Name: Yazar Spotlight: Standartlaştırılmış LAMP ile Patojen Teşhisini Geliştirme
Uploaded: 2023-09-08T13:55:00
Description: Read this Scientific Article Protocol about Author Spotlight: Advancing Pathogen Diagnostics with Standardized LAMP at JoVE.com

Bu çalışma, Kolombiya'dan Sistema General de Regalías, BPIN 2020000100092 numaralı hibe ve Universidad Icesi - Convocatoria Interna, CA0413119 numaralı hibe tarafından finanse edilmiştir. MFVT ayrıca Universidad de los Andes'ten Yardımcı Doçentlik Fonları tarafından finanse edildi. Finansman sağlayan kuruluşlar, tasarımın yapılmasına, faaliyetlerin yürütülmesine, veri toplanmasına ve veri analizine ve makalenin hazırlanmasına katılmamıştır. Sars -CoV-2 örneklerinden elde edilen viral RNA için Üniversite Hastanesi Fundación Valle del Lili'ye ve el yazması hakkındaki yorumları için Dr. Alvaro Barrera-Ocampo'ya teşekkür ederiz.

Kullanılan örnekler, Fundación Valle del Lili Üniversite hastanesinin klinik laboratuvarı tarafından sağlandı ve RT-qPCR tekniği kullanılarak COVID-19 testi pozitif çıkan hastalardan alınan saflaştırılmış RNA'ya karşılık geldi. Tüm hastalar araştırma için bilgilendirilmiş onam verdi ve bu çalışma Fundación Valle del Lili Üniversitesi hastanesinden insan çalışmaları için biyoetik komitesi tarafından onaylandı.
1. RT-LAMP astar tasarımı ve hazırlanm...

SARS-CoV-2'yi Tespit Etmek için Kolorimetrik ve RT-LAMP Analizini Kullanma 

<ol>
	<li>World Health Organization. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Who coronavirus (COVID-19) dashboard (no date). , (2023).</li><li>Ibrahim, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidemiologic+surveillance+for+controlling+Covid-19+pandemic:+types,+challenges+and+implications.">Epidemiologic surveillance for controlling Covid-19 pandemic: types, challenges and implications.</a> Journal of Infection and Public Health. 13 (11), 1630-1638 (2020).</li><li>Rojas-Gallardo, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=COVID-19+in+Latin+America:+Contrasting+phylodynamic+inference+with+epidemiological+surveillance.+(Molecular+epidemiology+of+COVID-19+in+Latin+America).">COVID-19 in Latin America: Contrasting phylodynamic inference with epidemiological surveillance. (Molecular epidemiology of COVID-19 in Latin America).</a> medRxiv. , (2020).</li><li>Liu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Positive+rate+of+RT-PCR+detection+of+SARS-CoV-2+infection+in+4880+cases+from+one+hospital+in+Wuhan,+China,+from+Jan+to+Feb+2020.">Positive rate of RT-PCR detection of SARS-CoV-2 infection in 4880 cases from one hospital in Wuhan, China, from Jan to Feb 2020.</a> Clinica Chimica Acta. 505, 172-175 (2020).</li><li>Kevadiya, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnostics+for+SARS-CoV-2+infections.">Diagnostics for SARS-CoV-2 infections.</a> Nature Materials. 20 (5), 593-605 (2021).</li><li>Tomita, N., Mori, Y., Kanda, H., Notomi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loop-mediated+isothermal+amplification+(LAMP)+of+gene+sequences+and+simple+visual+detection+of+products.">Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) of gene sequences and simple visual detection of products.</a> Nature Protocols. 3 (5), 877-882 (2008).</li><li>Li, Y., Fan, P., Zhou, S., Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loop-mediated+isothermal+amplification+(LAMP):+A+novel+rapid+detection+platform+for+pathogens.">Loop-mediated isothermal amplification (LAMP): A novel rapid detection platform for pathogens.</a> Microbial Pathogenesis. 107, 54-61 (2017).</li><li>Notomi, T., Mori, Y., Tomita, N., Kanda, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loop-mediated+isothermal+amplification+(LAMP):+principle,+features,+and+future+prospects.">Loop-mediated isothermal amplification (LAMP): principle, features, and future prospects.</a> Journal of Microbiology. 53 (1), 1-5 (2015).</li><li>Augustine, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loop-mediated+isothermal+amplification+(LAMP):+A+rapid,+sensitive,+specific,+and+cost-effective+point-of-care+test+for+coronaviruses+in+the+context+of+COVID-19+pandemic.">Loop-mediated isothermal amplification (LAMP): A rapid, sensitive, specific, and cost-effective point-of-care test for coronaviruses in the context of COVID-19 pandemic.</a> Biology (Basel). 9 (8), 182 (2020).</li><li>. Nextstrain Available from: <a target="_blank" href="https://nextstrain.org/">https://nextstrain.org/</a> (2023)</li><li>. Neb Lamp, NEB LAMP Available from: <a target="_blank" href="https://lamp.neb.com/">https://lamp.neb.com/</a> (2023)</li><li>. Blast: Basic local alignment search tool (no date) Available from: <a target="_blank" href="https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/">https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/</a> (2023)</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+molecular+detection+of+SARS-CoV-2+(COVID-19)+virus+RNA+using+colorimetric+LAMP.">Rapid molecular detection of SARS-CoV-2 (COVID-19) virus RNA using colorimetric LAMP.</a> medRxiv. , (2020).</li><li>Lu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+novel+reverse+transcription+loop-mediated+isothermal+amplification+method+for+rapid+detection+of+SARS-CoV-2.">Development of a novel reverse transcription loop-mediated isothermal amplification method for rapid detection of SARS-CoV-2.</a> Virologica Sinica. 35 (3), 344-347 (2020).</li><li>Najafov, A., Hoxhaj, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> PCR Guru. , (2017).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancing+colorimetric+loop-mediated+isothermal+amplification+speed+and+sensitivity+with+guanidine+chloride.">Enhancing colorimetric loop-mediated isothermal amplification speed and sensitivity with guanidine chloride.</a> Biotechniques. 69 (3), 178-185 (2020).</li><li>Ram&#237;rez-Chavarr&#237;a, R. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automatic+analysis+of+isothermal+amplification+via+impedance+time-constant-domain+spectroscopy:+A+SARS-CoV-2+case+study.">Automatic analysis of isothermal amplification via impedance time-constant-domain spectroscopy: A SARS-CoV-2 case study.</a> Chemosensors. 11 (4), 230 (2023).</li><li>Haque, M. F. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+RdRp-based+colorimetric+RT-LAMP+assay+for+rapid+and+sensitive+detection+of+SARS-CoV-2+in+clinical+and+sewage+samples+from+Pakistan.">A novel RdRp-based colorimetric RT-LAMP assay for rapid and sensitive detection of SARS-CoV-2 in clinical and sewage samples from Pakistan.</a> Virus Research. 302, 198484 (2021).</li><li>Donia, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+RT-LAMP+and+microfluidic+technology+for+detection+of+SARS-CoV-2+in+wastewater+as+an+advanced+point-of-care+platform.">Integration of RT-LAMP and microfluidic technology for detection of SARS-CoV-2 in wastewater as an advanced point-of-care platform.</a> Food and Environmental Virology. 14, 364-373 (2022).</li></ol>

RT-LAMP, moleküler tanı yapmak için tamamlayıcı bir metodoloji olarak kabul edilse de, protokol standartlaştırılırken ve uygulanırken dikkate alınması gereken bazı sınırlamaları ve kritik adımları da vardır.
SARS-CoV-2'nin tespiti için LAMP standardizasyonu, ana karışımdaki aşağıdaki parametreleri ve bileşenleri değerlendirdi: (a) primerlerin konsantrasyon ve hizalama sıcaklığı; (b) Enzimlerin konsantrasyonu, (c) magnezyum konsantrasyonu; (d) reaksiyon süresi; ...

Şiddetli akut solunum sendromu koronavirüs 2 (SARS-CoV-2), 2019 koronavirüs hastalığına (COVID-19) neden olur. Dünya Sağlık Örgütü, 30 Ocak 2020'de uluslararası endişe verici bir halk sağlığı acil durumu ve 11 Mart 2020'de bir pandemi ilan etti. Pandemi, bu makalenin yazıldığı tarih itibariyle 760 milyondan fazla vaka ve 6,87 milyon ölümle sonuçlandı1.
Bu virüsün etkisi, bulaşıcı hastalık tespiti ve kontrolünü iyileştirmek için daha iyi, daha doğru, daha hızlı ve daha yaygın olarak kullanılabilen gözetim araçlarına olan ihtiyacı vurgulamıştır 2,3. Pandemi sırasında, SARS-CoV-2 tanı testleri nükleik asit, antikorlar ve proteinlerin tespit edilmesine dayanıyordu, ancak nükleik asidin RT-PCR tespiti altın standarttır4. Bununla birlikte, RT-PCR'nin bazı sınırlamaları vardır; Moleküler biyoloji konusunda eğitim almış özel ekipman, altyapı ve personel gerektirir ve uygulamasını özel laboratuvarlarla sınırlar. Ayrıca, numunelerin laboratuvara taşınması için gereken süre dahil olmak üzere zaman alıcıdır (4-6 saat),bu da 5 gün sürebilir. Bu kısıtlamalar, verimli numune işlemeyi ve acil durum planlaması ve epidemiyolojik yönetim için gerekli bilgilerin elde edilmesini engeller.
Ters transkripsiyon döngü aracılı izotermal amplifikasyonun (RT-LAMP), RT-PCR'ye göre çeşitli avantajları vardır, bu da onu, özellikle kaynak kısıtlı ortamlarda gelecekteki bakım noktası tanı testlerini (POCT) tasarlamak için çekici bir strateji haline getirir6. Birincisi, büyük ölçüde spesifiktir, çünkü DNA veya RNA7,8 olsun, hedef dizideki altı ila sekiz alanı tanıyan dört ila altı primer kullanır. İkincisi, sabit bir sıcaklıkta çalıştığı için, amplifikasyonu oluşturmak için gerçek zamanlı termal döngüleyiciler gibi karmaşık ekipmanlara ihtiyaç duymaz ve onu çalıştırmak için yüksek eğitimli personel gerektirmez. Üçüncüsü, reaksiyon süresi çok kısadır (~ 60 dakika) ve çok özel olmayan reaktifler kullanılır, bu da onu uygun maliyetli bir araç haline getirir6. Yukarıda belirtilenler ve COVID-19 pandemisinin neden olduğu sağlık acil durumu göz önüne alındığında, bu teknik, herhangi bir araştırma laboratuvarında hızlı, ucuz ve uygulanması kolay alternatif bir tanı yöntemi olarak görülebilir9.
SARS-CoV-2'yi bir termodöngüleyici ve bir su banyosu kullanarak kolorimetrik yöntemlerle tespit etmek için bir RT-LAMP'nin standartlaştırılması ve uygulanmasına ilişkin protokol bu makalede açıklanmaktadır (Şekil 1). Kritik noktalar, sınırlamaları ve bunları ilerletmek için alternatifler tartışılmaktadır.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65662/65662fig01.jpg"> Şekil 1: RT-LAMP tekniği kullanılarak SARS-CoV-2'yi yükseltmek için protokolün şeması. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65662/65662fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 kb DNA Ladder</td>
			<td>SOLIS BIODYNE</td>
			<td>07-12-00050</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50x TAE Electrophoresis Buffer</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>B49</td>
			<td>Store at roome temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accuris High Fidelity Polymerase</td>
			<td>ACCURIS LIFE SCIENCE REAGENTS</td>
			<td>PR1000-HF-200</td>
			<td>It can be used in case Q5 High-Fidelity DNA polymerase cannot be purchased. For the enzyme, make aliquots of an appropriate volume and store at -20 &#176;C until use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>PanReacAppliChem</td>
			<td>A8963,0100</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bst 3.0 DNA Polymerase 8000 IU/mL</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0374S/M0374L</td>
			<td>For the enzyme, make aliquots of an appropriate volume and store at -20 &#176;C until use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxynucleotide (dNTP) Solution Set</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>N0446S</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diethyl pyrocarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>159220-25G&#160;</td>
			<td>Handle it with caution under an extraction cabinet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneRuler 100 bp Plus DNA Ladder, ready-to-use</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>SM0322</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydroxy naphthol blue disodium salt</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-215156B</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q5 High-Fidelity DNA polymerase 2000 IU/mL&#160;</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0491S/M0491L</td>
			<td>For the enzyme, make aliquots of an appropriate volume and store at -20 &#176;C until use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WarmStart RTx Reverse Transcriptase 15000 IU/mL</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0380S/M0380L</td>
			<td>For the enzyme, make aliquots of an appropriate volume and store at -20 &#176;C until use.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detecting sars-cov-2 virus by reverse transcription-loop-mediated isothermal amplification

Şiddetli akut solunum sendromu koronavirüs 2 (SARS-CoV-2) virüsü insan sağlığını önemli ölçüde etkiledi. Modern toplum için bir tehdit olmaya devam ediyor çünkü birçok insan enfeksiyon sonucu ölüyor. Hastalık, altın standart gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PCR) gibi serolojik ve moleküler testler kullanılarak teşhis edilir. Sonuncusunun çeşitli dezavantajları vardır çünkü özel altyapı, maliyetli ekipman ve eğitimli personel gerektirir. Burada, insan örneklerinde ters transkripsiyon döngü aracılı izotermal amplifikasyon (RT-LAMP) kullanarak SARS-CoV-2 virüsünü tespit etmek için gerekli adımları özetleyen bir protokol sunuyoruz. Protokol, in silico primerlerin tasarlanması, reaktiflerin hazırlanması, amplifikasyon ve görselleştirme için talimatlar içerir. Standartlaştırıldıktan sonra, bu yöntem 60 dakika içinde düşük maliyetle ve ucuz ekipman kullanılarak herhangi bir laboratuvara veya bakım noktasına kolayca uygulanabilir ve uyarlanabilir. Farklı patojenleri tespit etmek için uyarlanabilir. Bu nedenle, zamanında epidemiyolojik sürveyans yapmak için sahada ve sağlık merkezlerinde potansiyel olarak kullanılabilir.

The severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) causes coronavirus disease 2019 (COVID-19). The World Health Organization declared a public health emergency of international concern on 30 January 2020 and a pandemic on 11 March 2020. The pandemic resulted in over 760 million cases and 6.87 million deaths as of the date this article was written1.
The impact of this virus has highlighted the need for better, more accurate, faster, and more widely available surveillance tools to improve infectious disease detection and control2,3. During the pandemic, SARS-CoV-2 diagnostic tests were based on detecting nucleic acid, antibodies, and proteins, but RT-PCR detection of nucleic acid is the gold standard4. However, RT-PCR has some limitations; it requires specialized equipment, infrastructure, and personnel trained in molecular biology, limiting its application to specialized laboratories. Further, it is time-consuming (4-6 h), not including the time to transport the specimens to the laboratory, which can take days5. These constraints prevent efficient sample processing and obtaining the information required for contingency planning and epidemiological management.
Reverse transcription-loop-mediated isothermal amplification (RT-LAMP) has several advantages over RT-PCR, making it an appealing strategy for designing future point-of-care diagnostic tests (POCT), particularly in resource-constrained settings6. First, it is greatly specific because it uses between four and six primers that recognize six to eight areas in the target sequence, be it DNA or RNA7,8. Second, because it operates at a constant temperature, it does not require sophisticated equipment such as real-time thermal cyclers to generate the amplification, nor does it necessitate highly trained personnel to operate it. Third, the reaction time is very short (~60 min), and reagents that are not very specialized are employed, which makes it a cost-effective tool6. Given the foregoing and the health emergency caused by the COVID-19 pandemic, this technique can be viewed as an alternative diagnostic method that is quick, inexpensive, and simple to implement in any research laboratory9.
The protocol for standardizing and implementing an RT-LAMP to detect SARS-CoV-2 by colorimetric methods using a thermocycler and a water bath is described in this article (Figure 1). Critical points, their limitations, and alternatives to advance them are discussed.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65662/65662fig01.jpg" /> 
Figure 1: Scheme of the protocol for amplifying SARS-CoV-2 using the RT-LAMP technique. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65662/65662fig01large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>

Yazar Spotlight: Standartlaştırılmış LAMP ile Patojen Teşhisini Geliştirme

SARS-CoV-2 Virüsünü Ters Transkripsiyon Döngü Aracılı İzotermal Amplifikasyon ile Tespit Etme

Our research aims to standardize LAMP as a prediagnostic test, suitable for field or primary care settings lacking advanced laboratory infrastructure. We seek to promote the use of locally-producible buffers and alternative dyes, reducing dependence on imported commercial kits. Currently, CRISPR-Cas is an efficient system employed in the development of fast, specific, and sensitive diagnostic methods for pathogens.Now, this system has a broad range of and supplements to detect RNA or DNA targets in different samples of interest. The current experimental challenges involve preventing non-target amplification resulting from amplicon contamination and primary cell especially with lengthy primers prone to dimer formation. Additionally, we aim to determine optimal reaction conditions to achieve a visually distinguishable color change in the dye.Once it's standardized and fully validated, this method can be easily implemented and adapt to any laboratory or point-of-care within 60 minutes, at low cost and using inexpensive equipment, to detect almost any pathogen. Thus, it can potentially be used in primary care centers to carry out timely, epidemiological surveillance. Our multidisciplinary group is focused on the discovery of molecules from native Colombia plants, trying to identify the potential to inhibit the replication of viruses such as dengue, Zika, or SARS-COVID-2.In addition, we are conducting studies to develop molecular diagnostic methods for these viruses.

Protokolün uygulanması, yukarıda açıklanan protokolü izleyerek her bir hedef gen için primer setinin tasarlanmasıyla başlar. Haziran 2020'de, NextStrain veritabanından 5.000 SARS-CoV-2 genomu elde edildi ve Kolombiya genomlarının %10'luk bir temsiliyeti oldu. Bu diziler, astar tasarım sürecinde kullanılan konsensüs dizisini elde etmek için hizalandı. Tablo 1 , RdRp/Hel ve RdRp primerleri için seçilen primer setini göstermektedir. Gen N amplifikasyonu için primer seti, daha önce yay...

Read this Scientific Article Protocol about Author Spotlight: Advancing Pathogen Diagnostics with Standardized LAMP at JoVE.com

Burada, ters transkripsiyon döngü aracılı izotermal amplifikasyon (RT-LAMP) ile insan örneklerinde SARS-CoV-2 virüsünü tespit etme yöntemini standartlaştırmak ve uygulamak için eksiksiz bir protokol sunuyoruz. 60 dakika içinde yapılan bu yöntem, düşük maliyetle ve ucuz ekipman kullanılarak herhangi bir laboratuvara veya bakım noktasına uyarlanabilir.

The severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) virus has dramatically impacted human health. It continues to be a threat to modern ...

Araştırmamız, LAMP'yi gelişmiş laboratuvar altyapısına sahip olmayan saha veya birinci basamak sağlık hizmetleri için uygun bir ön tanı testi olarak standardize etmeyi amaçlamaktadır. İthal ticari kitlere olan bağımlılığı azaltarak yerel olarak üretilebilir tamponların ve alternatif boyaların kullanımını teşvik etmeye çalışıyoruz. Şu anda, CRISPR-Cas, patojenler için hızlı, spesifik ve hassas tanı yöntemlerinin geliştirilmesinde kullanılan etkili bir sistemdir.Şimdi, bu sistem, ilgilenilen farklı örneklerde RNA veya DNA hedeflerini tespit etmek için geniş bir yelpazeye ve takviyelere sahiptir. Mevcut deneysel zorluklar, özellikle dimer oluşumuna eğilimli uzun primerlerle, amplikon kontaminasyonu ve birincil hücreden kaynaklanan hedef olmayan amplifikasyonun önlenmesini içerir. Ek olarak, boyada görsel olarak ayırt edilebilir bir renk değişikliği elde etmek için en uygun reaksiyon koşullarını belirlemeyi amaçlıyoruz.Standartlaştırıldıktan ve tam olarak doğrulandıktan sonra, bu yöntem hemen hemen her patojeni tespit etmek için düşük maliyetle ve ucuz ekipman kullanarak 60 dakika içinde kolayca uygulanabilir ve herhangi bir laboratuvara veya bakım noktasına uyarlanabilir. Bu nedenle, birinci basamak sağlık merkezlerinde zamanında, epidemiyolojik sürveyans yapmak için potansiyel olarak kullanılabilir. Multidisipliner grubumuz, dang humması, Zika veya SARS-COVID-2 gibi virüslerin replikasyonunu engelleme potansiyelini belirlemeye çalışarak, yerli Kolombiya bitkilerinden elde edilen moleküllerin keşfine odaklanmıştır.Ayrıca bu virüsler için moleküler tanı yöntemlerinin geliştirilmesi için de çalışmalar yürütüyoruz.

detecting-sars-cov-2-virus-reverse-transcription-loop-mediated

Research

JoVE Journal

Biology

Detecting SARS-CoV-2 Virus by Reverse Transcription-Loop-Mediated Isothermal Amplification

The severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) virus has dramatically impacted human health. It continues to be a threat to modern society because many people die as a result of infection. The disease is diagnosed using serologic and molecular tests, such as the gold standard real-time polymerase chain reaction (RT-PCR). The last has several disadvantages because it requires specialized infrastructure, costly equipment, and trained personnel. Here, we present a protocol outlining the steps required to detect the SARS-CoV-2 virus using reverse transcription-loop-mediated isothermal amplification (RT-LAMP) in human samples. The protocol includes instructions for designing primers in silico, preparing reagents, amplification, and visualization. Once standardized, this method can be easily implemented and adapted to any laboratory or point-of-care within 60 min at a low cost and using inexpensive equipment. It is adaptable to detecting different pathogens. Thus, it can potentially be used in the field and in health centers to carry out timely epidemiological surveillance.

Here we provide a complete protocol to standardize and implement the method for detecting the SARS-CoV-2 virus in human samples by reverse transcription loop-mediated isothermal amplification (RT-LAMP). This method, done within 60 min, could be adapted to any laboratory or point-of-care at a low cost and using inexpensive equipment.

Biyoloji

Reverse Transcriptase-Loop Mediated Isothermal Amplification Reaction (RT-LAMP) for SARS-CoV-2 Detection

To begin, switch on the laminar airflow cabinet, allowing it to stabilize for three minutes. Aseptically clean and sanitize the cabinet's internal surfaces using the following disinfection agents. After disinfecting any material that will enter the cabinet, place napkins and nitrile gloves into the cabinet.Then switch off the cabinet and expose it to ultraviolet light for 15 minutes. After the irradiation, restart the cabinet. Place the primer design reagents in an ice-filled cooler.After sanitizing it with 70%ethanol, place the container inside the cabinet. Prepare the loop mediated isothermal amplification, or LAMP mix, in a 0.6 milliliter microcentrifuge tube. Pipette the mixture to homogenize it.Next, incubate the closed tubes in a heating block at 95 degrees Celsius for five minutes. Then cool the tubes in an ice-filled polystyrene cooler for five minutes. After cooling, place the tubes in the laminar flow cabinet.To complete the LAMP mix, add four microliters of DNA polymerase, followed by one microliter of reverse transcriptase. To perform colorimetric detection, add the dihydroxynaphthol blue. After reagent addition, pipette each solution to properly mix the LAMP reagents.Next, pipette 22 microliters of the solution into PCR tubes, being careful not to create bubbles. For the negative control, add three microliters of 0.1%diethyl pyrocarbonate water. Keep aside any remaining tubes for the addition of genetic material.Next, remove all materials from the cabinet. After sanitizing the cabinet surfaces with 70%ethanol, shut it off. In a separate area, add three microliters of the sample to each PCR tube and pipette well with a 20 microliter micropipette to thoroughly homogenize.Before initiating the colorimetric reaction, use a high quality camera to take pictures of the PCR tubes. Now, carry out the reaction using a thermal cycler and a water bath. For the thermal cycler, place the tubes into the reaction block and set up thermo profile on the equipment.If using the water bath, securely place the tubes in circular containers, then place these containers in the water bath at 66.3 degrees Celsius for 60 minutes. After the reaction time, remove the tubes and store them at four degrees Celsius until use. If a colorimetric reaction was performed, capture images of the PCR with a high quality camera.A temperature gradient demonstrated that the optimal melting temperature was 66.3 degrees Celsius. The concentration of BST 3.0 enzyme was optimized to 3.2 international units per microliter. To define the colorimetric strategy, phenol red in neutral red dyes were evaluated.However, no color change was observed after amplification. Standardization of different concentrations of hydroxynaphthol blue was performed with the optimum change occurring with 125 micromoles of hydroxynaphthol blue. The amplified samples demonstrated a change in the color in accordance with their concentration.Sample amplification was further confirmed by electrophoresis.