Name: Author Spotlight: iPSC-cultuur automatiseren voor verbeterde reproduceerbaarheid
Uploaded: 2024-01-26T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Automating iPSC Culture for Enhanced Reproducibility at JoVE.com

Deze studie werd ondersteund door een subsidie van het New Business Promotion Center, Panasonic Production Engineering Co., Ltd., Osaka, Japan.

De ethische commissie van de Kansai Medical University keurde de generatie en het gebruik goed van de gezonde, van vrijwilligers afgeleide iPSC's genaamd KMUR001 (goedkeuring nr. 2020197). De donor, die openlijk werd gerekruteerd, gaf formele geïnformeerde toestemming en stemde in met het wetenschappelijke gebruik van de cellen.
OPMERKING: De huidige interface (de speciale software met de naam "ccssHMI" die draait onder het Windows XP-besturingssysteem) is het fundamentele bedieningsscherm. O...

Geïnduceerde pluripotente stamceldifferentiatie met behulp van een geautomatiseerd kweeksysteem

<ol>
	<li>Okita, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+more+efficient+method+to+generate+integration-free+human+iPS+cells.">A more efficient method to generate integration-free human iPS cells.</a> Nature Methods. 8 (5), 409-412 (2011).</li><li>Tanaka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+pharmacologic+testing+using+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">In vitro pharmacologic testing using human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 385 (4), 497-502 (2009).</li><li>Egashira, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disease+characterization+using+LQTS-specific+induced+pluripotent+stem+cells.">Disease characterization using LQTS-specific induced pluripotent stem cells.</a> Cardiovascular Research. 95 (4), 419-429 (2012).</li><li>Sasamata, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+a+robust+platform+for+induced+pluripotent+stem+cell+research+using+Maholo+LabDroid.">Establishment of a robust platform for induced pluripotent stem cell research using Maholo LabDroid.</a> SLAS technology. 26 (5), 441-453 (2021).</li><li>Tristan, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robotic+high-throughput+biomanufacturing+and+functional+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells.">Robotic high-throughput biomanufacturing and functional differentiation of human pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Reports. 16 (12), 3076-3092 (2021).</li><li>Konagaya, S., Ando, T., Yamauchi, T., Suemori, H., Iwata, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+maintenance+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+by+automated+cell+culture+system.">Long-term maintenance of human induced pluripotent stem cells by automated cell culture system.</a> Scientific Reports. 5, 16647 (2015).</li><li>McClymont, D. W., Freemont, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=With+all+due+respect+to+Maholo,+lab+automation+isn't+anthropomorphic.">With all due respect to Maholo, lab automation isn't anthropomorphic.</a> Nature Biotechnology. 35 (4), 312-314 (2017).</li><li>Gonzalez, F., Zalewski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Teaching+joint-level+robot+programming+with+a+new+robotics+software+tool.">Teaching joint-level robot programming with a new robotics software tool.</a> Robotics. 6 (4), 41 (2017).</li><li>Bando, K., Yamashita, H., Tsumori, M., Minoura, H., Okumura, K., Hattori, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compact+automated+culture+system+for+human+induced+pluripotent+stem+cell+maintenance+and+differentiation.">Compact automated culture system for human induced pluripotent stem cell maintenance and differentiation.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 10, 1074990 (2022).</li><li>Tohyama, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamine+oxidation+is+indispensable+for+survival+of+human+pluripotent+stem+cells.">Glutamine oxidation is indispensable for survival of human pluripotent stem cells.</a> Cell Metabolism. 23 (4), 663-674 (2016).</li><li>Yamashita, H., Fukuda, K., Hattori, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatocyte-like+cells+derived+from+human+pluripotent+stem+cells+can+be+enriched+by+a+combination+of+mitochondrial+content+and+activated+leukocyte+cell+adhesion+molecule.">Hepatocyte-like cells derived from human pluripotent stem cells can be enriched by a combination of mitochondrial content and activated leukocyte cell adhesion molecule.</a> JMA journal. 2 (2), 174-183 (2019).</li><li>Shimojo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid,+efficient+and+simple+motor+neuron+differentiation+from+human+pluripotent+stem+cells.">Rapid, efficient and simple motor neuron differentiation from human pluripotent stem cells.</a> Molecular Brain. 8 (1), 79 (2015).</li><li>Nishimoto, R., Kodama, C., Yamashita, H., Hattori, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+keratinocyte-like+cells+for+research+on+Protease-Activated+Receptor+2+in+nonhistaminergic+cascades+of+atopic+dermatitis.">Human induced pluripotent stem cell-derived keratinocyte-like cells for research on Protease-Activated Receptor 2 in nonhistaminergic cascades of atopic dermatitis.</a> The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 384 (2), 248-253 (2023).</li><li>International Stem Cell Initiative. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+ethnically+diverse+human+embryonic+stem+cells+identifies+a+chromosome+20+minimal+amplicon+conferring+growth+advantage.">Screening ethnically diverse human embryonic stem cells identifies a chromosome 20 minimal amplicon conferring growth advantage.</a> Nature Biotechnology. 29 (12), 1132-1144 (2011).</li><li>Keller, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+and+epigenetic+factors+which+modulate+differentiation+propensity+in+human+pluripotent+stem+cells.">Genetic and epigenetic factors which modulate differentiation propensity in human pluripotent stem cells.</a> Human Reproduction Update. 24 (2), 162-175 (2018).</li></ol>

Een cruciale stap in het protocol is dat als een gebruiker fouten vindt, u op elk gewenst moment op de knop annuleren, stoppen of resetten klikt en opnieuw begint vanaf de eerste stap. De software kan menselijke fouten voorkomen, waaronder dubbele boekingen, het openen van deuren terwijl de systeemtaken actief zijn en een gebrek aan aanvulling. Een ander cruciaal punt voor succesvolle en efficiënte differentiatie naar de gewenste somatische cel is de juiste selectie van pluripotente stamcellijnen, omdat elke pluripotent...

Dit artikel heeft tot doel actuele en gedetailleerde behandelingsprocedures te bieden voor een geautomatiseerd kweeksysteem voor door mensen geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC), dat we hebben geproduceerd in samenwerking met een bedrijf, en om representatieve resultaten te laten zien.
Sinds de publicatie van het artikel in 2007 trekt iPSC wereldwijd de aandacht1. Vanwege de grootste eigenschap dat het in staat is om te differentiëren in elk type somatische cel, wordt verwacht dat het zal worden toegepast op verschillende gebieden, zoals regeneratieve geneeskunde, het ophelderen van de oorzaken van hardnekkige ziekten en het ontwikkelen van nieuwe therapeutische geneesmiddelen 2,3. Bovendien zou het gebruik van menselijke iPSC-afgeleide somatische cellen dierproeven kunnen verminderen, die onderworpen zijn aan aanzienlijke ethische beperkingen. Hoewel er voortdurend tal van homogene iPSC's nodig zijn om nieuwe methoden met iPSC's te onderzoeken, is het te omslachtig om ze te beheren. Bovendien is het hanteren van iPSC moeilijk vanwege de hoge gevoeligheid, zelfs voor subtiele culturele en omgevingsveranderingen.
Om dit probleem op te lossen, wordt van geautomatiseerde kweeksystemen verwacht dat ze taken uitvoeren in plaats van mensen. Sommige groepen hebben een paar geautomatiseerde menselijke pluripotente stamcelkweeksystemen ontwikkeld voor celonderhoud en -differentiatie en hun prestaties gepubliceerd 4,5,6. Deze systemen zijn uitgerust met multi-gelede robotarm(en). Robotarmen hebben niet alleen de verdienste dat ze menselijke armbewegingen sterk nabootsen, maar ook omdat ze hogere kosten voor de arm(en), grotere en zwaardere systeemverpakkingen en tijdrovende onderwijsinspanningen van de ingenieurs vereisen om de beoogde bewegingente verkrijgen 7,8. Om het gemakkelijker te maken om het apparaat te introduceren in meer onderzoeksfaciliteiten op de punten van economisch, ruimte- en personeelsverbruik, hebben we een nieuw geautomatiseerd kweeksysteem ontwikkeld voor het onderhoud en de differentiatie van iPSC in verschillende celtypen9.
Onze reden voor het nieuwe systeem was om een X-Y-Z-asrailsysteem te gebruiken in plaats van meervoudig gelede robotarmen9. Om de complexe handachtige functies van robotarmen te vervangen, hebben we een nieuw idee toegepast op dit systeem, dat automatisch drie soorten specifieke functionele armuiteinden kan veranderen. Hier geven we ook aan hoe gebruikers gemakkelijk taakschema's kunnen maken met eenvoudige bestellingen op software vanwege het ontbreken van vereisten voor de bijdragen van ingenieurs gedurende het hele proces.
Een van de robotkweeksystemen heeft het maken van embryoïde lichamen gedemonstreerd met behulp van platen met 96 putjes als 3D-celaggregaten voor differentiatie4. Het hier gerapporteerde systeem kan geen platen met 96 putjes verwerken. Men bereikte de huidige good manufacturing practice (cGMP)-graad met behulp van een cellijn, hoewel het geen menselijke pluripotente stamcel was5. Het hier beschreven geautomatiseerde kweeksysteem is nu ontwikkeld met het specifieke doel om laboratoriumexperimenten te ondersteunen (figuur 1). Het heeft echter voldoende systemen om een schoon niveau te behouden dat gelijk is aan een veiligheidskast van niveau IV.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.15% bovine serum albumin fraction V</td>
			<td>Fuji Film Wako Chemical Inc., Miyazaki, Japan</td>
			<td>9048-46-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1% GlutaMAX</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm plastic plates&#160;</td>
			<td>Corning Inc., NY, United States</td>
			<td>430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>253G1</td>
			<td>RKEN Bioresource Research Center</td>
			<td>HPS0002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21985023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Actinin&#160; mouse</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab9465</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Activin A&#160;</td>
			<td>Nacali Tesque</td>
			<td>18585-81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenine</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A14906.30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin&#160; rabbit</td>
			<td>Dako</td>
			<td>A0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>All-trans retinoic acid</td>
			<td>Fuji Film Wako Chemical Inc.&#160;</td>
			<td>186-01114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated culture system</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 supplement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bFGF</td>
			<td>Fuji Film Wako Chemical Inc.&#160;</td>
			<td>062-06661</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BMP4&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>PHC9531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Merck</td>
			<td>810037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR-99021&#160;</td>
			<td>MCE, NJ, United States #HY-10182</td>
			<td>252917-06-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Defined Keratinocyte-SFM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10744019</td>
			<td>Human keratinocyte medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Merck</td>
			<td>266785</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dihexa&#160;</td>
			<td>TRC, Ontario, Canada</td>
			<td>13071-60-8</td>
			<td>rac-1,2-Dihexadecylglycerol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable hemocytometer</td>
			<td>CountessTM Cell Counting Chamber Slides, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C10228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dorsomorphin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1219168-18-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s modified Eagle medium/F12&#160;</td>
			<td>Fuji Film Wako Chemical Inc.</td>
			<td>12634010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF</td>
			<td>Fuji Film Wako Chemical Inc.&#160;</td>
			<td>053-07751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Essential 8&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1517001</td>
			<td>Human pluripotent stem cell medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum&#160;</td>
			<td>Biowest, FL, United States</td>
			<td>S140T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF-basic&#160;</td>
			<td>Nacalai Tesque Inc.</td>
			<td>19155-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forskolin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>J63292.MF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamine</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25030081</td>
			<td>Glutamine supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat IgG(H+L) AlexaFluo546</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A11056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HNF-4A&#160; goat</td>
			<td>Santacruz</td>
			<td>6556</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A16292.06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone 21-hemisuccinate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>H2882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iMatrix511 Silk&#160;</td>
			<td>Nippi Inc., Tokyo, Japan</td>
			<td>892 021</td>
			<td>Cell culture matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin-transferrin-selenium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>41400045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Keratin 1&#160; mouse</td>
			<td>Santacruz</td>
			<td>376224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Keratin 10&#160; rabbit</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>19054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KMUR001</td>
			<td>Kansai Medical University&#160;</td>
			<td></td>
			<td>Patient-derived iPSCs&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knockout serum replacement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10828010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-ascorbic acid 2-phosphate&#160;</td>
			<td>A8960, Merck</td>
			<td>A8960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz&#8217;s L-15 medium&#160;</td>
			<td>Fuji Film Wako Chemical Inc.</td>
			<td>128-06075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning Inc.</td>
			<td>354277</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG(H+L) AlexaFluo488</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A21202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 supplement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17502048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nestin mouse</td>
			<td>Santacruz</td>
			<td>23927</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21103049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurofilament&#160; rabbit</td>
			<td>Chemicon</td>
			<td>AB1987</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutristem</td>
			<td>Sartrius AG, G&#246;ttingen, Germany</td>
			<td>05-100-1A</td>
			<td>cell culture medium&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oct 3/4&#160; mouse</td>
			<td>BD</td>
			<td>611202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS(-)</td>
			<td>Nacalai Tesque Inc., Kyoto, Japan</td>
			<td>14249-24</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit IgG(H+L) AlexaFluo488</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A21206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit IgG(H+L) AlexaFluo546</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A10040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human albumin&#160;</td>
			<td>A0237, Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>A9731</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rho kinase inhibitor, Y-27632&#160;</td>
			<td>Sellec Inc., Tokyo, Japan</td>
			<td>129830-38-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RIKEN 2F</td>
			<td>RKEN Bioresource Research Center</td>
			<td>HPS0014</td>
			<td>undifferentiated hiPSCs&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific #11875</td>
			<td>12633020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB431542</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>301836-41-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium L-ascorbate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>A4034-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SSEA-4&#160; mouse</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB4304</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemFit AK02N&#160;</td>
			<td>Ajinomoto, Tokyo, Japan</td>
			<td>AK02</td>
			<td>cell culture medium&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TnT rabbit</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab92546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRA 1-81 mouse</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB4381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triiodothyronine</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>H34068.06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TripLETM express enzyme&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, United States</td>
			<td>12604013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue solution&#160;</td>
			<td>Nacalai Tesque, Kyoto, Japan</td>
			<td>20577-34</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptose phosphate broth</td>
			<td>Merck</td>
			<td>T8782-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wnt-C59&#160;</td>
			<td>Bio-techne, NB, United Kingdom</td>
			<td>5148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;&#160;<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/65672/65672eq01v2.jpg" style="margin: auto;" /> Tublin&#160; mouse</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G712A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an automated culture system for maintaining and differentiating human-induced pluripotent stem cells

Van door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSC's) met een oneindig zelfprolifererend vermogen wordt verwacht dat ze toepassingen hebben op tal van gebieden, waaronder de opheldering van zeldzame ziektepathologieën, de ontwikkeling van nieuwe geneesmiddelen en regeneratieve geneeskunde die gericht is op het herstellen van beschadigde organen. Desondanks is de maatschappelijke implementatie van hiPSC's nog steeds beperkt. Dit is deels te wijten aan de moeilijkheid om differentiatie in cultuur te reproduceren, zelfs met geavanceerde kennis en geavanceerde technische vaardigheden, vanwege de hoge gevoeligheid van iPSC's voor minieme veranderingen in de omgeving. De toepassing van een geautomatiseerd kweeksysteem kan dit probleem oplossen. Experimenten met een hoge reproduceerbaarheid, onafhankelijk van de vaardigheden van een onderzoeker, kunnen worden verwacht volgens een gedeelde procedure tussen verschillende instituten. Hoewel er eerder verschillende geautomatiseerde kweeksystemen zijn ontwikkeld die iPSC-culturen kunnen handhaven en differentiatie kunnen induceren, zijn deze systemen zwaar, groot en kostbaar omdat ze gebruik maken van gehumaniseerde, meervoudig gearticuleerde robotarmen. Om de bovenstaande problemen te verbeteren, hebben we een nieuw systeem ontwikkeld met behulp van een eenvoudig x-y-z as schuifrailsysteem, waardoor het compacter, lichter en goedkoper kan zijn. Bovendien kan de gebruiker in het nieuwe systeem eenvoudig parameters wijzigen om nieuwe afhandelingstaken te ontwikkelen. Zodra een taak is vastgesteld, hoeft de gebruiker alleen nog maar de iPSC voor te bereiden, de reagentia en verbruiksartikelen die nodig zijn voor de gewenste taak van tevoren te leveren, het taaknummer te selecteren en de tijd op te geven. We bevestigden dat het systeem iPSC's in een ongedifferentieerde toestand kon houden door verschillende passages zonder voedingscellen en differentiëren in verschillende celtypen, waaronder cardiomyocyten, hepatocyten, neurale voorlopercellen en keratinocyten. Het systeem zal zeer reproduceerbare experimenten tussen instellingen mogelijk maken zonder dat er geschoolde onderzoekers nodig zijn, en zal de sociale implementatie van hiPSC's in een breder scala van onderzoeksgebieden vergemakkelijken door de belemmeringen voor nieuwe inzendingen te verminderen.

This article aims to provide actual and detailed handling procedures for an automated culture system for human induced pluripotent stem cells (iPSC), which we produced by collaborating with a company, and to show representative results.
Since the publication of the article in 2007, iPSC has been attracting attention all over the world1. Due to its greatest feature of being able to differentiate into any type of somatic cell, it is expected to be applied in various fields such as regenerative medicine, elucidating the causes of intractable diseases, and developing new therapeutic drugs2,3. In addition, using human iPSC-derived somatic cells could reduce animal experiments, which are subject to significant ethical restrictions. Although numerous homogeneous iPSCs are constantly required to research new methods with iPSCs, it is too laborious to manage them. Moreover, handling iPSC is difficult because of its high sensitivity, even to subtle cultural and environmental changes.
To solve this problem, automated culture systems are expected to perform tasks instead of humans. Some groups have developed a few automated human pluripotent stem cell culture systems for cell maintenance and differentiation and published their achievements4,5,6. These systems equip multiarticulated robotic arm(s). Robotic arms have not only merit in that they highly mimic human arm movements but also demerit in that they require higher cost(s) for the arm(s), larger and heavier system packaging, and time-consuming education efforts by the engineers to obtain the aimed movements7,8. In order to make it easier to introduce the apparatus to more research facilities at the points of economic, space, and human resource consumption, we have developed a novel automated culture system for the maintenance and differentiation of iPSC into various cell types9.
Our rationale for the new system was to adopt an X-Y-Z axis rail system instead of multiarticulated robotic arms9. To replace the complex hand-like functions of robotic arms, we applied a new idea to this system, which can automatically change three types of specific functional arm tips. Here, we also indicate how users can easily make task schedules with simple orders on software because of the lack of requirements for engineers&#39; contributions throughout the process.
One of the robotic culture systems has demonstrated the making of embryoid bodies using 96-well plates as 3D cell aggregates for differentiation4. The system reported here cannot handle 96-well plates. One achieved the current good manufacturing practice (cGMP) grade using a cell line, although it was not a human pluripotent stem cell5. The automated culture system detailed here has now been developed with the specific aim of helping laboratory experiments (Figure 1). However, it has enough systems to keep clean levels equivalent to a level IV safety cabinet.

Author Spotlight: iPSC-cultuur automatiseren voor verbeterde reproduceerbaarheid 

Een geautomatiseerd kweeksysteem voor het onderhouden en differentiëren van door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen

This study focuses on automating the culture of iPS cells. Our goal is to reduce the variability due to manual experimentations and human labor, by utilizing smaller and more affordable equipment, which leads to enhance the reproducibility, and provide opportunities for more researchers who are even unfamiliar with iPS cells. Several types of automated culture machines have emerged, but most of them are still large, costly, and can only perform partial tasks.The simpler structure of the working urn has reduced the size and cost of the equipment. In addition, the tasks from cell maintenance to differentiation induction can be performed automatically, with only prior material preparation, and task setting on software. Machine repetition is remarkably accurate compared to human repetition.The use of such machines not only improves repeat usability, but also reduce human labor. Furthermore, if the parameters in each protocol are shared, researchers unfamiliar with iPS cells will be able to achieve similar results as well-experienced researchers, making it possible for them to easily enter into research using iPS cells. We are exploring the possibility of incorporating an AI-based image judgment system to automate the selection of the next work schedule, setting date, and work content from the learning of the experiment results.We also anticipate that allowing researchers to tailor their working protocols to their preferences, and share them online, will not only enhance reproducibility among the world researchers, but also encourage global research collaboration.

Onderhoud van door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen We gebruikten drie hPSC-lijnen (RIKEN-2F, 253G1 en KMUR001). We hebben het onderhoudsprotocol geoptimaliseerd door middel van dagelijks handmatig uitgevoerde experimenten en de gedetailleerde programma's verder geoptimaliseerd door de zeven voorbereidende experimenten die door het systeem zijn uitgevoerd. Schuifspanningen die worden veroorzaakt door de vloeistofsnelheden van de spuugstroom van verschillende pipetten die door mensen worde...

Watch this Scientific Journal Video about Automating iPSC Culture for Enhanced Reproducibility at JoVE.com

Hier presenteren we een protocol voor een geautomatiseerd celkweeksysteem. Dit geautomatiseerde kweeksysteem vermindert arbeid en komt ten goede aan de gebruikers, waaronder onderzoekers die niet bekend zijn met het hanteren van geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPS), van het onderhoud van iPS-cellen tot differentiatie in verschillende soorten cellen.

Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) with infinite self-proliferating ability have been expected to have applications in numerous fields, ...

Dit onderzoek richt zich op het automatiseren van de kweek van iPS-cellen. Ons doel is om de variabiliteit als gevolg van handmatige experimenten en menselijke arbeid te verminderen, door gebruik te maken van kleinere en meer betaalbare apparatuur, wat leidt tot een betere reproduceerbaarheid en kansen biedt voor meer onderzoekers die zelfs niet bekend zijn met iPS-cellen. Er zijn verschillende soorten geautomatiseerde kweekmachines ontstaan, maar de meeste zijn nog steeds groot, kostbaar en kunnen slechts gedeeltelijke taken uitvoeren.De eenvoudigere structuur van de werkurn heeft de grootte en kosten van de apparatuur verminderd. Bovendien kunnen de taken van celonderhoud tot differentiatie-inductie automatisch worden uitgevoerd, met alleen voorafgaande materiaalvoorbereiding en taakinstelling op software. Machineherhaling is opmerkelijk nauwkeurig in vergelijking met menselijke herhaling.Het gebruik van dergelijke machines verbetert niet alleen de herhaalbruikbaarheid, maar vermindert ook de menselijke arbeid. Bovendien, als de parameters in elk protocol worden gedeeld, zullen onderzoekers die niet bekend zijn met iPS-cellen vergelijkbare resultaten kunnen bereiken als ervaren onderzoekers, waardoor ze gemakkelijk onderzoek kunnen doen met iPS-cellen. We onderzoeken de mogelijkheid om een op AI gebaseerd beeldbeoordelingssysteem op te nemen om de selectie van het volgende werkschema, de datum en de werkinhoud te automatiseren op basis van het leren van de experimentresultaten.We verwachten ook dat het toestaan van onderzoekers om hun werkprotocollen aan te passen aan hun voorkeuren en deze online te delen, niet alleen de reproduceerbaarheid onder de onderzoekers over de hele wereld zal vergroten, maar ook wereldwijde onderzoekssamenwerking zal aanmoedigen.

an-automated-culture-system-for-maintaining-differentiating-human

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

An Automated Culture System for Maintaining and Differentiating Human-Induced Pluripotent Stem Cells

Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) with infinite self-proliferating ability have been expected to have applications in numerous fields, including the elucidation of rare disease pathologies, the development of new medicines, and regenerative medicine aiming to restore damaged organs. Despite this, the social implementation of hiPSCs is still limited. This is partly because of the difficulty of reproducing differentiation in culture, even with advanced knowledge and sophisticated technical skills, due to the high sensitivity of iPSCs to minute environmental changes. The application of an automated culture system can solve this issue. Experiments with high reproducibility independent of a researcher's skill can be expected according to a shared procedure across various institutes. Although several automated culture systems that can maintain iPSC cultures and induce differentiation have been developed previously, these systems are heavy, large, and costly because they make use of humanized, multi-articulated robotic arms. To improve on the above issues, we developed a new system using a simple x-y-z axis slide rail system, allowing it to be more compact, lighter, and cheaper. Furthermore, the user can easily modify parameters in the new system to develop new handling tasks. Once a task is established, all the user needs to do is prepare the iPSC, supply the reagents and consumables needed for the desired task in advance, select the task number, and specify the time. We confirmed that the system could maintain iPSCs in an undifferentiated state through several passages without feeder cells and differentiate into various cell types, including cardiomyocytes, hepatocytes, neural progenitors, and keratinocytes. The system will enable highly reproducible experiments across institutions without the need for skilled researchers and will facilitate the social implementation of hiPSCs in a wider range of research fields by diminishing the obstacles for new entries.

Here, we present a protocol for an automated cell culture system. This automated culture system reduces labor and benefits the users, including researchers unfamiliar with handling induced pluripotent stem (iPS) cells, from the maintenance of iPS cells to differentiation into various types of cells.