Name: Author Spotlight: Exploring Salidroside's Molecular Mechanisms in Breast Cancer Treatment
Uploaded: 2023-06-09T12:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Exploring Salidroside's Molecular Mechanisms in Breast Cancer Treatment at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי ועדת הבריאות של מחוז סצ'ואן (120025).

תאי MCF-7 ששימשו למחקר הנוכחי התקבלו ממקור מסחרי (ראו טבלת חומרים).
1. תרבית תאים
<ol><li>תרבית את תאי MCF-7 באטמוספירה לחה של 5% CO2 ב-37°C עם DMEM המכיל 10% FBS ו-1% פניצילין (10,000 U/mL)/סטרפטומיצין (10,000 מיקרוגרם/מ"ל) (ראו טבלת חומרים). הערה: התאים המכסים 90% מתחתית ?...

Salidroside's Mechanism in Suppressing MCF-7 Cell Migration and Proliferation

סרטן השד משפיע על אנשים בכל הגילאים וגורם לעומס פיזי ונפשי בל יתואר ולחץ כלכלי גדול1. סרטן השד, עם התחלואה והתמותה ההולכות וגדלות שלו מדי שנה, משך תשומת לב עולמית גם במונחים של חיפוש טיפולים מורכבים מבוססי צמחי מרפא יעילים מעבר לטיפולים קונבנציונליים 4,5<sup clas...

כאחד מסוגי הסרטן המאובחנים הנפוצים ביותר והממאירויות הנפוצות ביותר, הנתונים הסטטיסטיים האחרונים מצביעים על כך ש -2.3 מיליון מקרים של סרטן השד הופיעו ברחבי העולם עד שנת 2020, המהווים 11.7% מכלל מקרי הסרטן1. תסמינים נפוצים של סרטן השד כוללים רגישות ועקצוץ בשדיים, גושים וכאבים בשדיים, הפרשות פטמות, שחיקה או עור שקוע, ובלוטות לימפה מוגדלותבבית השחי 1,2. מדאיג עוד יותר, מספר המקרים החדשים וההיארעות הכוללת של סרטן השד ממשיכים לעלות בקצב מכריע מדי שנה, ומהווים 6.9% ממקרי המוות הקשורים לסרטן1. כיום, התערבות בסרטן השד עדיין כוללת בעיקר כימותרפיה, ניתוח, הקרנות וטיפול מקיף. למרות שהטיפול יכול להפחית ביעילות את שיעור ההישנות והתמותה של החולים, יישום טיפול ארוך טווח גורם לעיתים קרובות לייצר עמידות לתרופות רבות, נשירת שיער בשטח גדול, בחילות והקאות, ועומס נפשי ופסיכולוגי חמור 2,3. יש לציין כי הסיכון הפוטנציאלי לגרורות איברים מרובות מסרטן השד מאלץ גם אנשים לחפש מקורות צמחיים חדשים לטיפול תרופתי 4,5.
איתות בתיווך Phosphoinositide 3 kinase (PI3K) מעורב בגדילה, שגשוג והישרדות של סרטן השד באמצעות שחבור המשפיע על ביטוי של גנים מרובים6. כחלבון חישת אותות במורד הזרם של PI3K, ראיות רבות מצביעות על כך שחלבון קינאז B (AKT) יכול להזדווג עם המטרה של יונקים של חלבון רפמיצין (mTOR) כדי להגדיל עוד יותר את סרטן השד 7,8,9. יתר על כן, נטרול איתות PI3K/AKT/mTOR נטען גם כמרכיב מרכזי בתרופות המעכבות התפשטות ממאירה וממריצות אפופטוזיס בסרטן השד10,11,12. ידוע היטב כי היפוקסיה קיצונית במיקרו-סביבה של הגידול מאלצת גל מסיבי בגורם 1 אלפא (HIF-1α), אשר מחמיר עוד יותר את התקדמות סרטן השד13,14,15. במקביל, גירוי AKT מוביל גם להצטברות יתר של HIF-1α, המגביל אפופטוזיס בדגימות סרטן השד16,17. באופן מעניין, ההפעלה של איתות PI3K-AKT-HIF-1α אושרה כמעורבת בהתקדמות פתולוגית וגרורות במגוון סוגי סרטן, כולל סרטן ריאות18, סרטן המעי הגס19, סרטן השחלות20 וסרטן הערמונית21. בנוסף להיותו מתוזמר על ידי HIF-1α, ביטוי יתר של גורם שעתוק ראש מפוצל 1 (FoxO1) מופעל גם על ידי גירוי איתות AKT, המקדם מעצר מחזור ועיכוב אפופטוזיס בתאי סרטן השד22,23. יחד, הראיות המוצקות לעיל מצביעות על כך שעיכוב מפל האיתות PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1 עשוי להיות מטרה פוטנציאלית חדשה לטיפול תרופתי בסרטן השד.
Salidroside (Sal) הוכח באופן נרחב להפעיל אנטי סרטן 24,25, אנטי היפוקסיה26,27,28,29, ופעילויות פרמקולוגיות לשיפור החיסון30. זוהי אבקה חומה בהירה או חומה כי הוא מסיס בקלות במים, הוא סוג של גליקוזיד phenylethanoid ויש לו נוסחת מבנה כימי של C14H 20 O7 ומשקל מולקולרי של300.331,32. מחקרים פרמקולוגיים מודרניים הוכיחו כי סאל יכול לקדם אפופטוזיס של תאי סרטן קיבה על ידי ריסון PI3K-AKT-mTOR איתות24. ראיות נוספות מצביעות גם על כך שדיכוי איתות PI3K-AKT-HIF-1α על ידי טיפול סאל עשוי לתרום לאפופטוזיס של תאים סרטניים על ידי שיפור רגישותם לחומרים כימותרפיים25. ראיות מצביעות גם על כך שסאל מגביל נדידת תאים ופלישה וגורם למעצר מעגלי על ידי קידום אפופטוזיס בתאי MCF-7 של סרטן השד האנושי33,34. עם זאת, נותר לראות אם Sal יכול לווסת איתות PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1 ולעכב את ההתפשטות הממאירה של תאי MCF-7. לכן, פרוטוקול זה נועד לחקור את ההשפעות של Sal על נדידת תאי MCF-7, פלישה, מחזור התא ואפופטוזיס באמצעות מסלול PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1. אסטרטגיות המחקר המשולבות הכוללות ניסויים קונבנציונליים, זולים ועצמאיים, כגון נדידת תאים והערכות פלישה, אפופטוזיס וזיהוי מחזור התא על ידי ציטומטריית זרימה, מיני חמצן תגובתי (ROS) וקביעת פלואורסצנטיות Ca2+ וכו ', יכולות לספק התייחסות לתכנון הכולל של ניסויים למחקר אנטי סרטני עם רפואת צמחים מסורתית. התהליך הניסויי של המחקר הזה מוצג באיור 1.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1% penicillin/streptomycin</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SV30010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AKT antibody</td>
			<td>ImmunoWay Biotechnology Company</td>
			<td>YT0185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Annexin V-FITC/PI kit</td>
			<td>MultiSciences Biotech Co., Ltd.</td>
			<td>AP101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automatic microplate reader</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>SpectraMax iD5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bax antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology, Inc.</td>
			<td>#5023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA kit</td>
			<td>Biosharp Life Sciences</td>
			<td>BL521A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bcl-2 antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology, Inc.</td>
			<td>#15071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bim antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology, Inc.</td>
			<td>#2933</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ca2+&#8211;ATPase assay kit</td>
			<td>Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute</td>
			<td>A070-4-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell counting kit-8</td>
			<td>Biosharp Life Sciences</td>
			<td>BS350B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell cycle staining kit</td>
			<td>MultiSciences Biotech Co., Ltd.</td>
			<td>CCS012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cleaved caspase-3</td>
			<td>Cell Signaling Technology, Inc.</td>
			<td>#9661</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cleaved caspase-7</td>
			<td>Cell Signaling Technology, Inc.</td>
			<td>#8438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cleaved caspase-9</td>
			<td>Cell Signaling Technology, Inc.</td>
			<td>#20750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal violet solution</td>
			<td>Beyotime Biotechnology</td>
			<td>C0121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM high glucose culture medium</td>
			<td>Servicebio Technology Co., Ltd.</td>
			<td>G4510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Doxorubicin hydrochloride</td>
			<td>MedChemExpress</td>
			<td>HY-15142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL chemiluminescent solution</td>
			<td>Biosharp Life Sciences</td>
			<td>BL520B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Procell Life Science &#38; Technology Co., Ltd.</td>
			<td>164210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometer</td>
			<td>BD</td>
			<td>FACSCanto <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/65634/65634eq01.jpg" style="margin: auto;" /></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluo-4 AM</td>
			<td>Beyotime Biotechnology</td>
			<td>S1060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FoxO1 antibody</td>
			<td>ImmunoWay Biotechnology Company</td>
			<td>YT1758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit IgG secondary antibody</td>
			<td>MultiSciences Biotech Co., Ltd.</td>
			<td>70-GAR0072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism software</td>
			<td>La Jolla</td>
			<td>Version 6.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HIF-1&#945; antibody</td>
			<td>Affinity Biosciences</td>
			<td>BF8002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human breast cancer cell line MCF-7</td>
			<td>Procell Life Science &#38; Technology Co., Ltd.</td>
			<td>CL-0149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Loading buffer</td>
			<td>Biosharp Life Sciences</td>
			<td>BL502B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LY294002</td>
			<td>MedChemExpress</td>
			<td>HY-10108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Thermo&#160;</td>
			<td>356234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTOR antibody</td>
			<td>Servicebio Technology Co., Ltd.</td>
			<td>GB11405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na+&#8211;K+&#8211;ATPase assay kit</td>
			<td>Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute</td>
			<td>A070-2-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX71PH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-AKT antibody</td>
			<td>ImmunoWay Biotechnology Company</td>
			<td>YP0006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PI3K antibody</td>
			<td>Servicebio Technology Co., Ltd.</td>
			<td>GB11525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-PI3K antibody</td>
			<td>Affinity Biosciences</td>
			<td>AF3241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quantitative western blot imaging system</td>
			<td>Touch Image Pro</td>
			<td>eBlot</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reverse transcription first strand cDNA synthesis kit</td>
			<td>Servicebio Technology Co., Ltd.</td>
			<td>G3330-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROS assay kit</td>
			<td>Beyotime Biotechnology</td>
			<td>S0033S</td>
			<td>DCFH-DA fluorescence probe is included here</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Salidroside</td>
			<td>Chengdu Herbpurify Co., Ltd.</td>
			<td>H-040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-PAGE kit</td>
			<td>Servicebio Technology Co., Ltd.</td>
			<td>G2003-50T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Total RNA isolation kit</td>
			<td>Foregene</td>
			<td>RE-03014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30042.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-actin</td>
			<td>Affinity Biosciences</td>
			<td>AF7018</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

exploring the pharmacological action and molecular mechanism of salidroside in inhibiting mcf-7 cell proliferation and migration

Salidroside (Sal) מכיל פעילויות פרמקולוגיות אנטי מסרטנות, אנטי היפוקסיסיות ואנטי דלקתיות. עם זאת, המנגנונים הבסיסיים שלה נגד סרטן השד הובהרו רק באופן חלקי. לפיכך, פרוטוקול זה נועד לפענח את הפוטנציאל של Sal בוויסות מסלול PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1 בהתפשטות הממאירה של תאי MCF-7 של סרטן השד האנושי. ראשית, הפעילות הפרמקולוגית של Sal כנגד MCF-7 הוערכה על ידי CCK-8 ומבחני שריטות תאים. יתר על כן, העמידות של תאי MCF-7 נמדדה על ידי מבחני הגירה ופלישה מטריגל. עבור אפופטוזיס של תאים ומבחני מחזור, תאי MCF-7 עובדו בשלבים עם ANNEXIN V-FITC/PI וערכות זיהוי צביעת מחזור התא לניתוח ציטומטריית זרימה, בהתאמה. רמות מיני החמצן הריאקטיבי (ROS) ו-Ca2+ נבדקו על ידי DCFH-DA וצביעה אימונופלואורסצנטית Fluo-4 AM. הפעילות של Na+-K+-ATPase ו- Ca2+-ATPase נקבעה באמצעות ערכות מסחריות מתאימות. רמות החלבון וביטוי הגנים באפופטוזיס ובמסלול PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1 נקבעו עוד יותר באמצעות ניתוחי כתם מערבי ו- qRT-PCR, בהתאמה. מצאנו כי טיפול Sal הגביל באופן משמעותי את ההתפשטות, הנדידה והפלישה של תאי MCF-7 עם השפעות תלויות מינון. בינתיים, ממשל סאל גם אילץ באופן דרמטי תאי MCF-7 לעבור אפופטוזיס ומעצר מחזור תאים. בדיקות האימונופלואורסנציה הראו כי Sal עורר באופן נצפה ייצור ROS ו- Ca2+ בתאי MCF-7. נתונים נוספים אישרו כי סאל קידם את רמות הביטוי של חלבונים פרו-אפופטוטיים, Bax, Bim, cleaved caspase-9/7/3, ואת הגנים המתאימים להם. באופן עקבי, התערבות Sal הפחיתה באופן בולט את הביטוי של חלבוני Bcl-2, p-PI3K/PI3K, p-AKT/AKT, mTOR, HIF-1α ו-FoxO1 ואת הגנים המתאימים להם. לסיכום, Sal יכול לשמש כתרכובת פוטנציאלית שמקורה בצמחי מרפא לטיפול בסרטן השד, שכן הוא עשוי להפחית את ההתפשטות, הנדידה והפלישה הממאירה של תאי MCF-7 על ידי עיכוב מסלול PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1.

As one of the most commonly diagnosed cancers and most common malignancies, the latest statistics indicate that 2.3 million cases of breast cancer emerged around the world by 2020, accounting for 11.7% of all cancer cases1. Common symptoms of breast cancer include breast tenderness and tingling, breast lumps and pain, nipple discharge, erosion or sunken skin, and enlarged axillary lymph nodes1,2. Even more alarming, the number of new cases and the overall incidence of breast cancer continues to increase at an overwhelming rate each year, accounting for 6.9% of cancer-related deaths1. At present, breast cancer intervention still mainly involves chemotherapy, surgery, radiotherapy, and comprehensive treatment. Although treatment can effectively reduce the recurrence rate and mortality rate of patients, long-term treatment application often causes produce multidrug resistance, large-area hair loss, nausea and vomiting, and serious mental and psychological burden2,3. Notably, the potential risk of multiple organ metastases from breast cancer also forces people to seek novel herbal sources of drug therapy4,5.
Phosphoinositide 3 kinase (PI3K)-mediated signaling is implicated in the growth, proliferation, and survival of breast cancer through splicing that affects the expression of multiple genes6. As a downstream signal-sensing protein of PI3K, numerous evidence suggests that protein kinase B (AKT) could couple with the mammalian target of rapamycin (mTOR) protein to further increase breast cancer7,8,9. Moreover, the deactivation of PI3K/AKT/mTOR signaling has also been claimed to be a key component in drugs inhibiting malignant proliferation and stimulating apoptosis in breast cancer10,11,12. It is well known that extreme hypoxia in the tumor microenvironment forces a massive surge in hypoxia-inducible factor 1 alpha (HIF-1&#945;), which further worsens the progression of breast cancer13,14,15. In parallel, AKT stimulation also leads to excessive accumulation of HIF-1&#945;, limiting apoptosis in breast cancer samples16,17. Interestingly, the activation of PI3K-AKT-HIF-1&#945; signaling has been confirmed to be involved in pathologic progression and metastasis in a variety of cancers, including lung cancer18, colorectal cancer19, ovarian cancer20, and prostate cancer21. In addition to being orchestrated by HIF-1&#945;, forked head transcription factor 1 (FoxO1) overexpression is also triggered by AKT signaling stimulation, which promotes cycle arrest and the inhibition of apoptosis in breast cancer cells22,23. Together, the above solid evidence suggests that the inhibition of the cascade of PI3K-AKT-HIF-1&#945;-FoxO1 signaling may be a potential novel target for drug therapy in breast cancer.
Salidroside (Sal) has been widely demonstrated to exert anti-cancer24,25, anti-hypoxia26,27,28,29, and immune-enhancing pharmacological activities30. It is a light brown or brown powder that is easily soluble in water, is a type of phenylethanoid glycoside, and has a chemical structure formula of C14H20O7 and a molecular weight of 300.331,32. Modern pharmacological investigations have demonstrated that Sal can promote the apoptosis of gastric cancer cells by restraining PI3K-AKT-mTOR signaling24. Further evidence also suggests that the suppression of PI3K-AKT-HIF-1&#945; signaling by Sal treatment may contribute to the apoptosis of cancer cells by enhancing their sensitivity to chemotherapeutic agents25. Evidence also suggests that Sal restricts cell migration and invasion and causes cycle arrest by promoting apoptosis in the human breast cancer MCF-7 cells33,34. However, it remains to be seen whether Sal can regulate PI3K-AKT-HIF-1&#945;-FoxO1 signaling and inhibit the malignant proliferation of MCF-7 cells. Therefore, this protocol aimed to explore the effects of Sal on MCF-7 cell migration, invasion, cell cycle, and apoptosis via the PI3K-AKT-HIF-1&#945;-FoxO1 pathway. The integrated research strategies comprising conventional, low-cost, and independent experiments, such as cell migration and invasion assessments, apoptosis and cell cycle detection by flow cytometry, reactive oxygen species (ROS) and Ca2+ fluorescence determination, etc., can provide a reference for the overall design of experiments for anti-cancer research with traditional herbal medicine. The experimental process of this study is shown in Figure 1.

Author Spotlight: Exploring Salidroside's Molecular Mechanisms in Breast Cancer Treatment 

חקר הפעולה הפרמקולוגית והמנגנון המולקולרי של סלידרוסיד בעיכוב התרבות ונדידת תאי MCF-7

השפעות Sal על עיכוב התרבות עודפת ועיכוב ריפוי פצעים בתאי MCF-7 כדי לחקור את הפוטנציאל של Sal נגד סרטן השד, בדקנו תחילה את התכונות האנטי-סרטניות שלו באמצעות רעילות להתרבות תאים ומבחני שריטות של קו התאים MCF-7 של סרטן השד האנושי. תאים אלה הודגרו יחד עם סדרת ריכוזים של Sal (5-320 מיקרומטר) במשך 2...

Watch this Scientific Journal Video about Exploring Salidroside's Molecular Mechanisms in Breast Cancer Treatment at JoVE.com

הפרוטוקול הנוכחי מתאר אסטרטגיה מקיפה להערכת הפעולה הפרמקולוגית והמנגנון של סלידרוזיד בעיכוב התרבות ונדידת תאי MCF-7.

Salidroside (Sal) contains anti-carcinogenic, anti-hypoxic, and anti-inflammatory pharmacological activities. However, its underlying anti-breast cancer ...

אנו מתמקדים בחקר תרכובות פעילות שמקורן במוצרים טבעיים והפוטנציאל שלהן בטיפול בסרטן השד. אז באופן ספציפי אנו שואפים להבהיר את ההשפעות הפרמקולוגיות של salidroside ואת המנגנונים המולקולריים שלה בשילוב סרטן השד. כיום, חסרות טכניקות ניסיוניות אמינות כדי לאמת את המטרות המולקולריות של סלידרוזיד בטיפול בסרטן השד.ממצא משמעותי אחד בתחום הוא מנגנון מולקולרי פוטנציאלי של סלידרוסיד בהגברת ההתרבות והנדידה של תאי MCF7 באמצעות ויסות איתות PI3K/AKT/HIF-1 אלפא/FoxO1. המחקר העתידי של המעבדה הוא לחקור את המנגנונים הפתופיזיולוגיים העומדים בבסיס הופעת סרטן השד, התפתחותו, פרוגנוזה ותוצאותיו. בנוסף, אנו בודקים תרופות מולקולריות קטנות פעילות שמקורן במקורות טבעיים שעשויות להוסיף מניעה וטיפול בסרטן השד.

Research

JoVE Journal