Name: 저자 스포트라이트: Advancing Pathogen Diagnostics with Standardized LAMP(표준화된 LAMP를 통한 병원균 진단의 발전)
Uploaded: 2023-09-08T13:55:00
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이 연구는 콜롬비아의 Sistema General de Regalías(보조금 번호 BPIN 2020000100092)와 Universidad Icesi - Convocatoria Interna(보조금 번호 CA0413119)의 지원을 받았습니다. MFVT는 또한 Universidad de los Andes의 조교수 기금으로 자금을 지원받았습니다. 자금 지원 기관은 설계, 활동 실행, 데이터 수집, 데이터 분석 및 원고 준비에 참여하지 않았습니다. Sars -CoV-2 샘플의 바이러스 RNA를 제공해 준 Fundación Valle del Lili 대학병원과 원고에 대한 의견을 제시해 준 Dr. Alvaro Barrera-Ocampo에게 감사드립니다.

사용된 샘플은 Fundación Valle del Lili University 병원의 임상 실험실에서 제공되었으며 RT-qPCR 기술을 사용하여 COVID-19 양성 반응을 보인 환자의 정제된 RNA와 일치했습니다. 모든 환자는 연구에 대한 사전 동의를 제공했으며, 이 연구는 Fundación Valle del Lili University 병원의 인간 연구를 위한 생명윤리 위원회의 승인을 받았습니다.
1. RT-LAMP 프라이머 설계 및 준비
<p class="j...

SARS-CoV-2를 검출하기 위해 비색 및 RT-LAMP 분석 사용 

<ol>
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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=COVID-19+in+Latin+America:+Contrasting+phylodynamic+inference+with+epidemiological+surveillance.+(Molecular+epidemiology+of+COVID-19+in+Latin+America).">COVID-19 in Latin America: Contrasting phylodynamic inference with epidemiological surveillance. (Molecular epidemiology of COVID-19 in Latin America).</a> medRxiv. , (2020).</li><li>Liu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Positive+rate+of+RT-PCR+detection+of+SARS-CoV-2+infection+in+4880+cases+from+one+hospital+in+Wuhan,+China,+from+Jan+to+Feb+2020.">Positive rate of RT-PCR detection of SARS-CoV-2 infection in 4880 cases from one hospital in Wuhan, China, from Jan to Feb 2020.</a> Clinica Chimica Acta. 505, 172-175 (2020).</li><li>Kevadiya, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnostics+for+SARS-CoV-2+infections.">Diagnostics for SARS-CoV-2 infections.</a> Nature Materials. 20 (5), 593-605 (2021).</li><li>Tomita, N., Mori, Y., Kanda, H., Notomi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loop-mediated+isothermal+amplification+(LAMP)+of+gene+sequences+and+simple+visual+detection+of+products.">Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) of gene sequences and simple visual detection of products.</a> Nature Protocols. 3 (5), 877-882 (2008).</li><li>Li, Y., Fan, P., Zhou, S., Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loop-mediated+isothermal+amplification+(LAMP):+A+novel+rapid+detection+platform+for+pathogens.">Loop-mediated isothermal amplification (LAMP): A novel rapid detection platform for pathogens.</a> Microbial Pathogenesis. 107, 54-61 (2017).</li><li>Notomi, T., Mori, Y., Tomita, N., Kanda, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loop-mediated+isothermal+amplification+(LAMP):+principle,+features,+and+future+prospects.">Loop-mediated isothermal amplification (LAMP): principle, features, and future prospects.</a> Journal of Microbiology. 53 (1), 1-5 (2015).</li><li>Augustine, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loop-mediated+isothermal+amplification+(LAMP):+A+rapid,+sensitive,+specific,+and+cost-effective+point-of-care+test+for+coronaviruses+in+the+context+of+COVID-19+pandemic.">Loop-mediated isothermal amplification (LAMP): A rapid, sensitive, specific, and cost-effective point-of-care test for coronaviruses in the context of COVID-19 pandemic.</a> Biology (Basel). 9 (8), 182 (2020).</li><li>. 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G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automatic+analysis+of+isothermal+amplification+via+impedance+time-constant-domain+spectroscopy:+A+SARS-CoV-2+case+study.">Automatic analysis of isothermal amplification via impedance time-constant-domain spectroscopy: A SARS-CoV-2 case study.</a> Chemosensors. 11 (4), 230 (2023).</li><li>Haque, M. F. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+RdRp-based+colorimetric+RT-LAMP+assay+for+rapid+and+sensitive+detection+of+SARS-CoV-2+in+clinical+and+sewage+samples+from+Pakistan.">A novel RdRp-based colorimetric RT-LAMP assay for rapid and sensitive detection of SARS-CoV-2 in clinical and sewage samples from Pakistan.</a> Virus Research. 302, 198484 (2021).</li><li>Donia, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+RT-LAMP+and+microfluidic+technology+for+detection+of+SARS-CoV-2+in+wastewater+as+an+advanced+point-of-care+platform.">Integration of RT-LAMP and microfluidic technology for detection of SARS-CoV-2 in wastewater as an advanced point-of-care platform.</a> Food and Environmental Virology. 14, 364-373 (2022).</li></ol>

RT-LAMP는 분자 진단을 수행하기 위한 보완적인 방법론으로 간주되지만, 프로토콜을 표준화하고 구현할 때 고려해야 하는 몇 가지 제한 사항과 중요한 단계도 있습니다.
SARS-CoV-2 검출을 위한 LAMP 표준화는 마스터 믹스에서 다음 매개변수와 구성 요소를 평가했습니다: (a) 프라이머의 농도 및 정렬 온도; (b) 효소의 농도; (c) 마그네슘 농도; (d) 반응 시간; (e) BSA, DMSO, 구아니디늄 클?...

중증 급성 호흡기 증후군 코로나 바이러스 2 (SARS-CoV-2)는 코로나 바이러스 질병 2019 (COVID-19)를 유발합니다. 세계보건기구(WHO)는 2020년 1월 30일 국제적 공중보건 비상사태를, 2020년 3월 11일 팬데믹을 선포했습니다. 팬데믹으로 인해 이 기사가 작성된 시점을 기준으로 7억 6천만 명 이상의 확진자와 687만 명의 사망자가 발생했습니다1.
이 바이러스의 영향은 전염병 탐지 및 통제를 개선하기 위해 더 우수하고, 더 정확하고, 더 빠르고, 더 널리 사용 가능한 감시 도구의 필요성을 강조했습니다 2,3. 팬데믹 기간 동안 SARS-CoV-2 진단 검사는 핵산, 항체 및 단백질 검출을 기반으로 했지만 핵산의 RT-PCR 검출이 황금 표준입니다4. 그러나 RT-PCR에는 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 분자 생물학 교육을 받은 특수 장비, 인프라 및 인력이 필요하므로 전문 실험실로 적용이 제한됩니다. 또한 표본을 실험실로 운반하는 데 걸리는 시간을 제외하고 시간이 많이 소요되며(4-6시간) 며칠이 걸릴 수 있습니다5. 이러한 제약으로 인해 효율적인 검체 처리와 비상 계획 및 역학 관리에 필요한 정보를 얻을 수 없습니다.
RT-LAMP(Reverse Transcription-Loop-Mediated Isothermal Amplification)는 RT-PCR에 비해 몇 가지 장점이 있어 특히 자원이 제한된 환경에서 미래의 POCT(point-of-care diagnostic test)를 설계하는 데 매력적인 전략이 된다6. 첫째, 표적 서열에서 6-8개의 영역, 즉 DNA또는 RNA 7,8을 인식하는 4-6개의 프라이머를 사용하기 때문에 매우 특이적입니다. 둘째, 일정한 온도에서 작동하기 때문에 증폭을 생성하기 위해 실시간 열 순환기와 같은 정교한 장비가 필요하지 않으며 이를 작동하기 위해 고도로 훈련된 인력이 필요하지 않습니다. 셋째, 반응 시간이 매우 짧고(~60분) 매우 전문화되지 않은 시약이 사용되어 비용 효율적인 도구입니다6. 앞서 언급한 바와 COVID-19 팬데믹으로 인한 보건 비상 사태를 감안할 때, 이 기법은 모든 연구 실험실에서 빠르고 저렴하며 간단하게 구현할 수 있는 대체 진단 방법으로 볼 수 있다9.
이 기사에서는 열순환기와 수조를 사용하여 비색 방법으로 SARS-CoV-2를 검출하기 위해 RT-LAMP를 표준화하고 구현하기 위한 프로토콜에 대해 설명합니다(그림 1). 임계점, 한계 및 이를 발전시키기 위한 대안에 대해 논의합니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65662/65662fig01.jpg"> 그림 1: RT-LAMP 기법을 사용하여 SARS-CoV-2를 증폭하기 위한 프로토콜 체계. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65662/65662fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 kb DNA Ladder</td>
			<td>SOLIS BIODYNE</td>
			<td>07-12-00050</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50x TAE Electrophoresis Buffer</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>B49</td>
			<td>Store at roome temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accuris High Fidelity Polymerase</td>
			<td>ACCURIS LIFE SCIENCE REAGENTS</td>
			<td>PR1000-HF-200</td>
			<td>It can be used in case Q5 High-Fidelity DNA polymerase cannot be purchased. For the enzyme, make aliquots of an appropriate volume and store at -20 &#176;C until use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>PanReacAppliChem</td>
			<td>A8963,0100</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bst 3.0 DNA Polymerase 8000 IU/mL</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0374S/M0374L</td>
			<td>For the enzyme, make aliquots of an appropriate volume and store at -20 &#176;C until use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxynucleotide (dNTP) Solution Set</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>N0446S</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diethyl pyrocarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>159220-25G&#160;</td>
			<td>Handle it with caution under an extraction cabinet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneRuler 100 bp Plus DNA Ladder, ready-to-use</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>SM0322</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydroxy naphthol blue disodium salt</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-215156B</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q5 High-Fidelity DNA polymerase 2000 IU/mL&#160;</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0491S/M0491L</td>
			<td>For the enzyme, make aliquots of an appropriate volume and store at -20 &#176;C until use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WarmStart RTx Reverse Transcriptase 15000 IU/mL</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0380S/M0380L</td>
			<td>For the enzyme, make aliquots of an appropriate volume and store at -20 &#176;C until use.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detecting sars-cov-2 virus by reverse transcription-loop-mediated isothermal amplification

중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스 2(SARS-CoV-2) 바이러스는 인간의 건강에 큰 영향을 미쳤습니다. 많은 사람들이 감염으로 사망하기 때문에 현대 사회에 계속 위협이 되고 있습니다. 이 질병은 황금 표준 실시간 중합효소 연쇄 반응(RT-PCR)과 같은 혈청학적 및 분자 검사를 사용하여 진단됩니다. 마지막은 전문 인프라, 값비싼 장비 및 숙련된 인력이 필요하기 때문에 몇 가지 단점이 있습니다. 여기에서는 인간 샘플에서 RT-LAMP(reverse transcription-loop-mediated isothermal amplification)를 사용하여 SARS-CoV-2 바이러스를 검출하는 데 필요한 단계를 설명하는 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜에는 silico에서 프라이머를 설계하고, 시약을 준비하고, 증폭 및 시각화하기 위한 지침이 포함되어 있습니다. 표준화되면 이 방법은 저렴한 비용과 저렴한 장비를 사용하여 60분 이내에 모든 실험실 또는 현장 진료에 쉽게 구현하고 적용할 수 있습니다. 다양한 병원체를 감지하는 데 적응할 수 있습니다. 따라서 현장 및 보건소에서 적시에 역학 감시를 수행하는 데 잠재적으로 사용될 수 있습니다.

The severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) causes coronavirus disease 2019 (COVID-19). The World Health Organization declared a public health emergency of international concern on 30 January 2020 and a pandemic on 11 March 2020. The pandemic resulted in over 760 million cases and 6.87 million deaths as of the date this article was written1.
The impact of this virus has highlighted the need for better, more accurate, faster, and more widely available surveillance tools to improve infectious disease detection and control2,3. During the pandemic, SARS-CoV-2 diagnostic tests were based on detecting nucleic acid, antibodies, and proteins, but RT-PCR detection of nucleic acid is the gold standard4. However, RT-PCR has some limitations; it requires specialized equipment, infrastructure, and personnel trained in molecular biology, limiting its application to specialized laboratories. Further, it is time-consuming (4-6 h), not including the time to transport the specimens to the laboratory, which can take days5. These constraints prevent efficient sample processing and obtaining the information required for contingency planning and epidemiological management.
Reverse transcription-loop-mediated isothermal amplification (RT-LAMP) has several advantages over RT-PCR, making it an appealing strategy for designing future point-of-care diagnostic tests (POCT), particularly in resource-constrained settings6. First, it is greatly specific because it uses between four and six primers that recognize six to eight areas in the target sequence, be it DNA or RNA7,8. Second, because it operates at a constant temperature, it does not require sophisticated equipment such as real-time thermal cyclers to generate the amplification, nor does it necessitate highly trained personnel to operate it. Third, the reaction time is very short (~60 min), and reagents that are not very specialized are employed, which makes it a cost-effective tool6. Given the foregoing and the health emergency caused by the COVID-19 pandemic, this technique can be viewed as an alternative diagnostic method that is quick, inexpensive, and simple to implement in any research laboratory9.
The protocol for standardizing and implementing an RT-LAMP to detect SARS-CoV-2 by colorimetric methods using a thermocycler and a water bath is described in this article (Figure 1). Critical points, their limitations, and alternatives to advance them are discussed.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65662/65662fig01.jpg" /> 
Figure 1: Scheme of the protocol for amplifying SARS-CoV-2 using the RT-LAMP technique. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65662/65662fig01large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>

저자 스포트라이트: Advancing Pathogen Diagnostics with Standardized LAMP(표준화된 LAMP를 통한 병원균 진단의 발전)

역전사 루프 매개 등온 증폭을 통한 SARS-CoV-2 바이러스 검출

Our research aims to standardize LAMP as a prediagnostic test, suitable for field or primary care settings lacking advanced laboratory infrastructure. We seek to promote the use of locally-producible buffers and alternative dyes, reducing dependence on imported commercial kits. Currently, CRISPR-Cas is an efficient system employed in the development of fast, specific, and sensitive diagnostic methods for pathogens.Now, this system has a broad range of and supplements to detect RNA or DNA targets in different samples of interest. The current experimental challenges involve preventing non-target amplification resulting from amplicon contamination and primary cell especially with lengthy primers prone to dimer formation. Additionally, we aim to determine optimal reaction conditions to achieve a visually distinguishable color change in the dye.Once it's standardized and fully validated, this method can be easily implemented and adapt to any laboratory or point-of-care within 60 minutes, at low cost and using inexpensive equipment, to detect almost any pathogen. Thus, it can potentially be used in primary care centers to carry out timely, epidemiological surveillance. Our multidisciplinary group is focused on the discovery of molecules from native Colombia plants, trying to identify the potential to inhibit the replication of viruses such as dengue, Zika, or SARS-COVID-2.In addition, we are conducting studies to develop molecular diagnostic methods for these viruses.

프로토콜의 구현은 위에서 설명한 프로토콜에 따라 각 타겟 유전자에 대한 프라이머 세트를 설계하는 것으로 시작됩니다. 2020년 6월, NextStrain 데이터베이스에서 5,000개의 SARS-CoV-2 게놈을 얻었으며 콜롬비아 게놈의 10%를 대표했습니다. 이러한 염기서열은 프라이머 설계 과정에서 사용된 합의 염기서열을 얻기 위해 정렬되었습니다. 표 1 은 프라이머 RdRp/Hel 및 RdRp에 대해 선택된 프라이?...

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여기에서는 RT-LAMP(reverse transcription loop-mediated isothermal amplification)를 통해 인간 샘플에서 SARS-CoV-2 바이러스를 검출하는 방법을 표준화하고 구현하기 위한 완전한 프로토콜을 제공합니다. 60분 이내에 완료되는 이 방법은 저렴한 비용과 저렴한 장비를 사용하여 모든 실험실이나 현장 진료에 적용할 수 있습니다.

The severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) virus has dramatically impacted human health. It continues to be a threat to modern ...

우리의 연구는 LAMP를 고급 실험실 인프라가 부족한 현장 또는 1차 진료 환경에 적합한 사전 진단 테스트로 표준화하는 것을 목표로 합니다. 우리는 현지에서 생산할 수 있는 완충액과 대체 염료의 사용을 촉진하여 수입 상업용 키트에 대한 의존도를 줄이고자 합니다. 현재 CRISPR-Cas는 병원체에 대한 빠르고 구체적이며 민감한 진단 방법을 개발하는 데 사용되는 효율적인 시스템입니다.이제 이 시스템에는 다양한 관심 샘플에서 RNA 또는 DNA 표적을 검출할 수 있는 광범위한 보충제가 있습니다. 현재의 실험적 과제는 앰플리콘 오염으로 인한 비표적 증폭을 방지하는 것과 관련이 있으며, 특히 이량체 형성이 발생하기 쉬운 긴 프라이머로 인한 일차 세포를 방지해야 합니다. 또한 염료에서 시각적으로 구별할 수 있는 색상 변화를 달성하기 위해 최적의 반응 조건을 결정하는 것을 목표로 합니다.일단 표준화되고 완전히 검증되면 이 방법은 쉽게 구현할 수 있으며 저렴한 장비를 사용하여 저렴한 장비를 사용하여 60분 이내에 모든 실험실 또는 현장 진료에 적용할 수 있어 거의 모든 병원체를 검출할 수 있습니다. 따라서 1차 진료 센터에서 적시에 역학 감시를 수행하는 데 잠재적으로 사용할 수 있습니다. 우리의 다학제 그룹은 콜롬비아 토착 식물에서 분자를 발견하는 데 중점을 두고 있으며, 뎅기열, 지카 또는 SARS-COVID-2와 같은 바이러스의 복제를 억제할 수 있는 잠재력을 식별하기 위해 노력하고 있습니다.또한 이러한 바이러스에 대한 분자 진단 방법을 개발하기 위한 연구를 진행하고 있습니다.

detecting-sars-cov-2-virus-reverse-transcription-loop-mediated

Research

JoVE Journal

Biology

Detecting SARS-CoV-2 Virus by Reverse Transcription-Loop-Mediated Isothermal Amplification

The severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) virus has dramatically impacted human health. It continues to be a threat to modern society because many people die as a result of infection. The disease is diagnosed using serologic and molecular tests, such as the gold standard real-time polymerase chain reaction (RT-PCR). The last has several disadvantages because it requires specialized infrastructure, costly equipment, and trained personnel. Here, we present a protocol outlining the steps required to detect the SARS-CoV-2 virus using reverse transcription-loop-mediated isothermal amplification (RT-LAMP) in human samples. The protocol includes instructions for designing primers in silico, preparing reagents, amplification, and visualization. Once standardized, this method can be easily implemented and adapted to any laboratory or point-of-care within 60 min at a low cost and using inexpensive equipment. It is adaptable to detecting different pathogens. Thus, it can potentially be used in the field and in health centers to carry out timely epidemiological surveillance.

Here we provide a complete protocol to standardize and implement the method for detecting the SARS-CoV-2 virus in human samples by reverse transcription loop-mediated isothermal amplification (RT-LAMP). This method, done within 60 min, could be adapted to any laboratory or point-of-care at a low cost and using inexpensive equipment.

연구

생물학

Reverse Transcriptase-Loop Mediated Isothermal Amplification Reaction (RT-LAMP) for SARS-CoV-2 Detection

To begin, switch on the laminar airflow cabinet, allowing it to stabilize for three minutes. Aseptically clean and sanitize the cabinet's internal surfaces using the following disinfection agents. After disinfecting any material that will enter the cabinet, place napkins and nitrile gloves into the cabinet.Then switch off the cabinet and expose it to ultraviolet light for 15 minutes. After the irradiation, restart the cabinet. Place the primer design reagents in an ice-filled cooler.After sanitizing it with 70%ethanol, place the container inside the cabinet. Prepare the loop mediated isothermal amplification, or LAMP mix, in a 0.6 milliliter microcentrifuge tube. Pipette the mixture to homogenize it.Next, incubate the closed tubes in a heating block at 95 degrees Celsius for five minutes. Then cool the tubes in an ice-filled polystyrene cooler for five minutes. After cooling, place the tubes in the laminar flow cabinet.To complete the LAMP mix, add four microliters of DNA polymerase, followed by one microliter of reverse transcriptase. To perform colorimetric detection, add the dihydroxynaphthol blue. After reagent addition, pipette each solution to properly mix the LAMP reagents.Next, pipette 22 microliters of the solution into PCR tubes, being careful not to create bubbles. For the negative control, add three microliters of 0.1%diethyl pyrocarbonate water. Keep aside any remaining tubes for the addition of genetic material.Next, remove all materials from the cabinet. After sanitizing the cabinet surfaces with 70%ethanol, shut it off. In a separate area, add three microliters of the sample to each PCR tube and pipette well with a 20 microliter micropipette to thoroughly homogenize.Before initiating the colorimetric reaction, use a high quality camera to take pictures of the PCR tubes. Now, carry out the reaction using a thermal cycler and a water bath. For the thermal cycler, place the tubes into the reaction block and set up thermo profile on the equipment.If using the water bath, securely place the tubes in circular containers, then place these containers in the water bath at 66.3 degrees Celsius for 60 minutes. After the reaction time, remove the tubes and store them at four degrees Celsius until use. If a colorimetric reaction was performed, capture images of the PCR with a high quality camera.A temperature gradient demonstrated that the optimal melting temperature was 66.3 degrees Celsius. The concentration of BST 3.0 enzyme was optimized to 3.2 international units per microliter. To define the colorimetric strategy, phenol red in neutral red dyes were evaluated.However, no color change was observed after amplification. Standardization of different concentrations of hydroxynaphthol blue was performed with the optimum change occurring with 125 micromoles of hydroxynaphthol blue. The amplified samples demonstrated a change in the color in accordance with their concentration.Sample amplification was further confirmed by electrophoresis.