Name: Autore in primo piano: Avanzamento della diagnostica dei patogeni con la LAMP standardizzata
Uploaded: 2023-09-08T13:55:00
Description: Read this Scientific Article Protocol about Author Spotlight: Advancing Pathogen Diagnostics with Standardized LAMP at JoVE.com

Questo lavoro è stato finanziato dal Sistema General de Regalías della Colombia, sovvenzione numero BPIN 2020000100092, e dall'Universidad Icesi - Convocatoria Interna, sovvenzione numero CA0413119. MFVT è stato finanziato anche dai fondi per le cattedre assistenziali dell'Universidad de los Andes. Gli enti finanziatori non hanno partecipato alla progettazione, all'esecuzione delle attività, alla raccolta dei dati, all'analisi dei dati e alla preparazione del manoscritto. Ringraziamo l'Ospedale Universitario Fundación Valle del Lili per l'RNA virale da campioni di Sars-CoV-2 e il Dr. Alvaro Barrera-Ocampo per i commenti sul manoscritto.

I campioni utilizzati sono stati forniti dal laboratorio clinico dell'ospedale universitario Fundación Valle del Lili e corrispondevano all'RNA purificato di pazienti risultati positivi al COVID-19 utilizzando la tecnica RT-qPCR. Tutti i pazienti hanno fornito il consenso informato per la ricerca e questo studio è stato approvato dal comitato bioetico per gli studi sull'uomo dell'ospedale universitario Fundación Valle del Lili.
1. Progettazione e preparazione del primer RT-LAMP</stron...

Utilizzo dell'analisi colorimetrica e RT-LAMP per rilevare SARS-CoV-2 

<ol>
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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=COVID-19+in+Latin+America:+Contrasting+phylodynamic+inference+with+epidemiological+surveillance.+(Molecular+epidemiology+of+COVID-19+in+Latin+America).">COVID-19 in Latin America: Contrasting phylodynamic inference with epidemiological surveillance. (Molecular epidemiology of COVID-19 in Latin America).</a> medRxiv. , (2020).</li><li>Liu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Positive+rate+of+RT-PCR+detection+of+SARS-CoV-2+infection+in+4880+cases+from+one+hospital+in+Wuhan,+China,+from+Jan+to+Feb+2020.">Positive rate of RT-PCR detection of SARS-CoV-2 infection in 4880 cases from one hospital in Wuhan, China, from Jan to Feb 2020.</a> Clinica Chimica Acta. 505, 172-175 (2020).</li><li>Kevadiya, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnostics+for+SARS-CoV-2+infections.">Diagnostics for SARS-CoV-2 infections.</a> Nature Materials. 20 (5), 593-605 (2021).</li><li>Tomita, N., Mori, Y., Kanda, H., Notomi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loop-mediated+isothermal+amplification+(LAMP)+of+gene+sequences+and+simple+visual+detection+of+products.">Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) of gene sequences and simple visual detection of products.</a> Nature Protocols. 3 (5), 877-882 (2008).</li><li>Li, Y., Fan, P., Zhou, S., Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loop-mediated+isothermal+amplification+(LAMP):+A+novel+rapid+detection+platform+for+pathogens.">Loop-mediated isothermal amplification (LAMP): A novel rapid detection platform for pathogens.</a> Microbial Pathogenesis. 107, 54-61 (2017).</li><li>Notomi, T., Mori, Y., Tomita, N., Kanda, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loop-mediated+isothermal+amplification+(LAMP):+principle,+features,+and+future+prospects.">Loop-mediated isothermal amplification (LAMP): principle, features, and future prospects.</a> Journal of Microbiology. 53 (1), 1-5 (2015).</li><li>Augustine, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loop-mediated+isothermal+amplification+(LAMP):+A+rapid,+sensitive,+specific,+and+cost-effective+point-of-care+test+for+coronaviruses+in+the+context+of+COVID-19+pandemic.">Loop-mediated isothermal amplification (LAMP): A rapid, sensitive, specific, and cost-effective point-of-care test for coronaviruses in the context of COVID-19 pandemic.</a> Biology (Basel). 9 (8), 182 (2020).</li><li>. Nextstrain Available from: <a target="_blank" href="https://nextstrain.org/">https://nextstrain.org/</a> (2023)</li><li>. Neb Lamp, NEB LAMP Available from: <a target="_blank" href="https://lamp.neb.com/">https://lamp.neb.com/</a> (2023)</li><li>. Blast: Basic local alignment search tool (no date) Available from: <a target="_blank" href="https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/">https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/</a> (2023)</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+molecular+detection+of+SARS-CoV-2+(COVID-19)+virus+RNA+using+colorimetric+LAMP.">Rapid molecular detection of SARS-CoV-2 (COVID-19) virus RNA using colorimetric LAMP.</a> medRxiv. , (2020).</li><li>Lu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+novel+reverse+transcription+loop-mediated+isothermal+amplification+method+for+rapid+detection+of+SARS-CoV-2.">Development of a novel reverse transcription loop-mediated isothermal amplification method for rapid detection of SARS-CoV-2.</a> Virologica Sinica. 35 (3), 344-347 (2020).</li><li>Najafov, A., Hoxhaj, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> PCR Guru. , (2017).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancing+colorimetric+loop-mediated+isothermal+amplification+speed+and+sensitivity+with+guanidine+chloride.">Enhancing colorimetric loop-mediated isothermal amplification speed and sensitivity with guanidine chloride.</a> Biotechniques. 69 (3), 178-185 (2020).</li><li>Ram&#237;rez-Chavarr&#237;a, R. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automatic+analysis+of+isothermal+amplification+via+impedance+time-constant-domain+spectroscopy:+A+SARS-CoV-2+case+study.">Automatic analysis of isothermal amplification via impedance time-constant-domain spectroscopy: A SARS-CoV-2 case study.</a> Chemosensors. 11 (4), 230 (2023).</li><li>Haque, M. F. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+RdRp-based+colorimetric+RT-LAMP+assay+for+rapid+and+sensitive+detection+of+SARS-CoV-2+in+clinical+and+sewage+samples+from+Pakistan.">A novel RdRp-based colorimetric RT-LAMP assay for rapid and sensitive detection of SARS-CoV-2 in clinical and sewage samples from Pakistan.</a> Virus Research. 302, 198484 (2021).</li><li>Donia, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+RT-LAMP+and+microfluidic+technology+for+detection+of+SARS-CoV-2+in+wastewater+as+an+advanced+point-of-care+platform.">Integration of RT-LAMP and microfluidic technology for detection of SARS-CoV-2 in wastewater as an advanced point-of-care platform.</a> Food and Environmental Virology. 14, 364-373 (2022).</li></ol>

Sebbene l'RT-LAMP sia considerato una metodologia complementare per l'esecuzione della diagnostica molecolare, presenta anche alcune limitazioni e passaggi critici che devono essere considerati quando il protocollo viene standardizzato e implementato.
La standardizzazione LAMP per la rilevazione di SARS-CoV-2 ha valutato i seguenti parametri e componenti nella miscela master: (a) concentrazione e temperatura di allineamento dei primer; b) concentrazione degli enzimi; c) concentrazione di magne...

La sindrome respiratoria acuta grave coronavirus 2 (SARS-CoV-2) causa la malattia da coronavirus 2019 (COVID-19). Il 30 gennaio 2020 l'Organizzazione mondiale della sanità ha dichiarato un'emergenza sanitaria pubblica di rilevanza internazionale e l'11 marzo 2020 una pandemia. La pandemia ha provocato oltre 760 milioni di casi e 6,87 milioni di decessi alla data di stesura di questo articolo1.
L'impatto di questo virus ha evidenziato la necessità di strumenti di sorveglianza migliori, più accurati, più veloci e più ampiamente disponibili per migliorare l'individuazione e il controllo delle malattie infettive 2,3. Durante la pandemia, i test diagnostici SARS-CoV-2 si basavano sul rilevamento di acido nucleico, anticorpi e proteine, ma il rilevamento RT-PCR dell'acido nucleico è il gold standard4. Tuttavia, la RT-PCR presenta alcune limitazioni; Richiede attrezzature specializzate, infrastrutture e personale addestrato in biologia molecolare, limitando la sua applicazione a laboratori specializzati. Inoltre, richiede molto tempo (4-6 ore), escluso il tempo per trasportare i campioni in laboratorio, che può richiedere giorni5. Questi vincoli impediscono un'elaborazione efficiente dei campioni e l'ottenimento delle informazioni necessarie per la pianificazione di emergenza e la gestione epidemiologica.
L'amplificazione isotermica mediata da loop di trascrizione inversa (RT-LAMP) presenta diversi vantaggi rispetto alla RT-PCR, rendendola una strategia interessante per la progettazione di futuri test diagnostici point-of-care (POCT), in particolare in contesti con risorse limitate6. In primo luogo, è molto specifico perché utilizza tra i quattro e i sei primer che riconoscono da sei a otto aree nella sequenza bersaglio, sia che si tratti di DNA o RNA 7,8. In secondo luogo, poiché funziona a temperatura costante, non richiede apparecchiature sofisticate come termociclatori in tempo reale per generare l'amplificazione, né richiede personale altamente qualificato per farla funzionare. In terzo luogo, il tempo di reazione è molto breve (~60 min) e vengono impiegati reagenti non molto specializzati, il che lo rende uno strumento conveniente6. Alla luce di quanto sopra e dell'emergenza sanitaria causata dalla pandemia di COVID-19, questa tecnica può essere vista come un metodo diagnostico alternativo rapido, economico e semplice da implementare in qualsiasi laboratorio di ricerca9.
Il protocollo per la standardizzazione e l'implementazione di una RT-LAMP per rilevare SARS-CoV-2 con metodi colorimetrici utilizzando un termociclatore e un bagno d'acqua è descritto in questo articolo (Figura 1). Vengono discussi i punti critici, i loro limiti e le alternative per farli avanzare.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65662/65662fig01.jpg"> Figura 1: Schema del protocollo per l'amplificazione di SARS-CoV-2 utilizzando la tecnica RT-LAMP. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65662/65662fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 kb DNA Ladder</td>
			<td>SOLIS BIODYNE</td>
			<td>07-12-00050</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50x TAE Electrophoresis Buffer</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>B49</td>
			<td>Store at roome temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accuris High Fidelity Polymerase</td>
			<td>ACCURIS LIFE SCIENCE REAGENTS</td>
			<td>PR1000-HF-200</td>
			<td>It can be used in case Q5 High-Fidelity DNA polymerase cannot be purchased. For the enzyme, make aliquots of an appropriate volume and store at -20 &#176;C until use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>PanReacAppliChem</td>
			<td>A8963,0100</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bst 3.0 DNA Polymerase 8000 IU/mL</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0374S/M0374L</td>
			<td>For the enzyme, make aliquots of an appropriate volume and store at -20 &#176;C until use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxynucleotide (dNTP) Solution Set</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>N0446S</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diethyl pyrocarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>159220-25G&#160;</td>
			<td>Handle it with caution under an extraction cabinet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneRuler 100 bp Plus DNA Ladder, ready-to-use</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>SM0322</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydroxy naphthol blue disodium salt</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-215156B</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q5 High-Fidelity DNA polymerase 2000 IU/mL&#160;</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0491S/M0491L</td>
			<td>For the enzyme, make aliquots of an appropriate volume and store at -20 &#176;C until use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WarmStart RTx Reverse Transcriptase 15000 IU/mL</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0380S/M0380L</td>
			<td>For the enzyme, make aliquots of an appropriate volume and store at -20 &#176;C until use.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detecting sars-cov-2 virus by reverse transcription-loop-mediated isothermal amplification

Il virus della sindrome respiratoria acuta grave coronavirus 2 (SARS-CoV-2) ha avuto un impatto drammatico sulla salute umana. Continua a essere una minaccia per la società moderna perché molte persone muoiono a causa dell'infezione. La malattia viene diagnosticata utilizzando test sierologici e molecolari, come la reazione a catena della polimerasi in tempo reale (RT-PCR). Quest'ultimo presenta diversi svantaggi perché richiede infrastrutture specializzate, attrezzature costose e personale qualificato. Qui, presentiamo un protocollo che delinea i passaggi necessari per rilevare il virus SARS-CoV-2 utilizzando l'amplificazione isotermica mediata da loop di trascrizione inversa (RT-LAMP) in campioni umani. Il protocollo include istruzioni per la progettazione di primer in silico, la preparazione dei reagenti, l'amplificazione e la visualizzazione. Una volta standardizzato, questo metodo può essere facilmente implementato e adattato a qualsiasi laboratorio o punto di cura entro 60 minuti a basso costo e utilizzando attrezzature poco costose. È adattabile al rilevamento di diversi agenti patogeni. Pertanto, può potenzialmente essere utilizzato sul campo e nei centri sanitari per effettuare una sorveglianza epidemiologica tempestiva.

The severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) causes coronavirus disease 2019 (COVID-19). The World Health Organization declared a public health emergency of international concern on 30 January 2020 and a pandemic on 11 March 2020. The pandemic resulted in over 760 million cases and 6.87 million deaths as of the date this article was written1.
The impact of this virus has highlighted the need for better, more accurate, faster, and more widely available surveillance tools to improve infectious disease detection and control2,3. During the pandemic, SARS-CoV-2 diagnostic tests were based on detecting nucleic acid, antibodies, and proteins, but RT-PCR detection of nucleic acid is the gold standard4. However, RT-PCR has some limitations; it requires specialized equipment, infrastructure, and personnel trained in molecular biology, limiting its application to specialized laboratories. Further, it is time-consuming (4-6 h), not including the time to transport the specimens to the laboratory, which can take days5. These constraints prevent efficient sample processing and obtaining the information required for contingency planning and epidemiological management.
Reverse transcription-loop-mediated isothermal amplification (RT-LAMP) has several advantages over RT-PCR, making it an appealing strategy for designing future point-of-care diagnostic tests (POCT), particularly in resource-constrained settings6. First, it is greatly specific because it uses between four and six primers that recognize six to eight areas in the target sequence, be it DNA or RNA7,8. Second, because it operates at a constant temperature, it does not require sophisticated equipment such as real-time thermal cyclers to generate the amplification, nor does it necessitate highly trained personnel to operate it. Third, the reaction time is very short (~60 min), and reagents that are not very specialized are employed, which makes it a cost-effective tool6. Given the foregoing and the health emergency caused by the COVID-19 pandemic, this technique can be viewed as an alternative diagnostic method that is quick, inexpensive, and simple to implement in any research laboratory9.
The protocol for standardizing and implementing an RT-LAMP to detect SARS-CoV-2 by colorimetric methods using a thermocycler and a water bath is described in this article (Figure 1). Critical points, their limitations, and alternatives to advance them are discussed.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65662/65662fig01.jpg" /> 
Figure 1: Scheme of the protocol for amplifying SARS-CoV-2 using the RT-LAMP technique. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65662/65662fig01large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>

Autore in primo piano: Avanzamento della diagnostica dei patogeni con la LAMP standardizzata

Rilevamento del virus SARS-CoV-2 mediante amplificazione isotermica mediata da loop di trascrizione inversa

Our research aims to standardize LAMP as a prediagnostic test, suitable for field or primary care settings lacking advanced laboratory infrastructure. We seek to promote the use of locally-producible buffers and alternative dyes, reducing dependence on imported commercial kits. Currently, CRISPR-Cas is an efficient system employed in the development of fast, specific, and sensitive diagnostic methods for pathogens.Now, this system has a broad range of and supplements to detect RNA or DNA targets in different samples of interest. The current experimental challenges involve preventing non-target amplification resulting from amplicon contamination and primary cell especially with lengthy primers prone to dimer formation. Additionally, we aim to determine optimal reaction conditions to achieve a visually distinguishable color change in the dye.Once it's standardized and fully validated, this method can be easily implemented and adapt to any laboratory or point-of-care within 60 minutes, at low cost and using inexpensive equipment, to detect almost any pathogen. Thus, it can potentially be used in primary care centers to carry out timely, epidemiological surveillance. Our multidisciplinary group is focused on the discovery of molecules from native Colombia plants, trying to identify the potential to inhibit the replication of viruses such as dengue, Zika, or SARS-COVID-2.In addition, we are conducting studies to develop molecular diagnostic methods for these viruses.

L'implementazione del protocollo inizia con la progettazione del set di primer per ciascun gene bersaglio seguendo il protocollo sopra descritto. Nel giugno 2020, 5.000 genomi di SARS-CoV-2 sono stati ottenuti dal database NextStrain, con una rappresentatività del 10% dei genomi colombiani. Queste sequenze sono state allineate per ottenere la sequenza di consenso utilizzata nel processo di progettazione del primer. La tabella 1 mostra il set di primer scelto per i primer RdRp/Hel e RdRp. Il set di prime...

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Qui forniamo un protocollo completo per standardizzare e implementare il metodo per rilevare il virus SARS-CoV-2 in campioni umani mediante amplificazione isotermica mediata da loop di trascrizione inversa (RT-LAMP). Questo metodo, eseguito entro 60 minuti, potrebbe essere adattato a qualsiasi laboratorio o punto di cura a basso costo e utilizzando attrezzature poco costose.

The severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) virus has dramatically impacted human health. It continues to be a threat to modern ...

La nostra ricerca mira a standardizzare LAMP come test prediagnostico, adatto per ambienti di assistenza primaria o sul campo privi di infrastrutture di laboratorio avanzate. Cerchiamo di promuovere l'uso di tamponi producibili localmente e coloranti alternativi, riducendo la dipendenza dai kit commerciali importati. Attualmente, CRISPR-Cas è un sistema efficiente impiegato nello sviluppo di metodi diagnostici rapidi, specifici e sensibili per i patogeni.Ora, questo sistema dispone di un'ampia gamma di integratori per rilevare bersagli di RNA o DNA in diversi campioni di interesse. Le attuali sfide sperimentali riguardano la prevenzione dell'amplificazione non bersaglio derivante dalla contaminazione da ampliconi e cellule primarie, in particolare con primer lunghi inclini alla formazione di dimeri. Inoltre, miriamo a determinare le condizioni di reazione ottimali per ottenere un cambiamento di colore visivamente distinguibile nel colorante.Una volta standardizzato e completamente convalidato, questo metodo può essere facilmente implementato e adattato a qualsiasi laboratorio o punto di cura entro 60 minuti, a basso costo e utilizzando attrezzature poco costose, per rilevare quasi tutti gli agenti patogeni. Pertanto, può potenzialmente essere utilizzato nei centri di assistenza primaria per effettuare una sorveglianza epidemiologica tempestiva. Il nostro gruppo multidisciplinare si concentra sulla scoperta di molecole provenienti da piante autoctone della Colombia, cercando di identificare il potenziale per inibire la replicazione di virus come la dengue, Zika o SARS-COVID-2.Inoltre, stiamo conducendo studi per sviluppare metodi diagnostici molecolari per questi virus.

detecting-sars-cov-2-virus-reverse-transcription-loop-mediated

Research

JoVE Journal

Biology

Detecting SARS-CoV-2 Virus by Reverse Transcription-Loop-Mediated Isothermal Amplification

The severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) virus has dramatically impacted human health. It continues to be a threat to modern society because many people die as a result of infection. The disease is diagnosed using serologic and molecular tests, such as the gold standard real-time polymerase chain reaction (RT-PCR). The last has several disadvantages because it requires specialized infrastructure, costly equipment, and trained personnel. Here, we present a protocol outlining the steps required to detect the SARS-CoV-2 virus using reverse transcription-loop-mediated isothermal amplification (RT-LAMP) in human samples. The protocol includes instructions for designing primers in silico, preparing reagents, amplification, and visualization. Once standardized, this method can be easily implemented and adapted to any laboratory or point-of-care within 60 min at a low cost and using inexpensive equipment. It is adaptable to detecting different pathogens. Thus, it can potentially be used in the field and in health centers to carry out timely epidemiological surveillance.

Here we provide a complete protocol to standardize and implement the method for detecting the SARS-CoV-2 virus in human samples by reverse transcription loop-mediated isothermal amplification (RT-LAMP). This method, done within 60 min, could be adapted to any laboratory or point-of-care at a low cost and using inexpensive equipment.

Ricerca

Biologia

Reverse Transcriptase-Loop Mediated Isothermal Amplification Reaction (RT-LAMP) for SARS-CoV-2 Detection

To begin, switch on the laminar airflow cabinet, allowing it to stabilize for three minutes. Aseptically clean and sanitize the cabinet's internal surfaces using the following disinfection agents. After disinfecting any material that will enter the cabinet, place napkins and nitrile gloves into the cabinet.Then switch off the cabinet and expose it to ultraviolet light for 15 minutes. After the irradiation, restart the cabinet. Place the primer design reagents in an ice-filled cooler.After sanitizing it with 70%ethanol, place the container inside the cabinet. Prepare the loop mediated isothermal amplification, or LAMP mix, in a 0.6 milliliter microcentrifuge tube. Pipette the mixture to homogenize it.Next, incubate the closed tubes in a heating block at 95 degrees Celsius for five minutes. Then cool the tubes in an ice-filled polystyrene cooler for five minutes. After cooling, place the tubes in the laminar flow cabinet.To complete the LAMP mix, add four microliters of DNA polymerase, followed by one microliter of reverse transcriptase. To perform colorimetric detection, add the dihydroxynaphthol blue. After reagent addition, pipette each solution to properly mix the LAMP reagents.Next, pipette 22 microliters of the solution into PCR tubes, being careful not to create bubbles. For the negative control, add three microliters of 0.1%diethyl pyrocarbonate water. Keep aside any remaining tubes for the addition of genetic material.Next, remove all materials from the cabinet. After sanitizing the cabinet surfaces with 70%ethanol, shut it off. In a separate area, add three microliters of the sample to each PCR tube and pipette well with a 20 microliter micropipette to thoroughly homogenize.Before initiating the colorimetric reaction, use a high quality camera to take pictures of the PCR tubes. Now, carry out the reaction using a thermal cycler and a water bath. For the thermal cycler, place the tubes into the reaction block and set up thermo profile on the equipment.If using the water bath, securely place the tubes in circular containers, then place these containers in the water bath at 66.3 degrees Celsius for 60 minutes. After the reaction time, remove the tubes and store them at four degrees Celsius until use. If a colorimetric reaction was performed, capture images of the PCR with a high quality camera.A temperature gradient demonstrated that the optimal melting temperature was 66.3 degrees Celsius. The concentration of BST 3.0 enzyme was optimized to 3.2 international units per microliter. To define the colorimetric strategy, phenol red in neutral red dyes were evaluated.However, no color change was observed after amplification. Standardization of different concentrations of hydroxynaphthol blue was performed with the optimum change occurring with 125 micromoles of hydroxynaphthol blue. The amplified samples demonstrated a change in the color in accordance with their concentration.Sample amplification was further confirmed by electrophoresis.