-planet. Med detta, använd parametrarna för din fluorescerande proteinmarkör för att visualisera signalen från ditt protein av intresse på delningsstället. Nu kan du utföra time-lapse-experiment enligt den biologiska modellen och proteinet av intresse.I det här fallet kan vi se hela strukturen hos Z-ringen i FtsZ-GFP-mutanten, i XY-planet. Med vår metod kunde vi registrera dynamiken hos dessa ringar under en lång tidsperiod. Slutligen, med förändringarna i fluorescensintensitet, drar vi slutsatsen att denna struktur är mycket dynamisk i vår modell.Denna metod är ett snabbt och billigt protokoll för att registrera proteindynamiken i delningsstället med hjälp av konfokalmikroskopi applicerad på komplexa morfologier som filamentösa cyanobakterier, med Anabaena som modell.

Research

JoVE Journal

Biology

Monitoring Actin Disassembly with Time-lapse Microscopy

Övervakning Actin demontering med Time-lapse Mikroskopi

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Time-lapse avbildning av Mitos Efter siRNA Transfektion

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Time-lapse Mikroskopi av tidig embryogenesen i Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes.  The transparency of the 
embryos, the genetic ...

Quantitative Analysis of Random Migration of Cells Using Time-lapse Video Microscopy

Kvantitativ analys av Random migration av celler med Time-lapse video Mikroskopi

Cell migration is a dynamic process, which is important for embryonic development, tissue repair, immune system function, and tumor invasion 1, 2. During ...

Use of Time Lapse Microscopy to Visualize Anoxia-induced Suspended Animation in C. elegans Embryos

Use of Time Lapse Microscopy to Visualize Anoxia-induced Suspended Animation in C. elegans Embryos

Användning av Time Lapse mikroskopi för att visualisera Anoxia-inducerad skendöd i<em&gt; C. elegans</em&gt; Embryon

Caenorhabdits elegans has been used extensively in the study of stress resistance, which is facilitated by the transparency of the adult and embryo stages ...

Visualization of Craniofacial Development in the sox10: kaede Transgenic Zebrafish Line Using Time-lapse Confocal Microscopy

Visualisering av Kraniofaciala utveckling i sox10: Kaede Transgena Zebrafish Linje Använda Time-lapse konfokalmikroskopi

Vertebrate palatogenesis is a highly choreographed and complex developmental process, which involves migration of cranial neural crest (CNC) cells, ...

Time-Lapse Video Microscopy for Assessment of EYFP-Parkin Aggregation as a Marker for Cellular Mitophagy

Time-lapse video Mikroskopi för bedömning av EYFP-Parkin Aggregation som en markör för Cellular Mitophagy

Time-lapse video microscopy can be defined as the real time imaging of living cells. This technique relies on the collection of images at different time ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

Högupplöst time-lapse avbildning och automatiserad analys av mikrotubuli Dynamics i Living Human navelsträngsvenendotelceller

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

A Versatile Method for Mounting Arabidopsis Leaves for Intravital Time-lapse Imaging

A Versatile Method for Mounting Arabidopsis Leaves for Intravital Time-lapse Imaging

En mångsidig metod för montering av Arabidopsis lämnar för Intravital Time-lapse Imaging

The plant immune response associated with a genome-wide transcriptional reprogramming is initiated at the site of infection. Thus, the immune response is ...

Specific Labeling of Mitochondrial Nucleoids for Time-lapse Structured Illumination Microscopy

Specifik märkning av mitokondriella nukleoider för time-lapse strukturerad belysning mikroskopi

Mitochondrial nucleoids are compact particles formed by mitochondrial DNA molecules coated with proteins. Mitochondrial DNA encodes tRNAs, rRNAs, and ...