Name: लेखक स्पॉटलाइट: मानकीकृत लैंप के साथ रोगज़नक़ निदान को आगे बढ़ाना
Uploaded: 2023-09-08T13:55:00
Description: Read this Scientific Article Protocol about Author Spotlight: Advancing Pathogen Diagnostics with Standardized LAMP at JoVE.com

इस काम को कोलंबिया के सिस्तेमा जनरल डी रेगलियास, अनुदान संख्या बीपिन 2020000100092, और यूनिवर्सिडैड इसेसी - कॉन्वोकेटोरिया इंटरना, अनुदान संख्या CA0413119 द्वारा वित्त पोषित किया गया था। MFVT को Universidad de los Andes से सहायक प्रोफेसरशिप फंड द्वारा भी वित्तपोषित किया गया था। फंडिंग संस्थाओं ने डिजाइन, गतिविधियों के निष्पादन, डेटा संग्रह, और डेटा विश्लेषण और पांडुलिपि की तैयारी में भाग नहीं लिया। हम Sars -CoV-2 नमूनों से वायरल RNA के लिए यूनिवर्सिटी हॉस्पिटल Fundación Valle del Lili और पांडुलिपि पर टिप्पणियों के लिए डॉ. अल्वारो बर्रेरा-ओकाम्पो को धन्यवाद देते हैं।

उपयोग किए गए नमूने Fundación Valle del Lili University अस्पताल की नैदानिक प्रयोगशाला द्वारा प्रदान किए गए थे और RT-qPCR तकनीक का उपयोग करके COVID-19 के लिए सकारात्मक परीक्षण करने वाले रोगियों से शुद्ध RNA के अनुरूप थे। सभी रोगियों ने अ...

SARS-CoV-2 का पता लगाने के लिए वर्णमिति और RT-LAMP विश्लेषण का उपयोग करना 

<ol>
	<li>World Health Organization. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Who coronavirus (COVID-19) dashboard (no date). , (2023).</li><li>Ibrahim, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidemiologic+surveillance+for+controlling+Covid-19+pandemic:+types,+challenges+and+implications.">Epidemiologic surveillance for controlling Covid-19 pandemic: types, challenges and implications.</a> Journal of Infection and Public Health. 13 (11), 1630-1638 (2020).</li><li>Rojas-Gallardo, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=COVID-19+in+Latin+America:+Contrasting+phylodynamic+inference+with+epidemiological+surveillance.+(Molecular+epidemiology+of+COVID-19+in+Latin+America).">COVID-19 in Latin America: Contrasting phylodynamic inference with epidemiological surveillance. (Molecular epidemiology of COVID-19 in Latin America).</a> medRxiv. , (2020).</li><li>Liu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Positive+rate+of+RT-PCR+detection+of+SARS-CoV-2+infection+in+4880+cases+from+one+hospital+in+Wuhan,+China,+from+Jan+to+Feb+2020.">Positive rate of RT-PCR detection of SARS-CoV-2 infection in 4880 cases from one hospital in Wuhan, China, from Jan to Feb 2020.</a> Clinica Chimica Acta. 505, 172-175 (2020).</li><li>Kevadiya, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnostics+for+SARS-CoV-2+infections.">Diagnostics for SARS-CoV-2 infections.</a> Nature Materials. 20 (5), 593-605 (2021).</li><li>Tomita, N., Mori, Y., Kanda, H., Notomi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loop-mediated+isothermal+amplification+(LAMP)+of+gene+sequences+and+simple+visual+detection+of+products.">Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) of gene sequences and simple visual detection of products.</a> Nature Protocols. 3 (5), 877-882 (2008).</li><li>Li, Y., Fan, P., Zhou, S., Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loop-mediated+isothermal+amplification+(LAMP):+A+novel+rapid+detection+platform+for+pathogens.">Loop-mediated isothermal amplification (LAMP): A novel rapid detection platform for pathogens.</a> Microbial Pathogenesis. 107, 54-61 (2017).</li><li>Notomi, T., Mori, Y., Tomita, N., Kanda, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loop-mediated+isothermal+amplification+(LAMP):+principle,+features,+and+future+prospects.">Loop-mediated isothermal amplification (LAMP): principle, features, and future prospects.</a> Journal of Microbiology. 53 (1), 1-5 (2015).</li><li>Augustine, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loop-mediated+isothermal+amplification+(LAMP):+A+rapid,+sensitive,+specific,+and+cost-effective+point-of-care+test+for+coronaviruses+in+the+context+of+COVID-19+pandemic.">Loop-mediated isothermal amplification (LAMP): A rapid, sensitive, specific, and cost-effective point-of-care test for coronaviruses in the context of COVID-19 pandemic.</a> Biology (Basel). 9 (8), 182 (2020).</li><li>. Nextstrain Available from: <a target="_blank" href="https://nextstrain.org/">https://nextstrain.org/</a> (2023)</li><li>. Neb Lamp, NEB LAMP Available from: <a target="_blank" href="https://lamp.neb.com/">https://lamp.neb.com/</a> (2023)</li><li>. Blast: Basic local alignment search tool (no date) Available from: <a target="_blank" href="https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/">https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/</a> (2023)</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+molecular+detection+of+SARS-CoV-2+(COVID-19)+virus+RNA+using+colorimetric+LAMP.">Rapid molecular detection of SARS-CoV-2 (COVID-19) virus RNA using colorimetric LAMP.</a> medRxiv. , (2020).</li><li>Lu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+novel+reverse+transcription+loop-mediated+isothermal+amplification+method+for+rapid+detection+of+SARS-CoV-2.">Development of a novel reverse transcription loop-mediated isothermal amplification method for rapid detection of SARS-CoV-2.</a> Virologica Sinica. 35 (3), 344-347 (2020).</li><li>Najafov, A., Hoxhaj, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> PCR Guru. , (2017).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancing+colorimetric+loop-mediated+isothermal+amplification+speed+and+sensitivity+with+guanidine+chloride.">Enhancing colorimetric loop-mediated isothermal amplification speed and sensitivity with guanidine chloride.</a> Biotechniques. 69 (3), 178-185 (2020).</li><li>Ram&#237;rez-Chavarr&#237;a, R. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automatic+analysis+of+isothermal+amplification+via+impedance+time-constant-domain+spectroscopy:+A+SARS-CoV-2+case+study.">Automatic analysis of isothermal amplification via impedance time-constant-domain spectroscopy: A SARS-CoV-2 case study.</a> Chemosensors. 11 (4), 230 (2023).</li><li>Haque, M. F. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+RdRp-based+colorimetric+RT-LAMP+assay+for+rapid+and+sensitive+detection+of+SARS-CoV-2+in+clinical+and+sewage+samples+from+Pakistan.">A novel RdRp-based colorimetric RT-LAMP assay for rapid and sensitive detection of SARS-CoV-2 in clinical and sewage samples from Pakistan.</a> Virus Research. 302, 198484 (2021).</li><li>Donia, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+RT-LAMP+and+microfluidic+technology+for+detection+of+SARS-CoV-2+in+wastewater+as+an+advanced+point-of-care+platform.">Integration of RT-LAMP and microfluidic technology for detection of SARS-CoV-2 in wastewater as an advanced point-of-care platform.</a> Food and Environmental Virology. 14, 364-373 (2022).</li></ol>

यद्यपि आरटी-एलएएमपी को आणविक निदान करने के लिए एक पूरक पद्धति के रूप में माना जाता है, लेकिन इसमें कुछ सीमाएं और महत्वपूर्ण कदम भी हैं जिन पर प्रोटोकॉल मानकीकृत और कार्यान्वित होने पर विचार किया जाना च?...

गंभीर तीव्र श्वसन सिंड्रोम कोरोनावायरस 2 (SARS-CoV-2) कोरोनावायरस रोग 2019 (COVID-19) का कारण बनता है। विश्व स्वास्थ्य संगठन ने 30 जनवरी 2020 को अंतर्राष्ट्रीय चिंता का सार्वजनिक स्वास्थ्य आपातकाल और 11 मार्च 2020 को एक महामारी घोषित किया। महामारी के परिणामस्वरूप 760 मिलियन से अधिक मामले और 6.87 मिलियन मौतें हुईं, जिस तारीख को यहलेख लिखा गया था।
इस वायरस के प्रभाव ने संक्रामक रोग का पता लगाने और 2,3 को नियंत्रित करने के लिए बेहतर, अधिक सटीक, तेज और अधिक व्यापक रूप से उपलब्ध निगरानी उपकरणों की आवश्यकता पर प्रकाश डाला है। महामारी के दौरान, SARS-CoV-2 नैदानिक परीक्षण न्यूक्लिक एसिड, एंटीबॉडी और प्रोटीन का पता लगाने पर आधारित थे, लेकिन न्यूक्लिक एसिड का RT-PCR पता लगाना स्वर्ण मानक4 है। हालाँकि, RT-PCR की कुछ सीमाएँ हैं; इसके लिए विशेष उपकरण, बुनियादी ढांचे और आणविक जीव विज्ञान में प्रशिक्षित कर्मियों की आवश्यकता होती है, जो विशेष प्रयोगशालाओं में इसके आवेदन को सीमित करते हैं। इसके अलावा, यह समय लेने वाली (4-6 घंटे) है, जिसमें नमूनों को प्रयोगशाला में ले जाने का समय शामिल नहीं है, जिसमें5 दिन लग सकते हैं। ये बाधाएं कुशल नमूना प्रसंस्करण और आकस्मिक योजना और महामारी विज्ञान प्रबंधन के लिए आवश्यक जानकारी प्राप्त करने से रोकती हैं।
रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन-लूप-मध्यस्थता इज़ोटेर्मल प्रवर्धन (आरटी-एलएएमपी) के आरटी-पीसीआर पर कई फायदे हैं, जो इसे भविष्य के पॉइंट-ऑफ-केयर डायग्नोस्टिक परीक्षणों (पीओसीटी) को डिजाइन करने के लिए एक आकर्षक रणनीति बनाते हैं, विशेष रूप से संसाधन-विवश सेटिंग्स6 में। सबसे पहले, यह बहुत विशिष्ट है क्योंकि यह चार और छह प्राइमरों के बीच उपयोग करता है जो लक्ष्य अनुक्रम में छह से आठ क्षेत्रों को पहचानते हैं, चाहे वह डीएनए हो या आरएनए 7,8। दूसरा, क्योंकि यह एक स्थिर तापमान पर संचालित होता है, इसे प्रवर्धन उत्पन्न करने के लिए वास्तविक समय थर्मल साइक्लर्स जैसे परिष्कृत उपकरणों की आवश्यकता नहीं होती है, न ही इसे संचालित करने के लिए उच्च प्रशिक्षित कर्मियों की आवश्यकता होती है। तीसरा, प्रतिक्रिया समय बहुत कम (~ 60 मिनट) है, और अभिकर्मकों कि बहुत विशिष्ट नहीं हैं कार्यरत हैं, जो यह एक लागत प्रभावी उपकरण6 बनाता है. पूर्वगामी और COVID-19 महामारी के कारण स्वास्थ्य आपातकाल को देखते हुए, इस तकनीक को एक वैकल्पिक नैदानिक पद्धति के रूप में देखा जा सकता है जो किसी भीशोध प्रयोगशाला 9 में लागू करने के लिए त्वरित, सस्ती और सरल है।
थर्मोसाइक्लर और पानी के स्नान का उपयोग करके वर्णमिति विधियों द्वारा SARS-CoV-2 का पता लगाने के लिए RT-LAMP के मानकीकरण और कार्यान्वयन के लिए प्रोटोकॉल इस लेख में वर्णित है (चित्र 1)। महत्वपूर्ण बिंदुओं, उनकी सीमाओं और उन्हें आगे बढ़ाने के विकल्पों पर चर्चा की जाती है।
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65662/65662fig01.jpg"> चित्र 1: RT-LAMP तकनीक का उपयोग करके SARS-CoV-2 को बढ़ाने के लिए प्रोटोकॉल की योजना। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65662/65662fig01large.jpg" target="_blank">कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 kb DNA Ladder</td>
			<td>SOLIS BIODYNE</td>
			<td>07-12-00050</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50x TAE Electrophoresis Buffer</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>B49</td>
			<td>Store at roome temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accuris High Fidelity Polymerase</td>
			<td>ACCURIS LIFE SCIENCE REAGENTS</td>
			<td>PR1000-HF-200</td>
			<td>It can be used in case Q5 High-Fidelity DNA polymerase cannot be purchased. For the enzyme, make aliquots of an appropriate volume and store at -20 &#176;C until use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>PanReacAppliChem</td>
			<td>A8963,0100</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bst 3.0 DNA Polymerase 8000 IU/mL</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0374S/M0374L</td>
			<td>For the enzyme, make aliquots of an appropriate volume and store at -20 &#176;C until use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxynucleotide (dNTP) Solution Set</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>N0446S</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diethyl pyrocarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>159220-25G&#160;</td>
			<td>Handle it with caution under an extraction cabinet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneRuler 100 bp Plus DNA Ladder, ready-to-use</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>SM0322</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydroxy naphthol blue disodium salt</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-215156B</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q5 High-Fidelity DNA polymerase 2000 IU/mL&#160;</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0491S/M0491L</td>
			<td>For the enzyme, make aliquots of an appropriate volume and store at -20 &#176;C until use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WarmStart RTx Reverse Transcriptase 15000 IU/mL</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0380S/M0380L</td>
			<td>For the enzyme, make aliquots of an appropriate volume and store at -20 &#176;C until use.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detecting sars-cov-2 virus by reverse transcription-loop-mediated isothermal amplification

गंभीर तीव्र श्वसन सिंड्रोम कोरोनावायरस 2 (SARS-CoV-2) वायरस ने मानव स्वास्थ्य को नाटकीय रूप से प्रभावित किया है। यह आधुनिक समाज के लिए खतरा बना हुआ है क्योंकि संक्रमण के परिणामस्वरूप कई लोग मर जाते हैं। रोग का निदान सीरोलॉजिकल और आणविक परीक्षणों का उपयोग करके किया जाता है, जैसे कि गोल्ड स्टैंडर्ड रियल-टाइम पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (आरटी-पीसीआर)। अंतिम के कई नुकसान हैं क्योंकि इसके लिए विशेष बुनियादी ढांचे, महंगे उपकरण और प्रशिक्षित कर्मियों की आवश्यकता होती है। यहां, हम मानव नमूनों में रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन-लूप-मध्यस्थता इज़ोटेर्मल एम्प्लीफिकेशन (RT-LAMP) का उपयोग करके SARS-CoV-2 वायरस का पता लगाने के लिए आवश्यक चरणों की रूपरेखा तैयार करते हुए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। प्रोटोकॉल सिलिको में प्राइमरों डिजाइन, अभिकर्मकों, प्रवर्धन और दृश्य तैयार करने के लिए निर्देश शामिल हैं. एक बार मानकीकृत होने के बाद, इस पद्धति को आसानी से लागू किया जा सकता है और कम लागत पर और सस्ते उपकरणों का उपयोग करके 60 मिनट के भीतर किसी भी प्रयोगशाला या देखभाल के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। यह विभिन्न रोगजनकों का पता लगाने के लिए अनुकूल है। इस प्रकार, यह संभावित रूप से क्षेत्र में और स्वास्थ्य केंद्रों में समय पर महामारी विज्ञान निगरानी करने के लिए उपयोग किया जा सकता है।

The severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) causes coronavirus disease 2019 (COVID-19). The World Health Organization declared a public health emergency of international concern on 30 January 2020 and a pandemic on 11 March 2020. The pandemic resulted in over 760 million cases and 6.87 million deaths as of the date this article was written1.
The impact of this virus has highlighted the need for better, more accurate, faster, and more widely available surveillance tools to improve infectious disease detection and control2,3. During the pandemic, SARS-CoV-2 diagnostic tests were based on detecting nucleic acid, antibodies, and proteins, but RT-PCR detection of nucleic acid is the gold standard4. However, RT-PCR has some limitations; it requires specialized equipment, infrastructure, and personnel trained in molecular biology, limiting its application to specialized laboratories. Further, it is time-consuming (4-6 h), not including the time to transport the specimens to the laboratory, which can take days5. These constraints prevent efficient sample processing and obtaining the information required for contingency planning and epidemiological management.
Reverse transcription-loop-mediated isothermal amplification (RT-LAMP) has several advantages over RT-PCR, making it an appealing strategy for designing future point-of-care diagnostic tests (POCT), particularly in resource-constrained settings6. First, it is greatly specific because it uses between four and six primers that recognize six to eight areas in the target sequence, be it DNA or RNA7,8. Second, because it operates at a constant temperature, it does not require sophisticated equipment such as real-time thermal cyclers to generate the amplification, nor does it necessitate highly trained personnel to operate it. Third, the reaction time is very short (~60 min), and reagents that are not very specialized are employed, which makes it a cost-effective tool6. Given the foregoing and the health emergency caused by the COVID-19 pandemic, this technique can be viewed as an alternative diagnostic method that is quick, inexpensive, and simple to implement in any research laboratory9.
The protocol for standardizing and implementing an RT-LAMP to detect SARS-CoV-2 by colorimetric methods using a thermocycler and a water bath is described in this article (Figure 1). Critical points, their limitations, and alternatives to advance them are discussed.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65662/65662fig01.jpg" /> 
Figure 1: Scheme of the protocol for amplifying SARS-CoV-2 using the RT-LAMP technique. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65662/65662fig01large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>

लेखक स्पॉटलाइट: मानकीकृत लैंप के साथ रोगज़नक़ निदान को आगे बढ़ाना

रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन-लूप-मध्यस्थता इज़ोटेर्मल प्रवर्धन द्वारा SARS-CoV-2 वायरस का पता लगाना

Our research aims to standardize LAMP as a prediagnostic test, suitable for field or primary care settings lacking advanced laboratory infrastructure. We seek to promote the use of locally-producible buffers and alternative dyes, reducing dependence on imported commercial kits. Currently, CRISPR-Cas is an efficient system employed in the development of fast, specific, and sensitive diagnostic methods for pathogens.Now, this system has a broad range of and supplements to detect RNA or DNA targets in different samples of interest. The current experimental challenges involve preventing non-target amplification resulting from amplicon contamination and primary cell especially with lengthy primers prone to dimer formation. Additionally, we aim to determine optimal reaction conditions to achieve a visually distinguishable color change in the dye.Once it's standardized and fully validated, this method can be easily implemented and adapt to any laboratory or point-of-care within 60 minutes, at low cost and using inexpensive equipment, to detect almost any pathogen. Thus, it can potentially be used in primary care centers to carry out timely, epidemiological surveillance. Our multidisciplinary group is focused on the discovery of molecules from native Colombia plants, trying to identify the potential to inhibit the replication of viruses such as dengue, Zika, or SARS-COVID-2.In addition, we are conducting studies to develop molecular diagnostic methods for these viruses.

प्रोटोकॉल का कार्यान्वयन ऊपर वर्णित प्रोटोकॉल के बाद प्रत्येक लक्ष्य जीन के लिए प्राइमरों के सेट को डिजाइन करके शुरू होता है। जून 2020 में, कोलंबियाई जीनोम के 5,000% प्रतिनिधित्व के साथ, नेक्स्टस्ट्रेन डेट?...

Read this Scientific Article Protocol about Author Spotlight: Advancing Pathogen Diagnostics with Standardized LAMP at JoVE.com

यहां हम रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन लूप-मध्यस्थता इज़ोटेर्मल प्रवर्धन (RT-LAMP) द्वारा मानव नमूनों में SARS-CoV-2 वायरस का पता लगाने की विधि को मानकीकृत और कार्यान्वित करने के लिए एक पूर्ण प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं। 60 मिनट के भीतर की गई इस विधि को कम लागत पर और सस्ते उपकरणों का उपयोग करके किसी भी प्रयोगशाला या पॉइंट-ऑफ-केयर के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।

The severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) virus has dramatically impacted human health. It continues to be a threat to modern ...

हमारे शोध का उद्देश्य एलएएमपी को प्रीडायग्नोस्टिक परीक्षण के रूप में मानकीकृत करना है, जो उन्नत प्रयोगशाला बुनियादी ढांचे की कमी वाले क्षेत्र या प्राथमिक देखभाल सेटिंग्स के लिए उपयुक्त है। हम स्थानीय रूप से उत्पादित बफर और वैकल्पिक रंगों के उपयोग को बढ़ावा देना चाहते हैं, जिससे आयातित वाणिज्यिक किटों पर निर्भरता कम हो जाती है। वर्तमान में, सीआरआईएसपीआर-सीएएस एक कुशल प्रणाली है जो रोगजनकों के लिए तेज, विशिष्ट और संवेदनशील नैदानिक विधियों के विकास में कार्यरत है।अब, इस प्रणाली में ब्याज के विभिन्न नमूनों में आरएनए या डीएनए लक्ष्यों का पता लगाने के लिए पूरक और पूरक हैं। वर्तमान प्रयोगात्मक चुनौतियों में एम्प्लिकॉन संदूषण और प्राथमिक सेल के परिणामस्वरूप गैर-लक्ष्य प्रवर्धन को रोकना शामिल है, विशेष रूप से लंबे प्राइमरों के साथ डिमर गठन के लिए प्रवण है। इसके अतिरिक्त, हम डाई में एक नेत्रहीन अलग रंग परिवर्तन को प्राप्त करने के लिए इष्टतम प्रतिक्रिया की स्थिति निर्धारित करने का लक्ष्य रखते हैं।एक बार जब यह मानकीकृत और पूरी तरह से मान्य हो जाता है, तो इस पद्धति को आसानी से लागू किया जा सकता है और लगभग किसी भी रोगज़नक़ का पता लगाने के लिए कम लागत पर और सस्ते उपकरणों का उपयोग करके 60 मिनट के भीतर किसी भी प्रयोगशाला या पॉइंट-ऑफ-केयर के अनुकूल बनाया जा सकता है। इस प्रकार, यह संभावित रूप से प्राथमिक देखभाल केंद्रों में समय पर, महामारी विज्ञान निगरानी करने के लिए उपयोग किया जा सकता है। हमारा बहु-विषयक समूह देशी कोलंबिया पौधों से अणुओं की खोज पर केंद्रित है, जो डेंगू, जीका, या SARS-COVID-2 जैसे वायरस की प्रतिकृति को रोकने की क्षमता की पहचान करने की कोशिश कर रहा है।इसके अलावा, हम इन वायरस के लिए आणविक नैदानिक विधियों को विकसित करने के लिए अध्ययन कर रहे हैं।

detecting-sars-cov-2-virus-reverse-transcription-loop-mediated

Research

JoVE Journal

Biology

Detecting SARS-CoV-2 Virus by Reverse Transcription-Loop-Mediated Isothermal Amplification

The severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) virus has dramatically impacted human health. It continues to be a threat to modern society because many people die as a result of infection. The disease is diagnosed using serologic and molecular tests, such as the gold standard real-time polymerase chain reaction (RT-PCR). The last has several disadvantages because it requires specialized infrastructure, costly equipment, and trained personnel. Here, we present a protocol outlining the steps required to detect the SARS-CoV-2 virus using reverse transcription-loop-mediated isothermal amplification (RT-LAMP) in human samples. The protocol includes instructions for designing primers in silico, preparing reagents, amplification, and visualization. Once standardized, this method can be easily implemented and adapted to any laboratory or point-of-care within 60 min at a low cost and using inexpensive equipment. It is adaptable to detecting different pathogens. Thus, it can potentially be used in the field and in health centers to carry out timely epidemiological surveillance.

Here we provide a complete protocol to standardize and implement the method for detecting the SARS-CoV-2 virus in human samples by reverse transcription loop-mediated isothermal amplification (RT-LAMP). This method, done within 60 min, could be adapted to any laboratory or point-of-care at a low cost and using inexpensive equipment.

Reverse Transcriptase-Loop Mediated Isothermal Amplification Reaction (RT-LAMP) for SARS-CoV-2 Detection

To begin, switch on the laminar airflow cabinet, allowing it to stabilize for three minutes. Aseptically clean and sanitize the cabinet's internal surfaces using the following disinfection agents. After disinfecting any material that will enter the cabinet, place napkins and nitrile gloves into the cabinet.Then switch off the cabinet and expose it to ultraviolet light for 15 minutes. After the irradiation, restart the cabinet. Place the primer design reagents in an ice-filled cooler.After sanitizing it with 70%ethanol, place the container inside the cabinet. Prepare the loop mediated isothermal amplification, or LAMP mix, in a 0.6 milliliter microcentrifuge tube. Pipette the mixture to homogenize it.Next, incubate the closed tubes in a heating block at 95 degrees Celsius for five minutes. Then cool the tubes in an ice-filled polystyrene cooler for five minutes. After cooling, place the tubes in the laminar flow cabinet.To complete the LAMP mix, add four microliters of DNA polymerase, followed by one microliter of reverse transcriptase. To perform colorimetric detection, add the dihydroxynaphthol blue. After reagent addition, pipette each solution to properly mix the LAMP reagents.Next, pipette 22 microliters of the solution into PCR tubes, being careful not to create bubbles. For the negative control, add three microliters of 0.1%diethyl pyrocarbonate water. Keep aside any remaining tubes for the addition of genetic material.Next, remove all materials from the cabinet. After sanitizing the cabinet surfaces with 70%ethanol, shut it off. In a separate area, add three microliters of the sample to each PCR tube and pipette well with a 20 microliter micropipette to thoroughly homogenize.Before initiating the colorimetric reaction, use a high quality camera to take pictures of the PCR tubes. Now, carry out the reaction using a thermal cycler and a water bath. For the thermal cycler, place the tubes into the reaction block and set up thermo profile on the equipment.If using the water bath, securely place the tubes in circular containers, then place these containers in the water bath at 66.3 degrees Celsius for 60 minutes. After the reaction time, remove the tubes and store them at four degrees Celsius until use. If a colorimetric reaction was performed, capture images of the PCR with a high quality camera.A temperature gradient demonstrated that the optimal melting temperature was 66.3 degrees Celsius. The concentration of BST 3.0 enzyme was optimized to 3.2 international units per microliter. To define the colorimetric strategy, phenol red in neutral red dyes were evaluated.However, no color change was observed after amplification. Standardization of different concentrations of hydroxynaphthol blue was performed with the optimum change occurring with 125 micromoles of hydroxynaphthol blue. The amplified samples demonstrated a change in the color in accordance with their concentration.Sample amplification was further confirmed by electrophoresis.