Name: מחבר זרקור: חקירת הקשר בין FSH ושינויים פתופיזיולוגיים אצל נשים לפני גיל המעבר - תובנות ממודל עכבר
Uploaded: 2023-08-11T14:00:00
Duration: 1 min 26 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Investigating the Relationship Between FSH and Pathophysiological Changes in Perimenopausal Women - Insights from a Mouse Model at JoVE.com

אנו רוצים להודות למעבדת בעלי החיים של בית החולים המחוזי שאנדונג על התמיכה הטכנית. עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (NSFC 82101645), הקרן למדעי הטבע של מחוז שאנדונג, סין (ZR2020QH088), ותוכנית התמיכה במדע וטכנולוגיה לחדשנות נוער של מכללות במחוז שאנדונג (2021KJ051).

הפרוטוקול הבא עמד בכל ההנחיות האתיות המוסדיות בנוגע לשימוש בחיות מחקר ואושר על ידי ועדת האתיקה של בעלי חיים בבית החולים המחוזי שאנדונג, סין. כל המניפולציות הכירורגיות בוצעו בהרדמה עמוקה, ובעלי החיים לא חוו כאב בשום שלב במהלך ההליך.
1. הכנה לפני הניתוח
<ol><li>עיקור מכשירים<ol><li>יש לעקר בקיטור כלי ניתוח באוטוקלאבה (121°C למשך 15 דקות) לפני הניתוח. הכינו מספיק תפרים ומחטים חד פעמיים.</li>
	</ol></li>
	<li>הגדרת פלטפורמת ניתוח<ol><li>בצע את הניתוח בחדר המוקדש להליכים כירורגיים. הקצה שטח ספסל של לפחות 60 ס"מ x 60 ס"מ לניתוח. נקו את פני השטח של האזור ב-75% אלכוהול וכסו במגבת רפואית חד-פעמית, ולאחר מכן חטאו אותו בקרינה אולטרה-סגולה 30 דקות מראש (איור 1A).</li>
	</ol></li>
	<li>הכנת בעלי חיים<ol><li>שכן את כל בעלי החיים בחדר מבוקר טמפרטורה (20-25 מעלות צלזיוס) עם מחזור אור של 12 שעות, 12 שעות חושך. הסתגלות נקבת עכברי C57BL/6 בת 8 שבועות למתקן הדיור למשך שבוע לפני הניתוח.</li>
		<li>שוקלים עכברים לפני הניתוח. יש לתת את כל נקבות העכברים בנות 9 שבועות בהרדמה כללית על ידי הזרקה תוך צפקית של טריברומואתנול (280 מ"ג/ק"ג), כדי להשיג חוסר כאב בכל שלב במהלך ההליך. להזריק meloxicam (2 מ"ג / ק"ג) תת עורית, כ 1 שעה לפני ניתוח כדי להקל על הכאב.</li>
		<li>יש למרוח משחת עיניים למניעת יובש בקרנית במהלך הניתוח.</li>
		<li>יש למרוח תחליב להסרת שיער על הגב באמצעות צמר גפן נקי. תן את קרם לשבת על העכבר במשך 3-5 דקות, ולאחר מכן להסיר את השיער באמצעות גזה צמר גפן. חזור על שלב זה עד שכל השיער יוסר מגב העכבר.</li>
		<li>השתמש גזה צמר גפן כדי לנקות את העור עם 75% אלכוהול. קבעו את העכבר על משטח הניתוח בחזרה באמצעות רצועת גומי או חבל כותנה (איור 1B) ומרחו תמיסת יודופור כדי לנקות את הגב. הערה: יש לאשר את עומק ההרדמה באמצעות צביטת בוהן לפני כריתת השחלות.</li>
	</ol></li>
</ol>2. כריתת שחלות
הערה: ניתן לשמור על טריברומואתנול למשך כ-30 דקות, ולהבטיח שהניתוח יושלם ככל האפשר.
<ol><li>בצע חתך גבי ~ 1.0 ס"מ לאורך מבסיס הירך כלפי מעלה באמצעות אזמל חד פעמי, ודא שרק העור והפאשיה התת עורית חתוכים והימנע מחיתוך לתוך הצפק האחורי בשלב זה.</li>
	<li>משוך את החתך שמאלה, וניתן לראות כרית שומן לבנה. חתכו ~0.5 ס"מ לאורך כרית השומן הלבן כדי לחשוף את חלל הצפק באמצעות מיקרו-מלקחיים ומספריים.</li>
	<li>לאחר חיתוך הצפק האחורי, לאט ובעדינות להסיר את כרית השומן הלבן מחלל intraperitoneal עם מיקרו מלקחיים. מיד להרטיב את רקמת השומן הלבן עם 0.9% מלוחים סטריליים מחוץ לגזה ספוג. שמור על רקמה חשופה תמיד לחה מחוץ לחלל הבטן.</li>
	<li>חומר גרגירי ורוד, כלומר השחלה, מחובר לחלק התחתון של כרית השומן הלבנה (איור 2A). השחלות מחוברות לצינור דק, כלומר הרחם. השתמשו בתפרים נספגים 5-0 כדי לקשור את קצה השחלה של הרחם ולהסיר את השחלה השמאלית (איור 2B).</li>
	<li>בעת הסרת שחלה, לשמר את רקמת השומן שמסביב ככל האפשר. יש להימנע ממגע ישיר בין כלי הניתוח לשחלות ולמנוע השתלה תוך צפקית של רקמת השחלה.</li>
	<li>מניחים בזהירות את כרית השומן הלבן בחזרה בחלל intraperitoneal. בצעו תפר פשוט לסירוגין בצפק האחורי עם תפר נספג 5-0 (איור 2C). לאחר השלמת התפר, נקו כל דימום עם גזה סטרילית ספוגה במי מלח 0.9%.</li>
	<li>משוך את חתך העור ימינה והסר את השחלה הימנית באותה שיטה.</li>
	<li>בצעו תפר לסירוגין עם 4-0 תפרים שאינם נספגים ונקו כל דימום עם גזה סטרילית ספוגה במי מלח 0.9% (איור 2D).</li>
	<li>נקו את הפצע בתמיסת יודופור לאחר השלמת שני התפרים. הזרקה תוך צפקית של אנטיביוטיקה רחבת טווח.</li>
</ol>3. תצפית לאחר הניתוח
<ol><li>העבירו את העכברים לשמיכה בטמפרטורה קבועה של 37 מעלות צלזיוס לאחר הניתוח. עד שהעכברים יוכלו לנוע בחופשיות, החזיקו את החיות בכלוב האישי שלהן. אין להשאיר את בעל החיים ללא השגחה עד שהוא חזר להכרה מספקת כדי לשמור על שכיבת עצם החזה.</li>
	<li>יש להזריק מלוקסיקם (2 מ"ג/ק"ג) תת עורית 24 שעות לאחר הניתוח כדי להקל על הכאב.</li>
	<li>עקוב אחר העכברים מדי יום כדי לוודא שהפצע הניתוחי מחלים כראוי ללא כל סימנים של סיבוכים (dehiscence).</li>
</ol>4. תוספי אסטרדיול
<ol><li>הכינו הזנה בתוספת אסטרדיול valerate. יש להשתמש במינון 2.6 מ"ג בטא-אסטרדיול 17-valerate לכל 1 ק"ג מזון.</li>
	<li>ב 3 ימים לאחר השלמת הניתוח, להאכיל את העכברים עם אסטרדיול valerate.</li>
</ol>5. הזרקת FSH
<ol><li>הכן פתרון FSH אנושי רקומביננטי. יש להמיס אבקת FSH אנושית רקומביננטית להזרקה עם 0.9% מלח סטרילי ל-100IU/mL.</li>
	<li>קבץ עכברים על פי תוכניות ניסוי ותן ממס או מינונים שונים של FSH רקומביננטי באמצעות הזרקה תוך צפקית למשך שבועיים. על פי הפעילות הביולוגית של FSH רקומביננטי, השתמש במינון הזרקה של FSH בעכברים שווה ערך לרמת FSH בסרום אצל נשים בתקופת המעבר לגיל המעבר. הערה: בהתבסס על טיפולים שונים, עכברות שעברו כריתת אסטרוגן חולקו באופן אקראי לשלוש קבוצות, קבוצת הממס (N.S.) שקיבלה ממס של 100 מיקרוליטר ליום, קבוצת FSH במינון נמוך (L-FSH) שקיבלה 15 IU/kg משקל גוף ליום וקבוצת FSH (H-FSH) במינון גבוה שקיבלה 30 IU/kg משקל גוף ליום.</li>
</ol>

פיתוח מודל עכבר לכריתת שחלות עם רמת FSH גבוהה

<ol>
	<li>Harlow, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Executive+summary+of+the+Stages+of+Reproductive+Aging+Workshop+++10:+addressing+the+unfinished+agenda+of+staging+reproductive+aging.">Executive summary of the Stages of Reproductive Aging Workshop + 10: addressing the unfinished agenda of staging reproductive aging.</a> Journal of Clinical Endocrinology &amp; Metabolism. 97 (4), 1159-1168 (2012).</li><li>Ulloa-Aguirre, A., Zari&#241;&#225;n, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Follitropin+Receptor:+Matching+Structure+and+Function.">The Follitropin Receptor: Matching Structure and Function.</a> Molecular Pharmacology. 90 (5), 596-608 (2016).</li><li>Franks, S., Stark, J., Hardy, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Follicle+dynamics+and+anovulation+in+polycystic+ovary+syndrome.">Follicle dynamics and anovulation in polycystic ovary syndrome.</a> Human Reproduction Update. 14 (4), 367-378 (2008).</li><li>Guo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blocking+FSH+inhibits+hepatic+cholesterol+biosynthesis+and+reduces+serum+cholesterol.">Blocking FSH inhibits hepatic cholesterol biosynthesis and reduces serum cholesterol.</a> Cell Research. 29 (2), 151-166 (2019).</li><li>Xiong, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FSH+blockade+improves+cognition+in+mice+with+Alzheimer's+disease.">FSH blockade improves cognition in mice with Alzheimer's disease.</a> Nature. 603 (7901), 470-476 (2022).</li><li>Sun, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FSH+Directly+Regulates+Bone+Mass.">FSH Directly Regulates Bone Mass.</a> Cell. 125 (2), 247-260 (2006).</li><li>Liu, X. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FSH+regulates+fat+accumulation+and+redistribution+in+aging+through+the+G&#945;i/Ca(2+)/CREB+pathway.">FSH regulates fat accumulation and redistribution in aging through the G&#945;i/Ca(2+)/CREB pathway.</a> Aging Cell. 14 (3), 409-420 (2015).</li><li>Maclellan, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+Follicle-Stimulating+Hormone+Receptor+in+Vascular+Anomalies.">Expression of Follicle-Stimulating Hormone Receptor in Vascular Anomalies.</a> Plastic and Reconstructive Surgery. 133 (3), 344e-351en (2014).</li><li>Liu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blocking+FSH+induces+thermogenic+adipose+tissue+and+reduces+body+fat.">Blocking FSH induces thermogenic adipose tissue and reduces body fat.</a> Nature. 546 (7656), 107-112 (2017).</li><li>Ji, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epitope-specific+monoclonal+antibodies+to+FSH&#946;+increase+bone+mass.">Epitope-specific monoclonal antibodies to FSH&#946; increase bone mass.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (9), 2192-2197 (2018).</li><li>El Khoudary, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trajectories+of+estradiol+and+follicle-stimulating+hormone+over+the+menopause+transition+and+early+markers+of+atherosclerosis+after+menopause.">Trajectories of estradiol and follicle-stimulating hormone over the menopause transition and early markers of atherosclerosis after menopause.</a> European Journal of Preventive Cardiology. 23 (7), 694-703 (2016).</li><li>Radu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+Follicle-Stimulating+Hormone+Receptor+in+Tumor+Blood+Vessels.">Expression of Follicle-Stimulating Hormone Receptor in Tumor Blood Vessels.</a> The New England Journal of Medicine. 363 (17), 1621-1630 (2010).</li><li>Sowers, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endogenous+hormones+and+bone+turnover+markers+in+pre-+and+perimenopausal+women:+SWAN.">Endogenous hormones and bone turnover markers in pre- and perimenopausal women: SWAN.</a> Osteoporosis International. 14 (3), 191-197 (2003).</li><li>Kristensen, V. N., Kure, E. H., Erikstein, B., Harada, N., B&#248;rresen-Dale, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+susceptibility+and+environmental+estrogen-like+compounds.">Genetic susceptibility and environmental estrogen-like compounds.</a> Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis. 482 (1), 77-82 (2001).</li></ol>

למחברים אין מה לחשוף.

במהלך המעבר משלב הרבייה לשלב שאינו רבייה (גיל המעבר), נשים רבות חוות שינויים פיזיולוגיים ופתולוגיים משמעותיים. רמות FSH עולות במהלך המעבר לגיל המעבר1. מחקרים חדשים גילו כי FSH ברקמות ואיברים חוץ-גונדליים שונים הוא קריטי בפתוגנזה של מחלות רבות, כולל דיסליפידמיה4, מחלת אלצהיימר5, אוסטאופורוזיס 9,10, טרשת עורקים11, השמנת יתר9 וסרטן12. לכן, בניית מודל בעלי חיים שיכול לעזור לחקור את ההשפעות הבלתי תלויות של FSH in vivo חשוב במיוחד. מודל העכבר OVF מחקה את השלב המוקדם של המעבר לגיל המעבר עם אסטרוגן יציב יחסית ורמות FSH עולות, והוא מתאים במיוחד למחקרים לחקור את הפעולות החוץ-גונדליות של FSH.
בשיטה זו, כריתת השחלה בוצעה באמצעות חתך גב גבי יחיד, בערך 1 ס"מ מבסיס הירך כלפי מעלה (איור 1B). העור נחתך כמעט יחד עם שרירי הגב באמצעות מספריים חדים לניתוח, וכך נוצרה גישה לחלל הצפק. לאחר הניתוח, חתך השריר לא דרש תפירה, והפצע בעור נסגר דו-צדדית בתפר חתולי אחד (איור 2). הניתוח קל יותר מבחינה טכנית, גוזל פחות זמן ופחות מזיק לנקבות עכברים בהשוואה לשיטות אחרות בהן נעשה שימוש.
כמה פרטים שיש לשים לב אליהם במהלך הניתוח. ראשית, כל ההליכים הכירורגיים צריכים להישמר נקיים וסטריליים ככל האפשר כדי להפחית את הסיכון לזיהום לאחר הניתוח. שנית, מכיוון שרקמת השחלה שברירית מאוד, כלי ניתוח אינם יכולים ליצור קשר ישיר עם השחלות במהלך כריתת השחלות, כדי למנוע השתלה תוך צפקית. שלישית, לאחר הניתוח, העכברים הועברו לשמיכת טמפרטורה קבועה של 37 מעלות צלזיוס במהלך ההחלמה כדי למנוע היפותרמיה לאחר הניתוח שהובילה למוות.
מחקר קודם הוכיח כי אסטרוגן אנדוגני מסונתז בתאי תקה בשחלות של נשים לפני גיל המעבר או תאי סטרומה שומן של השד של נשים לאחר גיל המעבר ובכמויות מינוריות ברקמה היקפית14. האסטרוגן בסרום ירד בחדות עבור עכברות שעברו כריתת שחלות, אך לא ניתן לסלק אותו (איור 3B). אולם אסטרוגן אנדוגני המסונתז ברקמה חוץ-גונדלית אינו משפיע על יציבות רמות האסטרוגן במודל OVF (איור 4B).
יש כמה מגבלות במודל ה-OVF. ברגע שהניתוח אינו זהיר ומוביל להשתלה תוך צפקית בשחלות, הוא עלול להוביל לכשל מודל. במקרה זה, האסטרוגן בסרום אינו יורד בחדות ומשתנה בשלבים שונים של מחזור הייחום. לאחר מתן אקסוגני של אסטרוגן ו- FSH, לוקח כשבוע לגוף להגיע לשיווי משקל. לפיכך, שינויים פתולוגיים של מודל OVF המתרחשים בתוך 1 שבוע לא יכול להצביע על ההשפעות של FSH.
לסיכום, למודל OVF יש את היתרונות של היותו יציב, זול וקל לתפעול. ההשפעות המערכתיות של FSH ברמה גבוהה ניתן לראות לאחר הזרקה intraperitoneal של FSH; כלומר, מודל OVF מתאים למחקרים החוקרים את הפעולות החוץ-גונדליות של FSH. עם זאת, הדרישות לניתוח מודל והליכי הזרקה intraperitoneal הם גבוהים למדי. אם המימון מספיק, מודלים ספציפיים של נוקאאוט הם הבחירה הטובה ביותר.

רמות ההורמון מגרה הזקיקים (FSH) עולות במהלך המעבר לגיל המעבר (המונח מעבר לגיל המעבר הוגדר בשנת 2011 בשלבי סדנת הזדקנות הרבייה (STRAW) + מערכת 10)1. במהלך המעבר לגיל המעבר, תקופה המאופיינת בעלייה ברמות FSH ואסטרוגן1 יציב יחסית, נשים חוות שינויים במחזור החודשי ושינויים פיזיולוגיים משמעותיים המערבים תאים ורקמות שונות. שינויים אלה יכולים להשפיע באופן חמור על איכות החיים והבריאות של נשים. חקר ההשפעות של FSH עשוי לשפר את איכות החיים והבריאות של נשים.
FSH מופרש מתאי גונדוטרופ בבלוטת יותרת המוח הקדמית והוא קריטי לשליטה בתפקוד הגונדל וברבייה2. הפונקציה של FSH מתווכת באמצעות קולטן FSH (FSHR), השייך לקולטן מצומד חלבון G (GPCR)3. FSHR מתבטא בדרך כלל בגונדות, כלומר, השחלה והאשכים. הוכח כי FSHR מתבטא באופן אוניברסלי במספר תאים ורקמות חוץ-גונדליים, כולל כבד4, היפוקמפוס5, אוסטאוקלסטים6, אדיפוציטים7 ותאי אנדותל8. מחקרים חדשים חשפו פעולות גונדל נוספות של FSH ואת הרלוונטיות הקלינית הפוטנציאלית שלו בדיסליפידמיה4, מחלת אלצהיימר5, אוסטאופורוזיס 9,10, טרשת עורקים11, השמנת יתר9 וסרטן12. לכן, בניית מודל של בעלי חיים שיכול לעזור לחקור את ההשפעות הבלתי תלויות של FSH in vivo חשובה במיוחד בחקר הפעולות של FSH בלבד.
בפרוטוקול הצגנו את הנוהל להקמת מודל עכבר עם אסטרוגן יציב יחסית ורמות FSH עולות13. מודל העכבר מחקה את המעבר לגיל המעבר על ידי ניתוח לכריתת השחלות ולאחר מכן בתוספת אסטרדיול ואלרט ו- FSH רקומביננטי. כאשר לעכברות שעברו כריתת שחלות נוסף אסטרוגן אקסוגני כדי לשמור על רמות אסטרוגן דומות עם העכברים המופעלים על ידי דמה, רמות FSH אנדוגני היו יציבות עקב משוב אסטרוגן בבלוטת יותרת המוח. במצב זה, הוא יכול לשלוט ברמות FSH על ידי מתן FSH אקסוגני מבלי לשנות את רמות האסטרוגן. לפיכך, מודל העכבר OVF יכול להוציא את השפעת האסטרוגן ולבחון את ההשפעות הפיזיולוגיות והפתולוגיות של FSH. אנו מאמינים כי ההליך המפורט והחזותי שימושי לחוקרים לבסס את מודל עכבר OVF במעבדה שלהם וליישם אותו כדי לחקור שינויים פיזיולוגיים ופתולוגיים במהלך המעבר לגיל המעבר לפי הצורך.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>beta-estradiol 17-valerate</td>
			<td>Macklin</td>
			<td>E829824</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Estradiol sensitive ELISA</td>
			<td>Demeditec</td>
			<td>DE4399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin Staining Solution</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>C0107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Meloxicam</td>
			<td>Aladdin</td>
			<td>M129228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>recombinant human Follicle-stimulating hormone</td>
			<td>Merck Serono</td>
			<td>N19Z8803G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tribromoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T48402</td>
			<td>Aliphatic name: 2,2,2-Tribromoethanol</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

exploring independent effects of follicle-stimulating hormone in vivo in a mouse model

במהלך המעבר משלב הרבייה לשלב שאינו רבייה (גיל המעבר), נשים רבות חוות שינויים פיזיולוגיים ופתולוגיים משמעותיים, כולל ירידה במסת העצם, עלייה בשומנים בדם ועלייה בשומן הקרביים. רמות ההורמון מגרה הזקיקים (FSH) עולות במהלך המעבר לגיל המעבר. מחקרים רבים הראו כי FSH ברקמות ואיברים חוץ-גונדליים שונים קשור לפתוגנזה של מחלות מרובות. לכן, בניית מודל בעלי חיים שיכול לעזור לחקור את ההשפעות הבלתי תלויות של FSH in vivo חשוב במיוחד. במחקר זה, נקבות עכברות C57BL/6 עברו כריתת שחלות ובתוספת אסטרדיול ואלרט (OVX + E2) כדי לחסל את ההשפעה של ציר ההיפותלמוס-יותרת המוח-גונדל. עכברי OVX + E2 קיבלו ממס (N.S.) או מינונים שונים של FSH רקומביננטי באמצעות הזרקה תוך צפקית ליצירת מודל עכברי (OVF) המאופיין באסטרוגן יציב יחסית ורמות FSH עולות. לכן, יצרנו בהצלחה מודל עכבר ניסיוני כדי לחקות את השלב המוקדם של המעבר לגיל המעבר, המאופיין ברמות FSH גבוהות בסרום. מודל OVF יש את היתרונות של להיות יציב, עלות נמוכה, וקל לתפעול, אשר מתאים למחקרים כדי לחקור את הפעולות extragonadal של FSH. כאן, אנו מתארים פרוטוקולים מפורטים עבור מודל OVF עכבר.

Levels of follicle-stimulating hormone (FSH) rise during the menopausal transition (the term menopausal transition was defined in 2011 at stages of reproductive aging workshop (STRAW) + 10 system)1. It is during the menopausal transition, a period characterized by rising FSH levels and relatively stable estrogen1, thatwomen experience menstrual cycle changes and significant physiological changes involving various cells and tissues. These changes can seriously affect the quality of life and health of women. Exploring the effects of FSH may improve women's quality of life and health.
FSH is secreted from gonadotrope cells in the anterior pituitary and is critical in controlling gonadal function and reproduction2. The function of FSH is mediated through the FSH receptor (FSHR), which belongs to the G protein-coupled receptor (GPCR)3. FSHR is generally expressed in gonads, namely, the ovary and testis. It has been proved that FSHR is universally expressed in multiple extragonadal cells and tissues, including liver4, hippocampus5, osteoclasts6, adipocytes7, and endothelial cells8. Emerging studies have revealed extra gonadal actions of FSH and its potential clinical relevance in dyslipidemia4, Alzheimer's disease5, osteoporosis9,10, atherosclerosis11, obesity9, and cancer12. Thus, building an animal model that can help study the independent effects of FSH in vivo is particularly important in exploring the actions of FSH alone.
In the protocol, we introduced the procedure for establishing a mouse model with relatively stable estrogen and rising FSH levels13. The mouse model mimics the menopause transition by ovariectomized surgery and then supplemented with estradiol valerate and recombinant FSH. As the ovariectomized mice were supplemented with exogenous estrogen to maintain similar estrogen levels with the sham-operated mice, the levels of endogenous FSH were stable due to estrogen feedback at the pituitary gland. In this condition, it could control the FSH levels by administering exogenous FSH without altering the estrogen levels. Thus, the OVF mouse model can exclude the influence of estrogen and observe the extragonadal physiological and pathological effects of FSH. We believe the detailed and visualized procedure is useful for researchers to establish the OVF mouse model in their laboratory and apply it to investigate physiological and pathological changes during the menopause transition as needed.

מחבר זרקור: חקירת הקשר בין FSH ושינויים פתופיזיולוגיים אצל נשים לפני גיל המעבר - תובנות ממודל עכבר 

חקר השפעות עצמאיות של הורמון מגרה זקיקים in vivo במודל עכבר

Our research is focused on physiological and pathological changes in perimenopausal women. In this study, we are trying to determine which pathophysiological alternations are related to FHC. Menopause is associated with dyslipidemia and an increased risk of cardio-cerebrovascular disease.Using this mouse model, we found that follicle-stimulating hormone, independent of aspirin, increases serum cholesterol levels. Moreover, blocking FSH signaling could effectively prevent hypocholesterolemia. This mouse model mimics the early stage of the menopause transition, characterized by elevated serum FSH levels and relatively stable estrogen levels.The model has the advantages of being stable, low cost, and easy to operate, which is suitable for studies to explore the extra gonadal actions of FSH.

מודל עכבר OVF מחקה את השלב המוקדם של המעבר לגיל המעבר עם אסטרוגן יציב יחסית ורמות FSH עולות13. ראשית, לצורך ניתוח להסרת שחלות, עכברות C57BL/6 בנות 9 שבועות עברו הרדמה כללית ועברו ניתוח דמה (Sham) או כריתת שחלות דו-צדדית (OVX). כאשר תמונות מריחה של תאים מוכתמים של פאפאניקולאו זיהו בבירור את שלבי הפרואסטרוס, הייחום, המטסטרוס והדיזטרוס של מחזור הייחום, עכברי OVX איבדו את מחזור הייחום (איור 3A), ושיטת ELISA הראתה ירידה משמעותית ברמות אסטרדיול בסרום (E2) (איור 3B). שנית, עכברי OVX קיבלו תוספת של בטא-אסטרדיול 17-valerate (OVX + E2) כדי לשמור על אסטרוגן בסרום באותה רמה כמו קבוצת Sham. שלישית, עכברי OVX + E2 קיבלו ממס (N.S.) או מינונים שונים של FSH רקומביננטי באמצעות הזרקה תוך צפקית כדי ליצור מודל עכברי (OVF) המאופיין באסטרוגן יציב יחסית וברמות FSH עולות (איור 4).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65665/65665fig01.jpg"> איור 1. סביבה כירורגית ותנוחת עכבר. (א) שטח ספסל של 60 ס"מ על 60 ס"מ לפחות לניתוח. נקו את פני השטח של האזור עם 75% אלכוהול וכסו אותו במגבת רפואית חד פעמית, ולאחר מכן חיטאו בקרינה אולטרה סגולה 30 דקות מראש. (B) קבע את העכבר על משטח הניתוח בחזרה באמצעות רצועת גומי או חבל כותנה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65665/65665fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65665/65665fig02.jpg"> איור 2. שלבים עיקריים של פעולה כירורגית. (A) מנח השחלות, (B) כריתת שחלות, (C) תפר הצפק, ו-(D) חתך בעור. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65665/65665fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65665/65665fig03.jpg"> איור 3. ציטולוגיה נרתיקית. ציטולוגיה נרתיקית מייצגת שלבים של מחזור הייחום והאסטרוגן האנדוגני בעכברים שעברו כריתת שחלות (OVX) ובעכברים המופעלים על ידי דמה (Sham; n = 12 עבור קבוצת Sham; n = 10 עבור קבוצות OVX). (A) ציטולוגיה נרתיקית מייצגת שלבים במחזור הייחום בהתאם לנוכחות היחסית של לויקוציטים, תאי אפיתל שעברו קרניזציה ותאי אפיתל בעלי גרעין. שלבי הייחום כוללים פרואסטרוס, הדומיננטיות של תאי אפיתל גרעיניים; ייחום, הדומיננטיות של תאים cornified enucleated; metestrus, נוכחות של לויקוציטים, ותאי אפיתל cornified ו nucleated; Diestros, הדומיננטיות של לויקוציטים. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. (B) אסטרוגן אנדוגני בעכברים שעברו כריתת שחלות (OVX) ובעכברים המופעלים על ידי דמה (Sham). הנתונים מוצגים כממוצע ± SEM. מבחן t של התלמיד משמש לניתוח סטטיסטי. עמ< 0.001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65665/65665fig03large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65665/65665fig04.jpg"> איור 4. מודל OVF ורמות הורמונים בסרום. (A) מודל OVF של תרשים זרימה. (B) ניתוח ELISA של ריכוזי אסטרוגן בסרום (E2) ו-FSH. הנתונים מיוצגים כממוצע ± SEM. ANOVA חד-כיווני שימש לניתוח סטטיסטי. * עמ< 0.05 ו** עמ< 0.01. נתון זה שונהמ-4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65665/65665fig04large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Investigating the Relationship Between FSH and Pathophysiological Changes in Perimenopausal Women - Insights from a Mouse Model at JoVE.com

הורמון מגרה זקיק (FSH) ברקמות ואיברים חוץ-גונדליים שונים קשור לפתוגנזה של מחלות מרובות. ניתן להשתמש במודל העכבר שעבר כריתת שחלות וטיפול ב- FSH (OVF) כדי לחקור את הפעולות החוץ-גונדליות של FSH.

During the transition from a reproductive to a nonreproductive phase (menopause), many women experience significant physiological and pathological ...

המחקר שלנו מתמקד בשינויים פיזיולוגיים ופתולוגיים אצל נשים לפני גיל המעבר. במחקר זה, אנו מנסים לקבוע אילו שינויים פתופיזיולוגיים קשורים ל- FHC. גיל המעבר קשור לדיסליפידמיה ולסיכון מוגבר למחלות לב וכלי דם.באמצעות מודל עכברי זה, מצאנו כי הורמון מגרה זקיקים, ללא תלות באספירין, מעלה את רמות הכולסטרול בסרום. יתר על כן, חסימת איתות FSH יכולה למנוע ביעילות היפוכולסטרולמיה. מודל עכבר זה מחקה את השלב המוקדם של המעבר לגיל המעבר, המאופיין ברמות FSH גבוהות בסרום ורמות אסטרוגן יציבות יחסית.למודל יש את היתרונות של היותו יציב, בעלות נמוכה וקלה לתפעול, המתאימה למחקרים כדי לחקור את פעולות הגונדל הנוספות של FSH.

exploring-independent-effects-follicle-stimulating-hormone-vivo-mouse

Research

JoVE Journal

Biology

Exploring Independent Effects of Follicle-Stimulating Hormone In Vivo in a Mouse Model

During the transition from a reproductive to a nonreproductive phase (menopause), many women experience significant physiological and pathological changes, including decreased bone mass, increased blood lipids, and increased visceral adiposity. Levels of follicle-stimulating hormone (FSH) rise during the menopausal transition. Many studies have shown that FSH in various extragonadal tissues and organs is associated with the pathogenesis of multiple diseases. Thus, building an animal model that can help study the independent effects of FSH in vivo is particularly important. In this study, C57BL/6 female mice were ovariectomized and supplemented with estradiol valerate (OVX + E2) to eliminate the effect of the hypothalamic-pituitary-gonadal axis. The OVX + E2 mice received solvent (N.S.) or different doses of recombinant FSH via intraperitoneal injection to create a mouse model (OVF) characterized by relatively stable estrogen and rising FSH levels. Thus, we successfully generated an experimental mouse model to mimic the early stage of menopause transition, characterized by elevated serum FSH levels. The OVF model has the advantages of being stable, low cost, and easy to operate, which is suitable for studies to explore the extragonadal actions of FSH. Here, we describe detailed protocols for the mouse OVF model.

Follicle-stimulating hormone (FSH) in various extragonadal tissues and organs is associated with the pathogenesis of multiple diseases. The ovariectomized and FSH-treated mouse model (OVF) can be used to explore the extragonadal actions of FSH.

Creating an Ovariectomized and Follicle Stimulating Hormone (FSH)-Treated Mouse Model for Exploring the Extragonadal Actions of FSH

To begin, prepare the surgery platform setup in a room with a bench area of 60 centimeters by 60 centimeters for the operation. Clean the surface with 70%alcohol and cover it with a disposable medical towel. Then, disinfect the area with ultraviolet radiation for 30 minutes.Acclimate eight-week-old female C57 black/6 mouse to the housing facility for one week before surgery. Using a clean cotton swab, apply hair removal lotion to the back of the anesthetized mouse. After three to five minutes, remove the hairs using gauze and cotton swabs.Next, clean the skin with 70%ethanol. Fix the mouse on the surgery platform with its back facing up using a rubber strip or cotton rope, and apply iodophor solution to clean the back. For ovariectomy, using a disposable scalpel, make a one-centimeter dorsal incision longitudinally from the thigh base upwards, ensuring that only the skin and subcutaneous fascia are incised and avoiding cutting into the posterior peritoneum.Next, pull the incision to the left to visualize a white fat pad. Using microforceps and scissors, cut 0.5 centimeters along the white fat pad to expose the intraperitoneal cavity. After cutting the posterior peritoneum, using microforceps, slowly and gently remove the white fat pad from the intraperitoneal cavity.Immediately following removal, moisten the white fat tissue with 0.9%sterile saline-soaked gauze. In the lower part of the white fat pad, identify the pink granular substances as ovaries and ensure they are connected to the uterus. Using 5O absorbable sutures, ligate the ovarian end of the uterus.Then, remove the left ovary, avoiding direct contact between surgical instruments and the ovaries, preventing intraperitoneal implantation of ovarian tissue. After surgery, carefully place the white fat pad back into the intraperitoneal cavity. Then, using a 5-0 absorbable suture, perform an intermittent suture on the posterior peritoneum.Clean any areas of bleeding with gauze soaked in 0.9%sterile saline. Next, pull the skin incision to the right and remove the right ovary using the same method. Perform an intermittent suturing with 4-0 non-absorbable sutures and clean any bleeding with 0.9%sterile saline-soaked gauze.After completing both sutures, clean the wound with an iodophor solution. After 24 hours, inject meloxicam subcutaneously to relieve pain. Monitor the mouse daily to confirm proper surgical wound healing without any signs of complications.After three days, feed the mouse with freshly prepared estradiol valerate. For FSH injection, prepare FSH solution by dissolving recombinant human FSH powder in 0.9%sterile saline to 100 international units per milliliter. According to the biological activity of recombinant FSH, administer solvent or different doses of recombinant FSH via intraperitoneal injection for two weeks.The smear images of Papanicolaou-stained cells clearly identified the proestrus, estrus, metestrus, and diestrus stages of the estrus cycle. In contrast, the bilateral ovariectomy mice lost the estrus cycle. The ELIZA method showed a significant decrease in serum estradiol levels in bilateral ovariectomy mice compared to the sham group mice.The endogenous estrogen synthesized in the extra gonadal tissue does not affect the stability of estrogen levels in the FSH-treated mouse model.