Name: В центре внимания автора: Совершенствование диагностики патогенов с помощью стандартизированного LAMP
Uploaded: 2023-09-08T13:55:00
Description: Read this Scientific Article Protocol about Author Spotlight: Advancing Pathogen Diagnostics with Standardized LAMP at JoVE.com

Эта работа финансировалась Генеральной системой королевских прав (Sistema General de Regalías) из Колумбии, грант номер BPIN 2020000100092, и Universidad Icesi – Convocatoria Interna, грант No CA0413119. MFVT также финансировался из фондов доцентов Андского университета. Финансирующие организации не принимали участия в разработке, выполнении мероприятий, сборе данных, анализе данных и подготовке рукописи. Выражаем благодарность Университетской больнице Fundación Valle del Lili за вирусную РНК из образцов Sars-CoV-2 и доктору Альваро Баррере-Окампо за комментарии к рукописи.

Используемые образцы были предоставлены клинической лабораторией университетской больницы Fundación Valle del Lili и соответствовали очищенной РНК пациентов с положительным результатом теста на COVID-19 с использованием метода ОТ-кПЦР. Все пациенты дали информированное согласие на проведение ис...

Использование колориметрического анализа и анализа RT-LAMP для выявления SARS-CoV-2 

<ol>
	<li>World Health Organization. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Who coronavirus (COVID-19) dashboard (no date). , (2023).</li><li>Ibrahim, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidemiologic+surveillance+for+controlling+Covid-19+pandemic:+types,+challenges+and+implications.">Epidemiologic surveillance for controlling Covid-19 pandemic: types, challenges and implications.</a> Journal of Infection and Public Health. 13 (11), 1630-1638 (2020).</li><li>Rojas-Gallardo, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=COVID-19+in+Latin+America:+Contrasting+phylodynamic+inference+with+epidemiological+surveillance.+(Molecular+epidemiology+of+COVID-19+in+Latin+America).">COVID-19 in Latin America: Contrasting phylodynamic inference with epidemiological surveillance. (Molecular epidemiology of COVID-19 in Latin America).</a> medRxiv. , (2020).</li><li>Liu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Positive+rate+of+RT-PCR+detection+of+SARS-CoV-2+infection+in+4880+cases+from+one+hospital+in+Wuhan,+China,+from+Jan+to+Feb+2020.">Positive rate of RT-PCR detection of SARS-CoV-2 infection in 4880 cases from one hospital in Wuhan, China, from Jan to Feb 2020.</a> Clinica Chimica Acta. 505, 172-175 (2020).</li><li>Kevadiya, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnostics+for+SARS-CoV-2+infections.">Diagnostics for SARS-CoV-2 infections.</a> Nature Materials. 20 (5), 593-605 (2021).</li><li>Tomita, N., Mori, Y., Kanda, H., Notomi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loop-mediated+isothermal+amplification+(LAMP)+of+gene+sequences+and+simple+visual+detection+of+products.">Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) of gene sequences and simple visual detection of products.</a> Nature Protocols. 3 (5), 877-882 (2008).</li><li>Li, Y., Fan, P., Zhou, S., Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loop-mediated+isothermal+amplification+(LAMP):+A+novel+rapid+detection+platform+for+pathogens.">Loop-mediated isothermal amplification (LAMP): A novel rapid detection platform for pathogens.</a> Microbial Pathogenesis. 107, 54-61 (2017).</li><li>Notomi, T., Mori, Y., Tomita, N., Kanda, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loop-mediated+isothermal+amplification+(LAMP):+principle,+features,+and+future+prospects.">Loop-mediated isothermal amplification (LAMP): principle, features, and future prospects.</a> Journal of Microbiology. 53 (1), 1-5 (2015).</li><li>Augustine, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loop-mediated+isothermal+amplification+(LAMP):+A+rapid,+sensitive,+specific,+and+cost-effective+point-of-care+test+for+coronaviruses+in+the+context+of+COVID-19+pandemic.">Loop-mediated isothermal amplification (LAMP): A rapid, sensitive, specific, and cost-effective point-of-care test for coronaviruses in the context of COVID-19 pandemic.</a> Biology (Basel). 9 (8), 182 (2020).</li><li>. Nextstrain Available from: <a target="_blank" href="https://nextstrain.org/">https://nextstrain.org/</a> (2023)</li><li>. Neb Lamp, NEB LAMP Available from: <a target="_blank" href="https://lamp.neb.com/">https://lamp.neb.com/</a> (2023)</li><li>. Blast: Basic local alignment search tool (no date) Available from: <a target="_blank" href="https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/">https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/</a> (2023)</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+molecular+detection+of+SARS-CoV-2+(COVID-19)+virus+RNA+using+colorimetric+LAMP.">Rapid molecular detection of SARS-CoV-2 (COVID-19) virus RNA using colorimetric LAMP.</a> medRxiv. , (2020).</li><li>Lu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+novel+reverse+transcription+loop-mediated+isothermal+amplification+method+for+rapid+detection+of+SARS-CoV-2.">Development of a novel reverse transcription loop-mediated isothermal amplification method for rapid detection of SARS-CoV-2.</a> Virologica Sinica. 35 (3), 344-347 (2020).</li><li>Najafov, A., Hoxhaj, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> PCR Guru. , (2017).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancing+colorimetric+loop-mediated+isothermal+amplification+speed+and+sensitivity+with+guanidine+chloride.">Enhancing colorimetric loop-mediated isothermal amplification speed and sensitivity with guanidine chloride.</a> Biotechniques. 69 (3), 178-185 (2020).</li><li>Ram&#237;rez-Chavarr&#237;a, R. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automatic+analysis+of+isothermal+amplification+via+impedance+time-constant-domain+spectroscopy:+A+SARS-CoV-2+case+study.">Automatic analysis of isothermal amplification via impedance time-constant-domain spectroscopy: A SARS-CoV-2 case study.</a> Chemosensors. 11 (4), 230 (2023).</li><li>Haque, M. F. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+RdRp-based+colorimetric+RT-LAMP+assay+for+rapid+and+sensitive+detection+of+SARS-CoV-2+in+clinical+and+sewage+samples+from+Pakistan.">A novel RdRp-based colorimetric RT-LAMP assay for rapid and sensitive detection of SARS-CoV-2 in clinical and sewage samples from Pakistan.</a> Virus Research. 302, 198484 (2021).</li><li>Donia, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+RT-LAMP+and+microfluidic+technology+for+detection+of+SARS-CoV-2+in+wastewater+as+an+advanced+point-of-care+platform.">Integration of RT-LAMP and microfluidic technology for detection of SARS-CoV-2 in wastewater as an advanced point-of-care platform.</a> Food and Environmental Virology. 14, 364-373 (2022).</li></ol>

Несмотря на то, что RT-LAMP рассматривается как дополнительная методология для выполнения молекулярной диагностики, она также имеет некоторые ограничения и критические шаги, которые необходимо учитывать при стандартизации и внедрении протокола.
В рамках стандартизации LAM...

Коронавирус тяжелого острого респираторного синдрома 2 (SARS-CoV-2) вызывает коронавирусную инфекцию 2019 года (COVID-19). 30 января 2020 г. Всемирная организация здравоохранения объявила чрезвычайную ситуацию в области общественного здравоохранения, имеющую международное значение, а 11 марта 2020 г. – пандемию. На момент написания этой статьи пандемия привела к более чем 760 миллионам случаев заболевания и 6,87 миллионам смертей1.
Воздействие этого вируса высветило необходимость в более совершенных, точных, быстрых и широко доступных инструментах эпиднадзора для улучшения выявления инфекционных заболеваний и борьбы с ними 2,3. Во время пандемии диагностические тесты SARS-CoV-2 были основаны на обнаружении нуклеиновых кислот, антител и белков, но обнаружение нуклеиновых кислот методом ОТ-ПЦР является золотым стандартом4. Однако ОТ-ПЦР имеет некоторые ограничения; Для этого требуется специализированное оборудование, инфраструктура и персонал, обученный молекулярной биологии, что ограничивает его применение специализированными лабораториями. Кроме того, это трудоемкий процесс (4-6 часов), не считая времени на транспортировку образцов в лабораторию, которая может занять5 дней. Эти ограничения препятствуют эффективной обработке проб и получению информации, необходимой для планирования действий в чрезвычайных ситуациях и эпидемиологического управления.
Изотермическая амплификация, опосредованная петлей обратной транскрипции (RT-LAMP), имеет ряд преимуществ по сравнению с ОТ-ПЦР, что делает ее привлекательной стратегией для разработки будущих диагностических тестов (POCT) в местах оказания медицинской помощи, особенно в условиях ограниченных ресурсов6. Во-первых, он очень специфичен, потому что использует от четырех до шести праймеров, которые распознают от шести до восьми областей в целевой последовательности, будь то ДНК или РНК 7,8. Во-вторых, поскольку он работает при постоянной температуре, он не требует сложного оборудования, такого как термоциклеры в реальном времени для создания усиления, а также не требует высококвалифицированного персонала для работы с ним. В-третьих, время реакции очень короткое (~ 60 мин), и используются реагенты, которые не очень специализированы, что делает его экономически эффективным инструментом6. Учитывая вышеизложенное и чрезвычайную ситуацию в области здравоохранения, вызванную пандемией COVID-19, этот метод можно рассматривать как альтернативный метод диагностики, который является быстрым, недорогим и простым в реализации в любой исследовательской лаборатории9.
Протокол стандартизации и реализации RT-LAMP для выявления SARS-CoV-2 колориметрическими методами с использованием амплификатора и водяной бани описан в данной статье (рисунок 1). Обсуждаются критические точки, их ограничения и альтернативы их преодоления.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65662/65662fig01.jpg"> Рисунок 1: Схема протокола амплификации SARS-CoV-2 с использованием метода RT-LAMP. Пожалуйста, <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65662/65662fig01large.jpg" target="_blank">нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 kb DNA Ladder</td>
			<td>SOLIS BIODYNE</td>
			<td>07-12-00050</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50x TAE Electrophoresis Buffer</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>B49</td>
			<td>Store at roome temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accuris High Fidelity Polymerase</td>
			<td>ACCURIS LIFE SCIENCE REAGENTS</td>
			<td>PR1000-HF-200</td>
			<td>It can be used in case Q5 High-Fidelity DNA polymerase cannot be purchased. For the enzyme, make aliquots of an appropriate volume and store at -20 &#176;C until use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>PanReacAppliChem</td>
			<td>A8963,0100</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bst 3.0 DNA Polymerase 8000 IU/mL</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0374S/M0374L</td>
			<td>For the enzyme, make aliquots of an appropriate volume and store at -20 &#176;C until use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxynucleotide (dNTP) Solution Set</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>N0446S</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diethyl pyrocarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>159220-25G&#160;</td>
			<td>Handle it with caution under an extraction cabinet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneRuler 100 bp Plus DNA Ladder, ready-to-use</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>SM0322</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydroxy naphthol blue disodium salt</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-215156B</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q5 High-Fidelity DNA polymerase 2000 IU/mL&#160;</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0491S/M0491L</td>
			<td>For the enzyme, make aliquots of an appropriate volume and store at -20 &#176;C until use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WarmStart RTx Reverse Transcriptase 15000 IU/mL</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0380S/M0380L</td>
			<td>For the enzyme, make aliquots of an appropriate volume and store at -20 &#176;C until use.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detecting sars-cov-2 virus by reverse transcription-loop-mediated isothermal amplification

Вирус тяжелого острого респираторного синдрома коронавируса 2 (SARS-CoV-2) оказал серьезное воздействие на здоровье человека. Она продолжает оставаться угрозой для современного общества, потому что многие люди умирают в результате инфекции. Заболевание диагностируется с помощью серологических и молекулярных тестов, таких как золотой стандарт полимеразной цепной реакции в реальном времени (ОТ-ПЦР). Последний имеет ряд недостатков, поскольку требует специализированной инфраструктуры, дорогостоящего оборудования и обученного персонала. В этой статье мы представляем протокол, в котором изложены шаги, необходимые для обнаружения вируса SARS-CoV-2 с помощью изотермической амплификации, опосредованной обратной транскрипцией (RT-LAMP) в образцах человека. Протокол включает в себя инструкции по проектированию праймеров in silico, приготовлению реагентов, амплификации и визуализации. После стандартизации этот метод может быть легко внедрен и адаптирован к любой лаборатории или месту оказания медицинской помощи в течение 60 минут по низкой цене и с использованием недорогого оборудования. Он приспосабливается к обнаружению различных патогенов. Таким образом, он потенциально может быть использован в полевых условиях и в медицинских центрах для проведения своевременного эпидемиологического надзора.

The severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) causes coronavirus disease 2019 (COVID-19). The World Health Organization declared a public health emergency of international concern on 30 January 2020 and a pandemic on 11 March 2020. The pandemic resulted in over 760 million cases and 6.87 million deaths as of the date this article was written1.
The impact of this virus has highlighted the need for better, more accurate, faster, and more widely available surveillance tools to improve infectious disease detection and control2,3. During the pandemic, SARS-CoV-2 diagnostic tests were based on detecting nucleic acid, antibodies, and proteins, but RT-PCR detection of nucleic acid is the gold standard4. However, RT-PCR has some limitations; it requires specialized equipment, infrastructure, and personnel trained in molecular biology, limiting its application to specialized laboratories. Further, it is time-consuming (4-6 h), not including the time to transport the specimens to the laboratory, which can take days5. These constraints prevent efficient sample processing and obtaining the information required for contingency planning and epidemiological management.
Reverse transcription-loop-mediated isothermal amplification (RT-LAMP) has several advantages over RT-PCR, making it an appealing strategy for designing future point-of-care diagnostic tests (POCT), particularly in resource-constrained settings6. First, it is greatly specific because it uses between four and six primers that recognize six to eight areas in the target sequence, be it DNA or RNA7,8. Second, because it operates at a constant temperature, it does not require sophisticated equipment such as real-time thermal cyclers to generate the amplification, nor does it necessitate highly trained personnel to operate it. Third, the reaction time is very short (~60 min), and reagents that are not very specialized are employed, which makes it a cost-effective tool6. Given the foregoing and the health emergency caused by the COVID-19 pandemic, this technique can be viewed as an alternative diagnostic method that is quick, inexpensive, and simple to implement in any research laboratory9.
The protocol for standardizing and implementing an RT-LAMP to detect SARS-CoV-2 by colorimetric methods using a thermocycler and a water bath is described in this article (Figure 1). Critical points, their limitations, and alternatives to advance them are discussed.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65662/65662fig01.jpg" /> 
Figure 1: Scheme of the protocol for amplifying SARS-CoV-2 using the RT-LAMP technique. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65662/65662fig01large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>

В центре внимания автора: Совершенствование диагностики патогенов с помощью стандартизированного LAMP

Обнаружение вируса SARS-CoV-2 с помощью изотермической амплификации, опосредованной петлей обратной транскрипции

Our research aims to standardize LAMP as a prediagnostic test, suitable for field or primary care settings lacking advanced laboratory infrastructure. We seek to promote the use of locally-producible buffers and alternative dyes, reducing dependence on imported commercial kits. Currently, CRISPR-Cas is an efficient system employed in the development of fast, specific, and sensitive diagnostic methods for pathogens.Now, this system has a broad range of and supplements to detect RNA or DNA targets in different samples of interest. The current experimental challenges involve preventing non-target amplification resulting from amplicon contamination and primary cell especially with lengthy primers prone to dimer formation. Additionally, we aim to determine optimal reaction conditions to achieve a visually distinguishable color change in the dye.Once it's standardized and fully validated, this method can be easily implemented and adapt to any laboratory or point-of-care within 60 minutes, at low cost and using inexpensive equipment, to detect almost any pathogen. Thus, it can potentially be used in primary care centers to carry out timely, epidemiological surveillance. Our multidisciplinary group is focused on the discovery of molecules from native Colombia plants, trying to identify the potential to inhibit the replication of viruses such as dengue, Zika, or SARS-COVID-2.In addition, we are conducting studies to develop molecular diagnostic methods for these viruses.

Реализация протокола начинается с разработки набора праймеров для каждого гена-мишени в соответствии с описанным выше протоколом. В июне 2020 года из базы данных NextStrain было получено 5 000 геномов SARS-CoV-2, репрезентативность которых составила 10% от колумбийских геномов. Эти последовательнос?...

Read this Scientific Article Protocol about Author Spotlight: Advancing Pathogen Diagnostics with Standardized LAMP at JoVE.com

Здесь мы предоставляем полный протокол для стандартизации и реализации метода обнаружения вируса SARS-CoV-2 в образцах человека с помощью изотермической амплификации с обратной транскрипцией, опосредованной петлей (RT-LAMP). Этот метод, выполненный в течение 60 минут, может быть адаптирован к любой лаборатории или месту оказания медицинской помощи по низкой цене и с использованием недорогого оборудования.

The severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) virus has dramatically impacted human health. It continues to be a threat to modern ...

Наше исследование направлено на стандартизацию LAMP в качестве предварительного диагностического теста, подходящего для полевых или первичных медицинских учреждений, не имеющих развитой лабораторной инфраструктуры. Мы стремимся продвигать использование буферов местного производства и альтернативных красителей, снижая зависимость от импортных коммерческих наборов. В настоящее время CRISPR-Cas является эффективной системой, используемой для разработки быстрых, специфичных и чувствительных методов диагностики патогенов.Теперь эта система имеет широкий спектр добавок для обнаружения мишеней РНК или ДНК в различных образцах, представляющих интерес. Текущие экспериментальные задачи связаны с предотвращением нецелевой амплификации в результате загрязнения ампликонов и первичных клеток, особенно с длинными праймерами, склонными к образованию димеров. Кроме того, мы стремимся определить оптимальные условия реакции для достижения визуально различимого изменения цвета красителя.После того, как он стандартизирован и полностью проверен, этот метод может быть легко внедрен и адаптирован к любой лаборатории или месту оказания медицинской помощи в течение 60 минут, с низкими затратами и использованием недорогого оборудования, для обнаружения практически любого патогена. Таким образом, он потенциально может быть использован в центрах первичной медико-санитарной помощи для проведения своевременного эпидемиологического надзора. Наша междисциплинарная группа занимается открытием молекул из местных колумбийских растений, пытаясь определить потенциал ингибирования репликации вирусов, таких как денге, Зика или SARS-COVID-2.Кроме того, мы проводим исследования по разработке молекулярных методов диагностики этих вирусов.

detecting-sars-cov-2-virus-reverse-transcription-loop-mediated

Research

JoVE Journal

Biology

Detecting SARS-CoV-2 Virus by Reverse Transcription-Loop-Mediated Isothermal Amplification

The severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) virus has dramatically impacted human health. It continues to be a threat to modern society because many people die as a result of infection. The disease is diagnosed using serologic and molecular tests, such as the gold standard real-time polymerase chain reaction (RT-PCR). The last has several disadvantages because it requires specialized infrastructure, costly equipment, and trained personnel. Here, we present a protocol outlining the steps required to detect the SARS-CoV-2 virus using reverse transcription-loop-mediated isothermal amplification (RT-LAMP) in human samples. The protocol includes instructions for designing primers in silico, preparing reagents, amplification, and visualization. Once standardized, this method can be easily implemented and adapted to any laboratory or point-of-care within 60 min at a low cost and using inexpensive equipment. It is adaptable to detecting different pathogens. Thus, it can potentially be used in the field and in health centers to carry out timely epidemiological surveillance.

Here we provide a complete protocol to standardize and implement the method for detecting the SARS-CoV-2 virus in human samples by reverse transcription loop-mediated isothermal amplification (RT-LAMP). This method, done within 60 min, could be adapted to any laboratory or point-of-care at a low cost and using inexpensive equipment.

Reverse Transcriptase-Loop Mediated Isothermal Amplification Reaction (RT-LAMP) for SARS-CoV-2 Detection

To begin, switch on the laminar airflow cabinet, allowing it to stabilize for three minutes. Aseptically clean and sanitize the cabinet's internal surfaces using the following disinfection agents. After disinfecting any material that will enter the cabinet, place napkins and nitrile gloves into the cabinet.Then switch off the cabinet and expose it to ultraviolet light for 15 minutes. After the irradiation, restart the cabinet. Place the primer design reagents in an ice-filled cooler.After sanitizing it with 70%ethanol, place the container inside the cabinet. Prepare the loop mediated isothermal amplification, or LAMP mix, in a 0.6 milliliter microcentrifuge tube. Pipette the mixture to homogenize it.Next, incubate the closed tubes in a heating block at 95 degrees Celsius for five minutes. Then cool the tubes in an ice-filled polystyrene cooler for five minutes. After cooling, place the tubes in the laminar flow cabinet.To complete the LAMP mix, add four microliters of DNA polymerase, followed by one microliter of reverse transcriptase. To perform colorimetric detection, add the dihydroxynaphthol blue. After reagent addition, pipette each solution to properly mix the LAMP reagents.Next, pipette 22 microliters of the solution into PCR tubes, being careful not to create bubbles. For the negative control, add three microliters of 0.1%diethyl pyrocarbonate water. Keep aside any remaining tubes for the addition of genetic material.Next, remove all materials from the cabinet. After sanitizing the cabinet surfaces with 70%ethanol, shut it off. In a separate area, add three microliters of the sample to each PCR tube and pipette well with a 20 microliter micropipette to thoroughly homogenize.Before initiating the colorimetric reaction, use a high quality camera to take pictures of the PCR tubes. Now, carry out the reaction using a thermal cycler and a water bath. For the thermal cycler, place the tubes into the reaction block and set up thermo profile on the equipment.If using the water bath, securely place the tubes in circular containers, then place these containers in the water bath at 66.3 degrees Celsius for 60 minutes. After the reaction time, remove the tubes and store them at four degrees Celsius until use. If a colorimetric reaction was performed, capture images of the PCR with a high quality camera.A temperature gradient demonstrated that the optimal melting temperature was 66.3 degrees Celsius. The concentration of BST 3.0 enzyme was optimized to 3.2 international units per microliter. To define the colorimetric strategy, phenol red in neutral red dyes were evaluated.However, no color change was observed after amplification. Standardization of different concentrations of hydroxynaphthol blue was performed with the optimum change occurring with 125 micromoles of hydroxynaphthol blue. The amplified samples demonstrated a change in the color in accordance with their concentration.Sample amplification was further confirmed by electrophoresis.