Name: Author Spotlight: אוטומציה של תרבות iPSC לשיפור יכולת השחזור
Uploaded: 2024-01-26T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Automating iPSC Culture for Enhanced Reproducibility at JoVE.com

מחקר זה נתמך על ידי מענק מהמרכז לקידום עסקים חדשים, Panasonic Production Engineering Co., Ltd., אוסקה, יפן.

ועדת האתיקה של האוניברסיטה הרפואית של קנסאי אישרה את הייצור והשימוש בתאי גזע פלוריפוטנטיים פלוריפוטנטיים בריאים שמקורם במתנדבים בשם KMUR001 (אישור מס' 2020197). התורם, שגויס בגלוי, סיפק הסכמה רשמית מדעת והסכים לשימוש המדעי בתאים.
הערה: הממשק הנוכחי (התוכנה המיוחדת בשם "ccssHMI" הפועלת ...

התמיינות תאי גזע פלוריפוטנטית מושרית באמצעות מערכת תרבית אוטומטית

<ol>
	<li>Okita, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+more+efficient+method+to+generate+integration-free+human+iPS+cells.">A more efficient method to generate integration-free human iPS cells.</a> Nature Methods. 8 (5), 409-412 (2011).</li><li>Tanaka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+pharmacologic+testing+using+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">In vitro pharmacologic testing using human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 385 (4), 497-502 (2009).</li><li>Egashira, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disease+characterization+using+LQTS-specific+induced+pluripotent+stem+cells.">Disease characterization using LQTS-specific induced pluripotent stem cells.</a> Cardiovascular Research. 95 (4), 419-429 (2012).</li><li>Sasamata, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+a+robust+platform+for+induced+pluripotent+stem+cell+research+using+Maholo+LabDroid.">Establishment of a robust platform for induced pluripotent stem cell research using Maholo LabDroid.</a> SLAS technology. 26 (5), 441-453 (2021).</li><li>Tristan, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robotic+high-throughput+biomanufacturing+and+functional+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells.">Robotic high-throughput biomanufacturing and functional differentiation of human pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Reports. 16 (12), 3076-3092 (2021).</li><li>Konagaya, S., Ando, T., Yamauchi, T., Suemori, H., Iwata, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+maintenance+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+by+automated+cell+culture+system.">Long-term maintenance of human induced pluripotent stem cells by automated cell culture system.</a> Scientific Reports. 5, 16647 (2015).</li><li>McClymont, D. W., Freemont, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=With+all+due+respect+to+Maholo,+lab+automation+isn't+anthropomorphic.">With all due respect to Maholo, lab automation isn't anthropomorphic.</a> Nature Biotechnology. 35 (4), 312-314 (2017).</li><li>Gonzalez, F., Zalewski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Teaching+joint-level+robot+programming+with+a+new+robotics+software+tool.">Teaching joint-level robot programming with a new robotics software tool.</a> Robotics. 6 (4), 41 (2017).</li><li>Bando, K., Yamashita, H., Tsumori, M., Minoura, H., Okumura, K., Hattori, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compact+automated+culture+system+for+human+induced+pluripotent+stem+cell+maintenance+and+differentiation.">Compact automated culture system for human induced pluripotent stem cell maintenance and differentiation.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 10, 1074990 (2022).</li><li>Tohyama, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamine+oxidation+is+indispensable+for+survival+of+human+pluripotent+stem+cells.">Glutamine oxidation is indispensable for survival of human pluripotent stem cells.</a> Cell Metabolism. 23 (4), 663-674 (2016).</li><li>Yamashita, H., Fukuda, K., Hattori, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatocyte-like+cells+derived+from+human+pluripotent+stem+cells+can+be+enriched+by+a+combination+of+mitochondrial+content+and+activated+leukocyte+cell+adhesion+molecule.">Hepatocyte-like cells derived from human pluripotent stem cells can be enriched by a combination of mitochondrial content and activated leukocyte cell adhesion molecule.</a> JMA journal. 2 (2), 174-183 (2019).</li><li>Shimojo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid,+efficient+and+simple+motor+neuron+differentiation+from+human+pluripotent+stem+cells.">Rapid, efficient and simple motor neuron differentiation from human pluripotent stem cells.</a> Molecular Brain. 8 (1), 79 (2015).</li><li>Nishimoto, R., Kodama, C., Yamashita, H., Hattori, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+keratinocyte-like+cells+for+research+on+Protease-Activated+Receptor+2+in+nonhistaminergic+cascades+of+atopic+dermatitis.">Human induced pluripotent stem cell-derived keratinocyte-like cells for research on Protease-Activated Receptor 2 in nonhistaminergic cascades of atopic dermatitis.</a> The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 384 (2), 248-253 (2023).</li><li>International Stem Cell Initiative. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+ethnically+diverse+human+embryonic+stem+cells+identifies+a+chromosome+20+minimal+amplicon+conferring+growth+advantage.">Screening ethnically diverse human embryonic stem cells identifies a chromosome 20 minimal amplicon conferring growth advantage.</a> Nature Biotechnology. 29 (12), 1132-1144 (2011).</li><li>Keller, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+and+epigenetic+factors+which+modulate+differentiation+propensity+in+human+pluripotent+stem+cells.">Genetic and epigenetic factors which modulate differentiation propensity in human pluripotent stem cells.</a> Human Reproduction Update. 24 (2), 162-175 (2018).</li></ol>

שלב קריטי בפרוטוקול הוא שאם משתמש מוצא תקלות כלשהן, לחץ על לחצן ביטול, עצירה או איפוס בכל עת והתחל מחדש מהצעד הראשון. התוכנה יכולה למנוע טעויות אנוש, כולל הזמנה כפולה, פתיחת דלתות בזמן שמשימות המערכת פעילות, וחוסר חידוש. נקודה קריטית נוספת להתמיינות מוצלחת ויעילה לתא הסומטי הרצוי היא בחירה ...

מאמר זה נועד לספק נהלי טיפול בפועל ומפורטים עבור מערכת תרבית אוטומטית עבור תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם (iPSC), אשר ייצרנו על ידי שיתוף פעולה עם חברה, ולהציג תוצאות מייצגות.
מאז פרסום המאמר בשנת 2007, iPSC מושך תשומת לב בכל רחבי העולם1. בשל התכונה הגדולה ביותר של היכולת להתמיין לכל סוג של תא סומטי, הוא צפוי להיות מיושם בתחומים שונים כגון רפואה רגנרטיבית, להבהיר את הגורמים למחלות עקשניות, ופיתוח תרופות טיפוליות חדשות 2,3. בנוסף, שימוש בתאים סומטיים שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים בבני אדם עשוי להפחית ניסויים בבעלי חיים, הכפופים למגבלות אתיות משמעותיות. למרות שתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים הומוגניים רבים נדרשים כל הזמן לחקור שיטות חדשות עם iPSCs, זה מייגע מדי לנהל אותם. יתר על כן, הטיפול ב- iPSC קשה בגלל רגישותו הגבוהה, אפילו לשינויים תרבותיים וסביבתיים עדינים.
כדי לפתור בעיה זו, מערכות תרבות אוטומטיות צפויות לבצע משימות במקום בני אדם. קבוצות מסוימות פיתחו כמה מערכות אוטומטיות לתרבית תאי גזע פלוריפוטנטיות אנושיות לתחזוקה והתמיינות של תאים ופרסמו את הישגיהן 4,5,6. מערכות אלה מציידות זרועות רובוטיות רב-מפרקיות. לזרועות רובוטיות יש לא רק ערך בכך שהן מחקות מאוד תנועות זרוע אנושיות, אלא גם ראויות בכך שהן דורשות עלויות גבוהות יותר עבור הזרוע(ות), אריזות מערכת גדולות וכבדות יותר, ומאמצי חינוך גוזלי זמן על ידי המהנדסים כדי להשיג את התנועות המכוונות 7,8. על מנת להקל על החדרת המנגנון למתקני מחקר נוספים בנקודות של צריכת משאבים כלכליים, חלל ומשאבי אנוש, פיתחנו מערכת תרבית אוטומטית חדשנית לתחזוקה והתמיינות של iPSC לסוגי תאים שונים9.
הרציונל שלנו למערכת החדשה היה לאמץ מערכת מסילות ציר X-Y-Z במקום זרועות רובוטיות רב-מפרקיות9. כדי להחליף את הפונקציות המורכבות דמויות היד של זרועות רובוטיות, יישמנו רעיון חדש למערכת זו, אשר יכול לשנות באופן אוטומטי שלושה סוגים של קצוות זרוע פונקציונליים ספציפיים. כאן, אנו גם מציינים כיצד משתמשים יכולים בקלות לבצע לוחות זמנים של משימות עם הזמנות פשוטות בתוכנה בגלל היעדר דרישות לתרומות המהנדסים לאורך כל התהליך.
אחת ממערכות התרבית הרובוטיות הדגימה יצירת גופים עובריים באמצעות לוחות 96 בארות כצברי תאים תלת-ממדיים להתמיינות4. המערכת המדווחת כאן אינה יכולה להתמודד עם לוחות 96 בארות. אחד מהם השיג את הציון הנוכחי של תנאי ייצור נאותים (cGMP) באמצעות קו תאים, למרות שזה לא היה תא גזע פלוריפוטנטי אנושי5. מערכת התרביות האוטומטיות המפורטת כאן פותחה כעת במטרה ספציפית לסייע בניסויי מעבדה (איור 1). עם זאת, יש לו מספיק מערכות כדי לשמור על רמות נקיות שוות ערך לארון בטיחות ברמה IV.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.15% bovine serum albumin fraction V</td>
			<td>Fuji Film Wako Chemical Inc., Miyazaki, Japan</td>
			<td>9048-46-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1% GlutaMAX</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm plastic plates&#160;</td>
			<td>Corning Inc., NY, United States</td>
			<td>430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>253G1</td>
			<td>RKEN Bioresource Research Center</td>
			<td>HPS0002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21985023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Actinin&#160; mouse</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab9465</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Activin A&#160;</td>
			<td>Nacali Tesque</td>
			<td>18585-81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenine</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A14906.30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin&#160; rabbit</td>
			<td>Dako</td>
			<td>A0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>All-trans retinoic acid</td>
			<td>Fuji Film Wako Chemical Inc.&#160;</td>
			<td>186-01114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated culture system</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 supplement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bFGF</td>
			<td>Fuji Film Wako Chemical Inc.&#160;</td>
			<td>062-06661</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BMP4&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>PHC9531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Merck</td>
			<td>810037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR-99021&#160;</td>
			<td>MCE, NJ, United States #HY-10182</td>
			<td>252917-06-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Defined Keratinocyte-SFM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10744019</td>
			<td>Human keratinocyte medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Merck</td>
			<td>266785</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dihexa&#160;</td>
			<td>TRC, Ontario, Canada</td>
			<td>13071-60-8</td>
			<td>rac-1,2-Dihexadecylglycerol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable hemocytometer</td>
			<td>CountessTM Cell Counting Chamber Slides, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C10228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dorsomorphin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1219168-18-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s modified Eagle medium/F12&#160;</td>
			<td>Fuji Film Wako Chemical Inc.</td>
			<td>12634010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF</td>
			<td>Fuji Film Wako Chemical Inc.&#160;</td>
			<td>053-07751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Essential 8&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1517001</td>
			<td>Human pluripotent stem cell medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum&#160;</td>
			<td>Biowest, FL, United States</td>
			<td>S140T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF-basic&#160;</td>
			<td>Nacalai Tesque Inc.</td>
			<td>19155-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forskolin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>J63292.MF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamine</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25030081</td>
			<td>Glutamine supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat IgG(H+L) AlexaFluo546</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A11056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HNF-4A&#160; goat</td>
			<td>Santacruz</td>
			<td>6556</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A16292.06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone 21-hemisuccinate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>H2882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iMatrix511 Silk&#160;</td>
			<td>Nippi Inc., Tokyo, Japan</td>
			<td>892 021</td>
			<td>Cell culture matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin-transferrin-selenium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>41400045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Keratin 1&#160; mouse</td>
			<td>Santacruz</td>
			<td>376224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Keratin 10&#160; rabbit</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>19054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KMUR001</td>
			<td>Kansai Medical University&#160;</td>
			<td></td>
			<td>Patient-derived iPSCs&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knockout serum replacement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10828010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-ascorbic acid 2-phosphate&#160;</td>
			<td>A8960, Merck</td>
			<td>A8960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz&#8217;s L-15 medium&#160;</td>
			<td>Fuji Film Wako Chemical Inc.</td>
			<td>128-06075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning Inc.</td>
			<td>354277</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG(H+L) AlexaFluo488</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A21202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 supplement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17502048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nestin mouse</td>
			<td>Santacruz</td>
			<td>23927</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21103049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurofilament&#160; rabbit</td>
			<td>Chemicon</td>
			<td>AB1987</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutristem</td>
			<td>Sartrius AG, G&#246;ttingen, Germany</td>
			<td>05-100-1A</td>
			<td>cell culture medium&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oct 3/4&#160; mouse</td>
			<td>BD</td>
			<td>611202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS(-)</td>
			<td>Nacalai Tesque Inc., Kyoto, Japan</td>
			<td>14249-24</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit IgG(H+L) AlexaFluo488</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A21206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit IgG(H+L) AlexaFluo546</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A10040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human albumin&#160;</td>
			<td>A0237, Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>A9731</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rho kinase inhibitor, Y-27632&#160;</td>
			<td>Sellec Inc., Tokyo, Japan</td>
			<td>129830-38-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RIKEN 2F</td>
			<td>RKEN Bioresource Research Center</td>
			<td>HPS0014</td>
			<td>undifferentiated hiPSCs&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific #11875</td>
			<td>12633020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB431542</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>301836-41-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium L-ascorbate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>A4034-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SSEA-4&#160; mouse</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB4304</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemFit AK02N&#160;</td>
			<td>Ajinomoto, Tokyo, Japan</td>
			<td>AK02</td>
			<td>cell culture medium&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TnT rabbit</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab92546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRA 1-81 mouse</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB4381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triiodothyronine</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>H34068.06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TripLETM express enzyme&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, United States</td>
			<td>12604013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue solution&#160;</td>
			<td>Nacalai Tesque, Kyoto, Japan</td>
			<td>20577-34</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptose phosphate broth</td>
			<td>Merck</td>
			<td>T8782-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wnt-C59&#160;</td>
			<td>Bio-techne, NB, United Kingdom</td>
			<td>5148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;&#160;<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/65672/65672eq01v2.jpg" style="margin: auto;" /> Tublin&#160; mouse</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G712A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an automated culture system for maintaining and differentiating human-induced pluripotent stem cells

תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם (hiPSCs) עם יכולת אינסופית של התרבות עצמית צפויים להיות בעלי יישומים בתחומים רבים, כולל הבהרה של פתולוגיות של מחלות נדירות, פיתוח תרופות חדשות ורפואה רגנרטיבית שמטרתה לשקם איברים פגועים. למרות זאת, היישום החברתי של hiPSCs עדיין מוגבל. זאת, בין היתר, בשל הקושי לשחזר את הבידול בתרבות, אפילו עם ידע מתקדם וכישורים טכניים מתוחכמים, בשל הרגישות הגבוהה של תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים לשינויים סביבתיים זעירים. היישום של מערכת תרבות אוטומטית יכול לפתור בעיה זו. ניתן לצפות לניסויים בעלי יכולת שחזור גבוהה שאינה תלויה במיומנותו של החוקר על פי נוהל משותף בין מכונים שונים. למרות שמספר מערכות תרבות אוטומטיות המסוגלות לשמור על תרביות iPSC ולגרום לבידול פותחו בעבר, מערכות אלה הן כבדות, גדולות ויקרות מכיוון שהן עושות שימוש בזרועות רובוטיות אנושיות ורב-מפרקיות. כדי לשפר את הבעיות הנ"ל, פיתחנו מערכת חדשה באמצעות מערכת פשוטה של מסילות הזזה על ציר x-y-z, המאפשרת לה להיות קומפקטית יותר, קלה יותר וזולה יותר. יתר על כן, המשתמש יכול בקלות לשנות פרמטרים במערכת החדשה כדי לפתח משימות טיפול חדשות. לאחר קביעת משימה, כל שעל המשתמש לעשות הוא להכין את ה- iPSC, לספק מראש את הריאגנטים והחומרים המתכלים הדרושים למשימה הרצויה, לבחור את מספר המשימה ולציין את השעה. אישרנו כי המערכת יכולה לשמור על תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים במצב בלתי ממוין באמצעות מספר מעברים ללא תאי הזנה ולהתמיין לסוגי תאים שונים, כולל קרדיומיוציטים, הפטוציטים, אבות עצביים וקרטינוציטים. המערכת תאפשר ניסויים בעלי יכולת שחזור גבוהה בין מוסדות ללא צורך בחוקרים מיומנים ותקל על יישום חברתי של hiPSCs במגוון רחב יותר של תחומי מחקר על ידי הפחתת המכשולים לערכים חדשים.

This article aims to provide actual and detailed handling procedures for an automated culture system for human induced pluripotent stem cells (iPSC), which we produced by collaborating with a company, and to show representative results.
Since the publication of the article in 2007, iPSC has been attracting attention all over the world1. Due to its greatest feature of being able to differentiate into any type of somatic cell, it is expected to be applied in various fields such as regenerative medicine, elucidating the causes of intractable diseases, and developing new therapeutic drugs2,3. In addition, using human iPSC-derived somatic cells could reduce animal experiments, which are subject to significant ethical restrictions. Although numerous homogeneous iPSCs are constantly required to research new methods with iPSCs, it is too laborious to manage them. Moreover, handling iPSC is difficult because of its high sensitivity, even to subtle cultural and environmental changes.
To solve this problem, automated culture systems are expected to perform tasks instead of humans. Some groups have developed a few automated human pluripotent stem cell culture systems for cell maintenance and differentiation and published their achievements4,5,6. These systems equip multiarticulated robotic arm(s). Robotic arms have not only merit in that they highly mimic human arm movements but also demerit in that they require higher cost(s) for the arm(s), larger and heavier system packaging, and time-consuming education efforts by the engineers to obtain the aimed movements7,8. In order to make it easier to introduce the apparatus to more research facilities at the points of economic, space, and human resource consumption, we have developed a novel automated culture system for the maintenance and differentiation of iPSC into various cell types9.
Our rationale for the new system was to adopt an X-Y-Z axis rail system instead of multiarticulated robotic arms9. To replace the complex hand-like functions of robotic arms, we applied a new idea to this system, which can automatically change three types of specific functional arm tips. Here, we also indicate how users can easily make task schedules with simple orders on software because of the lack of requirements for engineers&#39; contributions throughout the process.
One of the robotic culture systems has demonstrated the making of embryoid bodies using 96-well plates as 3D cell aggregates for differentiation4. The system reported here cannot handle 96-well plates. One achieved the current good manufacturing practice (cGMP) grade using a cell line, although it was not a human pluripotent stem cell5. The automated culture system detailed here has now been developed with the specific aim of helping laboratory experiments (Figure 1). However, it has enough systems to keep clean levels equivalent to a level IV safety cabinet.

Author Spotlight: אוטומציה של תרבות iPSC לשיפור יכולת השחזור 

מערכת תרבית אוטומטית לשמירה והתמיינות של תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם

This study focuses on automating the culture of iPS cells. Our goal is to reduce the variability due to manual experimentations and human labor, by utilizing smaller and more affordable equipment, which leads to enhance the reproducibility, and provide opportunities for more researchers who are even unfamiliar with iPS cells. Several types of automated culture machines have emerged, but most of them are still large, costly, and can only perform partial tasks.The simpler structure of the working urn has reduced the size and cost of the equipment. In addition, the tasks from cell maintenance to differentiation induction can be performed automatically, with only prior material preparation, and task setting on software. Machine repetition is remarkably accurate compared to human repetition.The use of such machines not only improves repeat usability, but also reduce human labor. Furthermore, if the parameters in each protocol are shared, researchers unfamiliar with iPS cells will be able to achieve similar results as well-experienced researchers, making it possible for them to easily enter into research using iPS cells. We are exploring the possibility of incorporating an AI-based image judgment system to automate the selection of the next work schedule, setting date, and work content from the learning of the experiment results.We also anticipate that allowing researchers to tailor their working protocols to their preferences, and share them online, will not only enhance reproducibility among the world researchers, but also encourage global research collaboration.

תחזוקה של תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי אדם השתמשנו בשלושה קווי hPSC (RIKEN-2F, 253G1 ו-KMUR001). ביצענו אופטימיזציה של פרוטוקול התחזוקה באמצעות ניסויים ידניים יומיים ואופטימיזציה נוספת של התוכניות המפורטות באמצעות שבעת הניסויים המקדימים שבוצעו על ידי המערכת. לדוגמה, לחצי גזירה הנג...

Watch this Scientific Journal Video about Automating iPSC Culture for Enhanced Reproducibility at JoVE.com

כאן, אנו מציגים פרוטוקול למערכת תרבית תאים אוטומטית. מערכת תרבית אוטומטית זו מפחיתה את העבודה ומועילה למשתמשים, כולל חוקרים שאינם בקיאים בטיפול בתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPS), החל מתחזוקה של תאי iPS ועד התמיינות לסוגים שונים של תאים.

Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) with infinite self-proliferating ability have been expected to have applications in numerous fields, ...

מחקר זה מתמקד באוטומציה של תרבית תאי iPS. המטרה שלנו היא להפחית את השונות עקב ניסויים ידניים ועבודה אנושית, על ידי שימוש בציוד קטן יותר וזול יותר, מה שמוביל לשיפור יכולת השחזור, ומספק הזדמנויות לחוקרים נוספים שאפילו אינם מכירים תאי iPS. מספר סוגים של מכונות תרבות אוטומטיות התפתחו, אך רובן עדיין גדולות, יקרות ויכולות לבצע משימות חלקיות בלבד.המבנה הפשוט יותר של כד העבודה הפחית את גודל ועלות הציוד. בנוסף, המשימות מתחזוקת התא ועד אינדוקציה של התמיינות יכולות להתבצע באופן אוטומטי, עם הכנה מוקדמת בלבד של חומרים, והגדרת משימות על תוכנה. חזרתיות מכונה מדויקת להפליא בהשוואה לחזרתיות אנושית.השימוש במכונות כאלה לא רק משפר את השימושיות החוזרת, אלא גם להפחית את העבודה האנושית. יתר על כן, אם הפרמטרים בכל פרוטוקול משותפים, חוקרים שאינם מכירים תאי iPS יוכלו להשיג תוצאות דומות לחוקרים מנוסים, מה שיאפשר להם להיכנס בקלות למחקר באמצעות תאי iPS. אנו בוחנים את האפשרות לשלב מערכת שיפוט תמונות מבוססת בינה מלאכותית כדי להפוך את בחירת לוח הזמנים הבא של העבודה, תאריך קביעת ותוכן העבודה לאוטומטיים מלמידת תוצאות הניסוי.כמו כן, אנו צופים כי מתן אפשרות לחוקרים להתאים את פרוטוקולי העבודה שלהם להעדפותיהם, ולשתף אותם באופן מקוון, לא רק ישפר את יכולת השחזור בקרב החוקרים בעולם, אלא גם יעודד שיתוף פעולה מחקרי גלובלי.

an-automated-culture-system-for-maintaining-differentiating-human

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

An Automated Culture System for Maintaining and Differentiating Human-Induced Pluripotent Stem Cells

Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) with infinite self-proliferating ability have been expected to have applications in numerous fields, including the elucidation of rare disease pathologies, the development of new medicines, and regenerative medicine aiming to restore damaged organs. Despite this, the social implementation of hiPSCs is still limited. This is partly because of the difficulty of reproducing differentiation in culture, even with advanced knowledge and sophisticated technical skills, due to the high sensitivity of iPSCs to minute environmental changes. The application of an automated culture system can solve this issue. Experiments with high reproducibility independent of a researcher's skill can be expected according to a shared procedure across various institutes. Although several automated culture systems that can maintain iPSC cultures and induce differentiation have been developed previously, these systems are heavy, large, and costly because they make use of humanized, multi-articulated robotic arms. To improve on the above issues, we developed a new system using a simple x-y-z axis slide rail system, allowing it to be more compact, lighter, and cheaper. Furthermore, the user can easily modify parameters in the new system to develop new handling tasks. Once a task is established, all the user needs to do is prepare the iPSC, supply the reagents and consumables needed for the desired task in advance, select the task number, and specify the time. We confirmed that the system could maintain iPSCs in an undifferentiated state through several passages without feeder cells and differentiate into various cell types, including cardiomyocytes, hepatocytes, neural progenitors, and keratinocytes. The system will enable highly reproducible experiments across institutions without the need for skilled researchers and will facilitate the social implementation of hiPSCs in a wider range of research fields by diminishing the obstacles for new entries.

Here, we present a protocol for an automated cell culture system. This automated culture system reduces labor and benefits the users, including researchers unfamiliar with handling induced pluripotent stem (iPS) cells, from the maintenance of iPS cells to differentiation into various types of cells.