Name: מחבר זרקור: קידום אבחון פתוגנים עם LAMP סטנדרטי
Uploaded: 2023-09-08T13:55:00
Description: Read this Scientific Article Protocol about Author Spotlight: Advancing Pathogen Diagnostics with Standardized LAMP at JoVE.com

עבודה זו מומנה על ידי Sistema General de Regalías מקולומביה, מספר מענק BPIN 2020000100092, ו- Universidad Icesi - Convocatoria Interna, מענק מספר CA0413119. MFVT מומן גם על ידי קרנות פרופסור עוזר מאוניברסיטת לוס אנדס. הגופים המממנים לא השתתפו בתכנון, בביצוע הפעילויות, באיסוף הנתונים ובניתוח הנתונים ובהכנת כתב היד. אנו מודים לבית החולים האוניברסיטאי Fundación Valle del Lili עבור RNA ויראלי מדגימות Sars -CoV-2 ולד"ר Alvaro Barrera-Ocampo על ההערות על כתב היד.

הדגימות ששימשו סופקו על ידי המעבדה הקלינית של בית החולים האוניברסיטאי Fundación Valle del Lili ותאמו את ה- RNA המטוהר מחולים שנבדקו חיוביים ל- COVID-19 באמצעות טכניקת RT-qPCR. כל החולים נתנו הסכמה מדעת למחקר, ומחקר זה אושר על ידי הוועדה הביו-אתית למחקרים בבני אדם מבית החולים האוניברסיטאי Fundación Valle del Lili.
<p clas...

שימוש בניתוח Colorimetric ו- RT-LAMP כדי לזהות SARS-CoV-2 

<ol>
	<li>World Health Organization. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Who coronavirus (COVID-19) dashboard (no date). , (2023).</li><li>Ibrahim, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidemiologic+surveillance+for+controlling+Covid-19+pandemic:+types,+challenges+and+implications.">Epidemiologic surveillance for controlling Covid-19 pandemic: types, challenges and implications.</a> Journal of Infection and Public Health. 13 (11), 1630-1638 (2020).</li><li>Rojas-Gallardo, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=COVID-19+in+Latin+America:+Contrasting+phylodynamic+inference+with+epidemiological+surveillance.+(Molecular+epidemiology+of+COVID-19+in+Latin+America).">COVID-19 in Latin America: Contrasting phylodynamic inference with epidemiological surveillance. (Molecular epidemiology of COVID-19 in Latin America).</a> medRxiv. , (2020).</li><li>Liu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Positive+rate+of+RT-PCR+detection+of+SARS-CoV-2+infection+in+4880+cases+from+one+hospital+in+Wuhan,+China,+from+Jan+to+Feb+2020.">Positive rate of RT-PCR detection of SARS-CoV-2 infection in 4880 cases from one hospital in Wuhan, China, from Jan to Feb 2020.</a> Clinica Chimica Acta. 505, 172-175 (2020).</li><li>Kevadiya, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnostics+for+SARS-CoV-2+infections.">Diagnostics for SARS-CoV-2 infections.</a> Nature Materials. 20 (5), 593-605 (2021).</li><li>Tomita, N., Mori, Y., Kanda, H., Notomi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loop-mediated+isothermal+amplification+(LAMP)+of+gene+sequences+and+simple+visual+detection+of+products.">Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) of gene sequences and simple visual detection of products.</a> Nature Protocols. 3 (5), 877-882 (2008).</li><li>Li, Y., Fan, P., Zhou, S., Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loop-mediated+isothermal+amplification+(LAMP):+A+novel+rapid+detection+platform+for+pathogens.">Loop-mediated isothermal amplification (LAMP): A novel rapid detection platform for pathogens.</a> Microbial Pathogenesis. 107, 54-61 (2017).</li><li>Notomi, T., Mori, Y., Tomita, N., Kanda, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loop-mediated+isothermal+amplification+(LAMP):+principle,+features,+and+future+prospects.">Loop-mediated isothermal amplification (LAMP): principle, features, and future prospects.</a> Journal of Microbiology. 53 (1), 1-5 (2015).</li><li>Augustine, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loop-mediated+isothermal+amplification+(LAMP):+A+rapid,+sensitive,+specific,+and+cost-effective+point-of-care+test+for+coronaviruses+in+the+context+of+COVID-19+pandemic.">Loop-mediated isothermal amplification (LAMP): A rapid, sensitive, specific, and cost-effective point-of-care test for coronaviruses in the context of COVID-19 pandemic.</a> Biology (Basel). 9 (8), 182 (2020).</li><li>. Nextstrain Available from: <a target="_blank" href="https://nextstrain.org/">https://nextstrain.org/</a> (2023)</li><li>. Neb Lamp, NEB LAMP Available from: <a target="_blank" href="https://lamp.neb.com/">https://lamp.neb.com/</a> (2023)</li><li>. Blast: Basic local alignment search tool (no date) Available from: <a target="_blank" href="https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/">https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/</a> (2023)</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+molecular+detection+of+SARS-CoV-2+(COVID-19)+virus+RNA+using+colorimetric+LAMP.">Rapid molecular detection of SARS-CoV-2 (COVID-19) virus RNA using colorimetric LAMP.</a> medRxiv. , (2020).</li><li>Lu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+novel+reverse+transcription+loop-mediated+isothermal+amplification+method+for+rapid+detection+of+SARS-CoV-2.">Development of a novel reverse transcription loop-mediated isothermal amplification method for rapid detection of SARS-CoV-2.</a> Virologica Sinica. 35 (3), 344-347 (2020).</li><li>Najafov, A., Hoxhaj, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> PCR Guru. , (2017).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancing+colorimetric+loop-mediated+isothermal+amplification+speed+and+sensitivity+with+guanidine+chloride.">Enhancing colorimetric loop-mediated isothermal amplification speed and sensitivity with guanidine chloride.</a> Biotechniques. 69 (3), 178-185 (2020).</li><li>Ram&#237;rez-Chavarr&#237;a, R. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automatic+analysis+of+isothermal+amplification+via+impedance+time-constant-domain+spectroscopy:+A+SARS-CoV-2+case+study.">Automatic analysis of isothermal amplification via impedance time-constant-domain spectroscopy: A SARS-CoV-2 case study.</a> Chemosensors. 11 (4), 230 (2023).</li><li>Haque, M. F. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+RdRp-based+colorimetric+RT-LAMP+assay+for+rapid+and+sensitive+detection+of+SARS-CoV-2+in+clinical+and+sewage+samples+from+Pakistan.">A novel RdRp-based colorimetric RT-LAMP assay for rapid and sensitive detection of SARS-CoV-2 in clinical and sewage samples from Pakistan.</a> Virus Research. 302, 198484 (2021).</li><li>Donia, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+RT-LAMP+and+microfluidic+technology+for+detection+of+SARS-CoV-2+in+wastewater+as+an+advanced+point-of-care+platform.">Integration of RT-LAMP and microfluidic technology for detection of SARS-CoV-2 in wastewater as an advanced point-of-care platform.</a> Food and Environmental Virology. 14, 364-373 (2022).</li></ol>

למרות RT-LAMP נחשב כמתודולוגיה משלימה לביצוע אבחון מולקולרי, יש לו גם כמה מגבלות וצעדים קריטיים שיש לקחת בחשבון כאשר הפרוטוקול הוא סטנדרטי ומיושק.
תקינת LAMP לזיהוי SARS-CoV-2 העריכה את הפרמטרים והרכיבים הבאים בתמהיל האב: (א) ריכוז וטמפרטורת היישור של הפריימרים; (ב) ריכוז האנזימים; (ג) ...

תסמונת הנשימה החריפה החמורה קורונה 2 (SARS-CoV-2) גורמת למחלת קורונה 2019 (COVID-19). ארגון הבריאות העולמי הכריז על מצב חירום לבריאות הציבור שמעורר דאגה בינלאומית ב-30 בינואר 2020 ועל מגפה עולמית ב-11 במרץ 2020. המגפה הביאה ליותר מ-760 מיליון מקרים ו-6.87 מיליון מקרי מוות נכון לתאריך כתיבת מאמר זה1.
ההשפעה של וירוס זה הדגישה את הצורך בכלי מעקב טובים יותר, מדויקים יותר, מהירים יותר וזמינים יותר כדי לשפר את הזיהוי והבקרה של מחלות זיהומיות 2,3. במהלך המגיפה, בדיקות אבחון SARS-CoV-2 התבססו על גילוי חומצת גרעין, נוגדנים וחלבונים, אך זיהוי RT-PCR של חומצת גרעין הוא תקן הזהב4. עם זאת, RT-PCR יש כמה מגבלות; זה דורש ציוד מיוחד, תשתיות, וכוח אדם מאומן ביולוגיה מולקולרית, להגביל את היישום שלה למעבדות מיוחדות. יתר על כן, זה לוקח זמן (4-6 שעות), לא כולל הזמן להעביר את הדגימות למעבדה, אשר יכול לקחתימים 5. אילוצים אלה מונעים עיבוד דגימות יעיל וקבלת המידע הדרוש לתכנון מגירה וניהול אפידמיולוגי.
להגברה איזותרמית בתיווך לולאת שעתוק לאחור (RT-LAMP) יש מספר יתרונות על פני RT-PCR, מה שהופך אותה לאסטרטגיה מושכת לתכנון בדיקות אבחון עתידיות של נקודת טיפול (POCT), במיוחד בהגדרות מוגבלות משאבים6. ראשית, הוא ספציפי מאוד מכיוון שהוא משתמש בין ארבעה לשישה פריימרים המזהים שישה עד שמונה אזורים ברצף המטרה, בין אם זה DNA או RNA 7,8. שנית, מכיוון שהוא פועל בטמפרטורה קבועה, הוא אינו זקוק לציוד מתוחכם כגון מחזורים תרמיים בזמן אמת כדי לייצר את ההגברה, וגם אינו מחייב כוח אדם מיומן להפעלתו. שלישית, זמן התגובה קצר מאוד (~ 60 דקות), וריאגנטים שאינם מיוחדים מאוד מועסקים, מה שהופך אותו לכלי חסכוני6. לאור האמור לעיל ומצב החירום הבריאותי שנגרם על ידי מגיפת COVID-19, ניתן לראות בטכניקה זו שיטת אבחון חלופית מהירה, זולה ופשוטה ליישום בכל מעבדת מחקר9.
הפרוטוקול לסטנדרטיזציה ויישום של מנורת RT-LAMP לזיהוי SARS-CoV-2 בשיטות קולורימטריות באמצעות תרמוסייקלר ואמבט מים מתואר במאמר זה (איור 1). נדונות נקודות קריטיות, מגבלותיהן וחלופות לקידומן.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65662/65662fig01.jpg"> איור 1: סכימת הפרוטוקול להגברת SARS-CoV-2 באמצעות טכניקת RT-LAMP. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65662/65662fig01large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 kb DNA Ladder</td>
			<td>SOLIS BIODYNE</td>
			<td>07-12-00050</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50x TAE Electrophoresis Buffer</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>B49</td>
			<td>Store at roome temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accuris High Fidelity Polymerase</td>
			<td>ACCURIS LIFE SCIENCE REAGENTS</td>
			<td>PR1000-HF-200</td>
			<td>It can be used in case Q5 High-Fidelity DNA polymerase cannot be purchased. For the enzyme, make aliquots of an appropriate volume and store at -20 &#176;C until use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>PanReacAppliChem</td>
			<td>A8963,0100</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bst 3.0 DNA Polymerase 8000 IU/mL</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0374S/M0374L</td>
			<td>For the enzyme, make aliquots of an appropriate volume and store at -20 &#176;C until use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxynucleotide (dNTP) Solution Set</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>N0446S</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diethyl pyrocarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>159220-25G&#160;</td>
			<td>Handle it with caution under an extraction cabinet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneRuler 100 bp Plus DNA Ladder, ready-to-use</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>SM0322</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydroxy naphthol blue disodium salt</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-215156B</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q5 High-Fidelity DNA polymerase 2000 IU/mL&#160;</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0491S/M0491L</td>
			<td>For the enzyme, make aliquots of an appropriate volume and store at -20 &#176;C until use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WarmStart RTx Reverse Transcriptase 15000 IU/mL</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0380S/M0380L</td>
			<td>For the enzyme, make aliquots of an appropriate volume and store at -20 &#176;C until use.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detecting sars-cov-2 virus by reverse transcription-loop-mediated isothermal amplification

נגיף תסמונת הנשימה החריפה החמורה קורונה 2 (SARS-CoV-2) השפיע באופן דרמטי על בריאות האדם. זה ממשיך להיות איום על החברה המודרנית כי אנשים רבים מתים כתוצאה של זיהום. המחלה מאובחנת באמצעות בדיקות סרולוגיות ומולקולריות, כגון תגובת שרשרת פולימראז בזמן אמת (RT-PCR). האחרון יש כמה חסרונות כי זה דורש תשתית מיוחדת, ציוד יקר, כוח אדם מיומן. כאן, אנו מציגים פרוטוקול המתאר את השלבים הנדרשים לזיהוי נגיף SARS-CoV-2 באמצעות הגברה איזותרמית בתיווך לולאת שעתוק לאחור (RT-LAMP) בדגימות אנושיות. הפרוטוקול כולל הוראות לתכנון פריימרים בסיליקו, הכנת ריאגנטים, הגברה והדמיה. לאחר סטנדרטיזציה, שיטה זו יכולה להיות מיושמת בקלות ומותאמת לכל מעבדה או נקודת טיפול בתוך 60 דקות בעלות נמוכה באמצעות ציוד זול. הוא מסתגל לאיתור פתוגנים שונים. לכן, זה יכול לשמש בשטח ובמרכזי בריאות לבצע מעקב אפידמיולוגי בזמן.

The severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) causes coronavirus disease 2019 (COVID-19). The World Health Organization declared a public health emergency of international concern on 30 January 2020 and a pandemic on 11 March 2020. The pandemic resulted in over 760 million cases and 6.87 million deaths as of the date this article was written1.
The impact of this virus has highlighted the need for better, more accurate, faster, and more widely available surveillance tools to improve infectious disease detection and control2,3. During the pandemic, SARS-CoV-2 diagnostic tests were based on detecting nucleic acid, antibodies, and proteins, but RT-PCR detection of nucleic acid is the gold standard4. However, RT-PCR has some limitations; it requires specialized equipment, infrastructure, and personnel trained in molecular biology, limiting its application to specialized laboratories. Further, it is time-consuming (4-6 h), not including the time to transport the specimens to the laboratory, which can take days5. These constraints prevent efficient sample processing and obtaining the information required for contingency planning and epidemiological management.
Reverse transcription-loop-mediated isothermal amplification (RT-LAMP) has several advantages over RT-PCR, making it an appealing strategy for designing future point-of-care diagnostic tests (POCT), particularly in resource-constrained settings6. First, it is greatly specific because it uses between four and six primers that recognize six to eight areas in the target sequence, be it DNA or RNA7,8. Second, because it operates at a constant temperature, it does not require sophisticated equipment such as real-time thermal cyclers to generate the amplification, nor does it necessitate highly trained personnel to operate it. Third, the reaction time is very short (~60 min), and reagents that are not very specialized are employed, which makes it a cost-effective tool6. Given the foregoing and the health emergency caused by the COVID-19 pandemic, this technique can be viewed as an alternative diagnostic method that is quick, inexpensive, and simple to implement in any research laboratory9.
The protocol for standardizing and implementing an RT-LAMP to detect SARS-CoV-2 by colorimetric methods using a thermocycler and a water bath is described in this article (Figure 1). Critical points, their limitations, and alternatives to advance them are discussed.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65662/65662fig01.jpg" /> 
Figure 1: Scheme of the protocol for amplifying SARS-CoV-2 using the RT-LAMP technique. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65662/65662fig01large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>

מחבר זרקור: קידום אבחון פתוגנים עם LAMP סטנדרטי

איתור נגיף SARS-CoV-2 על ידי הגברה איזותרמית בתיווך לולאת שעתוק לאחור

Our research aims to standardize LAMP as a prediagnostic test, suitable for field or primary care settings lacking advanced laboratory infrastructure. We seek to promote the use of locally-producible buffers and alternative dyes, reducing dependence on imported commercial kits. Currently, CRISPR-Cas is an efficient system employed in the development of fast, specific, and sensitive diagnostic methods for pathogens.Now, this system has a broad range of and supplements to detect RNA or DNA targets in different samples of interest. The current experimental challenges involve preventing non-target amplification resulting from amplicon contamination and primary cell especially with lengthy primers prone to dimer formation. Additionally, we aim to determine optimal reaction conditions to achieve a visually distinguishable color change in the dye.Once it's standardized and fully validated, this method can be easily implemented and adapt to any laboratory or point-of-care within 60 minutes, at low cost and using inexpensive equipment, to detect almost any pathogen. Thus, it can potentially be used in primary care centers to carry out timely, epidemiological surveillance. Our multidisciplinary group is focused on the discovery of molecules from native Colombia plants, trying to identify the potential to inhibit the replication of viruses such as dengue, Zika, or SARS-COVID-2.In addition, we are conducting studies to develop molecular diagnostic methods for these viruses.

יישום הפרוטוקול מתחיל בתכנון סט הפריימרים לכל גן מטרה בהתאם לפרוטוקול המתואר לעיל. ביוני 2020 התקבלו 5,000 גנומים של SARS-CoV-2 ממסד הנתונים NextStrain, עם ייצוג של 10% של הגנום הקולומביאני. רצפים אלה יושרו כדי לקבל את רצף הקונצנזוס ששימש בתהליך תכנון הפריימר. טבלה 1 מציגה את ערכת הפריימרים שנבחר...

Read this Scientific Article Protocol about Author Spotlight: Advancing Pathogen Diagnostics with Standardized LAMP at JoVE.com

כאן אנו מספקים פרוטוקול מלא לסטנדרטיזציה ויישום השיטה לזיהוי נגיף SARS-CoV-2 בדגימות אנושיות על ידי הגברה איזותרמית בתיווך לולאה של שעתוק לאחור (RT-LAMP). שיטה זו, הנעשית תוך 60 דקות, יכולה להיות מותאמת לכל מעבדה או נקודת טיפול בעלות נמוכה ובאמצעות ציוד זול.

The severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) virus has dramatically impacted human health. It continues to be a threat to modern ...

מטרת המחקר שלנו היא לתקנן את LAMP כבדיקה קדם-דיאגנוסטית, המתאימה למסגרות שדה או רפואה ראשונית חסרות תשתית מעבדה מתקדמת. אנו שואפים לקדם את השימוש במאגרים ובצבעים חלופיים לייצור מקומי, תוך הפחתת התלות בערכות מסחריות מיובאות. כיום, CRISPR-Cas היא מערכת יעילה המשמשת בפיתוח שיטות אבחון מהירות, ספציפיות ורגישות לפתוגנים.כעת, למערכת זו יש מגוון רחב של ותוספים לאיתור מטרות RNA או DNA בדגימות שונות המעניינות. אתגרי הניסוי הנוכחיים כוללים מניעת הגברה שאינה מטרה כתוצאה מזיהום אמפליקון ותא ראשוני, במיוחד עם פריימרים ארוכים המועדים להיווצרות דימר. בנוסף, אנו שואפים לקבוע תנאי תגובה אופטימליים כדי להשיג שינוי צבע שניתן להבחין בו חזותית בצבע.לאחר שהיא מתוקננת ומאומתת במלואה, ניתן ליישם שיטה זו בקלות ולהתאים אותה לכל מעבדה או נקודת טיפול תוך 60 דקות, בעלות נמוכה ותוך שימוש בציוד זול, כדי לזהות כמעט כל פתוגן. לכן, זה יכול לשמש פוטנציאלית במרכזי טיפול ראשוני לבצע בזמן, מעקב אפידמיולוגי. הקבוצה הרב-תחומית שלנו מתמקדת בגילוי מולקולות מצמחים מקומיים בקולומביה, בניסיון לזהות את הפוטנציאל לעכב את שכפול הנגיפים כמו דנגי, זיקה או SARS-COVID-2.בנוסף, אנו עורכים מחקרים לפיתוח שיטות אבחון מולקולריות לנגיפים אלה.

detecting-sars-cov-2-virus-reverse-transcription-loop-mediated

Research

JoVE Journal

Biology

Detecting SARS-CoV-2 Virus by Reverse Transcription-Loop-Mediated Isothermal Amplification

The severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) virus has dramatically impacted human health. It continues to be a threat to modern society because many people die as a result of infection. The disease is diagnosed using serologic and molecular tests, such as the gold standard real-time polymerase chain reaction (RT-PCR). The last has several disadvantages because it requires specialized infrastructure, costly equipment, and trained personnel. Here, we present a protocol outlining the steps required to detect the SARS-CoV-2 virus using reverse transcription-loop-mediated isothermal amplification (RT-LAMP) in human samples. The protocol includes instructions for designing primers in silico, preparing reagents, amplification, and visualization. Once standardized, this method can be easily implemented and adapted to any laboratory or point-of-care within 60 min at a low cost and using inexpensive equipment. It is adaptable to detecting different pathogens. Thus, it can potentially be used in the field and in health centers to carry out timely epidemiological surveillance.

Here we provide a complete protocol to standardize and implement the method for detecting the SARS-CoV-2 virus in human samples by reverse transcription loop-mediated isothermal amplification (RT-LAMP). This method, done within 60 min, could be adapted to any laboratory or point-of-care at a low cost and using inexpensive equipment.

Reverse Transcriptase-Loop Mediated Isothermal Amplification Reaction (RT-LAMP) for SARS-CoV-2 Detection

To begin, switch on the laminar airflow cabinet, allowing it to stabilize for three minutes. Aseptically clean and sanitize the cabinet's internal surfaces using the following disinfection agents. After disinfecting any material that will enter the cabinet, place napkins and nitrile gloves into the cabinet.Then switch off the cabinet and expose it to ultraviolet light for 15 minutes. After the irradiation, restart the cabinet. Place the primer design reagents in an ice-filled cooler.After sanitizing it with 70%ethanol, place the container inside the cabinet. Prepare the loop mediated isothermal amplification, or LAMP mix, in a 0.6 milliliter microcentrifuge tube. Pipette the mixture to homogenize it.Next, incubate the closed tubes in a heating block at 95 degrees Celsius for five minutes. Then cool the tubes in an ice-filled polystyrene cooler for five minutes. After cooling, place the tubes in the laminar flow cabinet.To complete the LAMP mix, add four microliters of DNA polymerase, followed by one microliter of reverse transcriptase. To perform colorimetric detection, add the dihydroxynaphthol blue. After reagent addition, pipette each solution to properly mix the LAMP reagents.Next, pipette 22 microliters of the solution into PCR tubes, being careful not to create bubbles. For the negative control, add three microliters of 0.1%diethyl pyrocarbonate water. Keep aside any remaining tubes for the addition of genetic material.Next, remove all materials from the cabinet. After sanitizing the cabinet surfaces with 70%ethanol, shut it off. In a separate area, add three microliters of the sample to each PCR tube and pipette well with a 20 microliter micropipette to thoroughly homogenize.Before initiating the colorimetric reaction, use a high quality camera to take pictures of the PCR tubes. Now, carry out the reaction using a thermal cycler and a water bath. For the thermal cycler, place the tubes into the reaction block and set up thermo profile on the equipment.If using the water bath, securely place the tubes in circular containers, then place these containers in the water bath at 66.3 degrees Celsius for 60 minutes. After the reaction time, remove the tubes and store them at four degrees Celsius until use. If a colorimetric reaction was performed, capture images of the PCR with a high quality camera.A temperature gradient demonstrated that the optimal melting temperature was 66.3 degrees Celsius. The concentration of BST 3.0 enzyme was optimized to 3.2 international units per microliter. To define the colorimetric strategy, phenol red in neutral red dyes were evaluated.However, no color change was observed after amplification. Standardization of different concentrations of hydroxynaphthol blue was performed with the optimum change occurring with 125 micromoles of hydroxynaphthol blue. The amplified samples demonstrated a change in the color in accordance with their concentration.Sample amplification was further confirmed by electrophoresis.