Name: В центре внимания автора: Автоматизация культуры iPSC для повышения воспроизводимости
Uploaded: 2024-01-26T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Automating iPSC Culture for Enhanced Reproducibility at JoVE.com

Это исследование было поддержано грантом Центра содействия развитию нового бизнеса, Panasonic Production Engineering Co., Ltd., Осака, Япония.

Комитет по этике Медицинского университета Кансай одобрил создание и использование здоровых ИПСК добровольного происхождения под названием KMUR001 (одобрение No 2020197). Донор, который был открыто завербован, предоставил официальное информированное согласие и согласился с научным использо...

Индуцированная дифференцировка плюрипотентных стволовых клеток с использованием автоматизированной системы культивирования

<ol>
	<li>Okita, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+more+efficient+method+to+generate+integration-free+human+iPS+cells.">A more efficient method to generate integration-free human iPS cells.</a> Nature Methods. 8 (5), 409-412 (2011).</li><li>Tanaka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+pharmacologic+testing+using+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">In vitro pharmacologic testing using human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 385 (4), 497-502 (2009).</li><li>Egashira, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disease+characterization+using+LQTS-specific+induced+pluripotent+stem+cells.">Disease characterization using LQTS-specific induced pluripotent stem cells.</a> Cardiovascular Research. 95 (4), 419-429 (2012).</li><li>Sasamata, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+a+robust+platform+for+induced+pluripotent+stem+cell+research+using+Maholo+LabDroid.">Establishment of a robust platform for induced pluripotent stem cell research using Maholo LabDroid.</a> SLAS technology. 26 (5), 441-453 (2021).</li><li>Tristan, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robotic+high-throughput+biomanufacturing+and+functional+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells.">Robotic high-throughput biomanufacturing and functional differentiation of human pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Reports. 16 (12), 3076-3092 (2021).</li><li>Konagaya, S., Ando, T., Yamauchi, T., Suemori, H., Iwata, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+maintenance+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+by+automated+cell+culture+system.">Long-term maintenance of human induced pluripotent stem cells by automated cell culture system.</a> Scientific Reports. 5, 16647 (2015).</li><li>McClymont, D. W., Freemont, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=With+all+due+respect+to+Maholo,+lab+automation+isn't+anthropomorphic.">With all due respect to Maholo, lab automation isn't anthropomorphic.</a> Nature Biotechnology. 35 (4), 312-314 (2017).</li><li>Gonzalez, F., Zalewski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Teaching+joint-level+robot+programming+with+a+new+robotics+software+tool.">Teaching joint-level robot programming with a new robotics software tool.</a> Robotics. 6 (4), 41 (2017).</li><li>Bando, K., Yamashita, H., Tsumori, M., Minoura, H., Okumura, K., Hattori, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compact+automated+culture+system+for+human+induced+pluripotent+stem+cell+maintenance+and+differentiation.">Compact automated culture system for human induced pluripotent stem cell maintenance and differentiation.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 10, 1074990 (2022).</li><li>Tohyama, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamine+oxidation+is+indispensable+for+survival+of+human+pluripotent+stem+cells.">Glutamine oxidation is indispensable for survival of human pluripotent stem cells.</a> Cell Metabolism. 23 (4), 663-674 (2016).</li><li>Yamashita, H., Fukuda, K., Hattori, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatocyte-like+cells+derived+from+human+pluripotent+stem+cells+can+be+enriched+by+a+combination+of+mitochondrial+content+and+activated+leukocyte+cell+adhesion+molecule.">Hepatocyte-like cells derived from human pluripotent stem cells can be enriched by a combination of mitochondrial content and activated leukocyte cell adhesion molecule.</a> JMA journal. 2 (2), 174-183 (2019).</li><li>Shimojo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid,+efficient+and+simple+motor+neuron+differentiation+from+human+pluripotent+stem+cells.">Rapid, efficient and simple motor neuron differentiation from human pluripotent stem cells.</a> Molecular Brain. 8 (1), 79 (2015).</li><li>Nishimoto, R., Kodama, C., Yamashita, H., Hattori, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+keratinocyte-like+cells+for+research+on+Protease-Activated+Receptor+2+in+nonhistaminergic+cascades+of+atopic+dermatitis.">Human induced pluripotent stem cell-derived keratinocyte-like cells for research on Protease-Activated Receptor 2 in nonhistaminergic cascades of atopic dermatitis.</a> The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 384 (2), 248-253 (2023).</li><li>International Stem Cell Initiative. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+ethnically+diverse+human+embryonic+stem+cells+identifies+a+chromosome+20+minimal+amplicon+conferring+growth+advantage.">Screening ethnically diverse human embryonic stem cells identifies a chromosome 20 minimal amplicon conferring growth advantage.</a> Nature Biotechnology. 29 (12), 1132-1144 (2011).</li><li>Keller, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+and+epigenetic+factors+which+modulate+differentiation+propensity+in+human+pluripotent+stem+cells.">Genetic and epigenetic factors which modulate differentiation propensity in human pluripotent stem cells.</a> Human Reproduction Update. 24 (2), 162-175 (2018).</li></ol>

Критически важным шагом в протоколе является то, что если пользователь обнаружит какие-либо неисправности, нажмите кнопку отмены, остановки или сброса в любое время и начните с первого шага. Программное обеспечение позволяет избежать человеческих ошибок, в том числе двойного брониров?...

Цель данной статьи – представить реальные и подробные процедуры работы с автоматизированной системой культивирования индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека (ИПСК), которую мы создали в сотрудничестве с компанией, и показать репрезентативные результаты.
С момента публикации статьи в 2007 году ИПСК привлекает внимание во всем мире1. Из-за его величайшей особенности дифференцироваться в любой тип соматических клеток, ожидается, что он будет применяться в различных областях, таких как регенеративная медицина, выяснение причин трудноизлечимых заболеваний и разработка новых терапевтическихпрепаратов. Кроме того, использование соматических клеток, полученных из ИПСК человека, может сократить количество экспериментов на животных, которые подвергаются значительным этическим ограничениям. Несмотря на то, что для исследования новых методов с помощью ИПСК постоянно требуется большое количество однородных ИПСК, управление ими слишком трудоемко. Кроме того, обращение с ИПСК затруднено из-за его высокой чувствительности, даже к незначительным культурным и экологическим изменениям.
Чтобы решить эту проблему, предполагается, что автоматизированные системы культуры будут выполнять задачи вместо людей. Некоторые группы разработали несколько автоматизированных систем культивирования плюрипотентных стволовых клеток человека для поддержания и дифференцировки клеток и опубликовали свои достижения 4,5,6. Эти системы оснащены многошарнирными роботизированными манипуляторами. Достоинства роботизированных манипуляторов заключаются не только в том, что они в высокой степени имитируют движения человеческой руки, но и в том, что они требуют более высокой стоимости манипулятора (рук), более крупной и тяжелой системы и трудоемких усилий инженеров по обучению для получения целенаправленных движений 7,8. Для того, чтобы облегчить внедрение аппарата в большее количество исследовательских учреждений в точках экономического, космического и человеческого потребления, мы разработали новую автоматизированную систему культивирования для поддержания и дифференцировки ИПСК в различные типы клеток9.
Наше обоснование для новой системы заключалось в том, чтобы использовать рельсовую систему осей X-Y-Z вместо многошарнирных роботизированных манипуляторов9. Чтобы заменить сложные функции роботизированных манипуляторов, мы применили новую идею к этой системе, которая может автоматически изменять три типа конкретных функциональных наконечников манипуляторов. Здесь мы также покажем, как пользователи могут легко составлять графики задач с помощью простых заказов на программное обеспечение из-за отсутствия требований к вкладу инженеров на протяжении всего процесса.
Одна из роботизированных культуральных систем продемонстрировала создание эмбриоидных тел с использованием 96-луночных планшетов в качестве 3D-клеточных агрегатов для дифференцировки4. Система, описанная здесь, не может работать с 96-луночными планшетами. Один из них достиг текущего уровня надлежащей производственной практики (cGMP) с использованием клеточной линии, хотя это не была плюрипотентная стволоваяклетка человека. Автоматизированная система культивирования, описанная здесь, была разработана специально для помощи в лабораторных экспериментах (рис. 1). Тем не менее, он имеет достаточное количество систем для поддержания уровня чистоты, эквивалентного шкафу безопасности уровня IV.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.15% bovine serum albumin fraction V</td>
			<td>Fuji Film Wako Chemical Inc., Miyazaki, Japan</td>
			<td>9048-46-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1% GlutaMAX</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm plastic plates&#160;</td>
			<td>Corning Inc., NY, United States</td>
			<td>430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>253G1</td>
			<td>RKEN Bioresource Research Center</td>
			<td>HPS0002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21985023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Actinin&#160; mouse</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab9465</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Activin A&#160;</td>
			<td>Nacali Tesque</td>
			<td>18585-81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenine</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A14906.30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin&#160; rabbit</td>
			<td>Dako</td>
			<td>A0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>All-trans retinoic acid</td>
			<td>Fuji Film Wako Chemical Inc.&#160;</td>
			<td>186-01114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated culture system</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 supplement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bFGF</td>
			<td>Fuji Film Wako Chemical Inc.&#160;</td>
			<td>062-06661</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BMP4&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>PHC9531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Merck</td>
			<td>810037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR-99021&#160;</td>
			<td>MCE, NJ, United States #HY-10182</td>
			<td>252917-06-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Defined Keratinocyte-SFM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10744019</td>
			<td>Human keratinocyte medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Merck</td>
			<td>266785</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dihexa&#160;</td>
			<td>TRC, Ontario, Canada</td>
			<td>13071-60-8</td>
			<td>rac-1,2-Dihexadecylglycerol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable hemocytometer</td>
			<td>CountessTM Cell Counting Chamber Slides, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C10228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dorsomorphin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1219168-18-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s modified Eagle medium/F12&#160;</td>
			<td>Fuji Film Wako Chemical Inc.</td>
			<td>12634010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF</td>
			<td>Fuji Film Wako Chemical Inc.&#160;</td>
			<td>053-07751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Essential 8&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1517001</td>
			<td>Human pluripotent stem cell medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum&#160;</td>
			<td>Biowest, FL, United States</td>
			<td>S140T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF-basic&#160;</td>
			<td>Nacalai Tesque Inc.</td>
			<td>19155-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forskolin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>J63292.MF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamine</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25030081</td>
			<td>Glutamine supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat IgG(H+L) AlexaFluo546</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A11056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HNF-4A&#160; goat</td>
			<td>Santacruz</td>
			<td>6556</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A16292.06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone 21-hemisuccinate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>H2882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iMatrix511 Silk&#160;</td>
			<td>Nippi Inc., Tokyo, Japan</td>
			<td>892 021</td>
			<td>Cell culture matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin-transferrin-selenium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>41400045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Keratin 1&#160; mouse</td>
			<td>Santacruz</td>
			<td>376224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Keratin 10&#160; rabbit</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>19054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KMUR001</td>
			<td>Kansai Medical University&#160;</td>
			<td></td>
			<td>Patient-derived iPSCs&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knockout serum replacement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10828010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-ascorbic acid 2-phosphate&#160;</td>
			<td>A8960, Merck</td>
			<td>A8960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz&#8217;s L-15 medium&#160;</td>
			<td>Fuji Film Wako Chemical Inc.</td>
			<td>128-06075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning Inc.</td>
			<td>354277</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG(H+L) AlexaFluo488</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A21202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 supplement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17502048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nestin mouse</td>
			<td>Santacruz</td>
			<td>23927</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21103049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurofilament&#160; rabbit</td>
			<td>Chemicon</td>
			<td>AB1987</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutristem</td>
			<td>Sartrius AG, G&#246;ttingen, Germany</td>
			<td>05-100-1A</td>
			<td>cell culture medium&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oct 3/4&#160; mouse</td>
			<td>BD</td>
			<td>611202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS(-)</td>
			<td>Nacalai Tesque Inc., Kyoto, Japan</td>
			<td>14249-24</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit IgG(H+L) AlexaFluo488</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A21206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit IgG(H+L) AlexaFluo546</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A10040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human albumin&#160;</td>
			<td>A0237, Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>A9731</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rho kinase inhibitor, Y-27632&#160;</td>
			<td>Sellec Inc., Tokyo, Japan</td>
			<td>129830-38-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RIKEN 2F</td>
			<td>RKEN Bioresource Research Center</td>
			<td>HPS0014</td>
			<td>undifferentiated hiPSCs&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific #11875</td>
			<td>12633020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB431542</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>301836-41-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium L-ascorbate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>A4034-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SSEA-4&#160; mouse</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB4304</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemFit AK02N&#160;</td>
			<td>Ajinomoto, Tokyo, Japan</td>
			<td>AK02</td>
			<td>cell culture medium&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TnT rabbit</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab92546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRA 1-81 mouse</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB4381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triiodothyronine</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>H34068.06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TripLETM express enzyme&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, United States</td>
			<td>12604013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue solution&#160;</td>
			<td>Nacalai Tesque, Kyoto, Japan</td>
			<td>20577-34</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptose phosphate broth</td>
			<td>Merck</td>
			<td>T8782-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wnt-C59&#160;</td>
			<td>Bio-techne, NB, United Kingdom</td>
			<td>5148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;&#160;<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/65672/65672eq01v2.jpg" style="margin: auto;" /> Tublin&#160; mouse</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G712A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an automated culture system for maintaining and differentiating human-induced pluripotent stem cells

Ожидается, что индуцированные плюрипотентные стволовые клетки человека (ИПСК) с бесконечной способностью к самораспространению найдут применение во многих областях, включая выяснение патологий редких заболеваний, разработку новых лекарств и регенеративную медицину, направленную на восстановление поврежденных органов. Несмотря на это, социальное применение ИПСК по-прежнему ограничено. Отчасти это связано с трудностью воспроизведения дифференциации в культуре, даже при наличии продвинутых знаний и сложных технических навыков, из-за высокой чувствительности ИПСК к мельчайшим изменениям окружающей среды. Решить эту проблему может применение автоматизированной системы культуры. Эксперименты с высокой воспроизводимостью, не зависящие от квалификации исследователя, можно ожидать в соответствии с общей процедурой для различных институтов. Несмотря на то, что ранее было разработано несколько автоматизированных систем культивирования, которые могут поддерживать культуры ИПСК и индуцировать дифференциацию, эти системы являются тяжелыми, большими и дорогостоящими, поскольку в них используются гуманизированные, многошарнирные роботизированные руки. Чтобы решить вышеуказанные проблемы, мы разработали новую систему, использующую простую систему направляющих по осям x-y-z, что позволило сделать ее более компактной, легкой и дешевой. Кроме того, пользователь может легко изменять параметры в новой системе для разработки новых задач по обработке. После того, как задача поставлена, все, что нужно сделать пользователю, это подготовить iPSC, заранее поставить реагенты и расходные материалы, необходимые для выполнения нужной задачи, выбрать номер задачи и указать время. Мы подтвердили, что система может поддерживать ИПСК в недифференцированном состоянии через несколько пассажей без фидерных клеток и дифференцироваться в различные типы клеток, включая кардиомиоциты, гепатоциты, нейральные предшественники и кератиноциты. Система позволит проводить высоковоспроизводимые эксперименты в разных учреждениях без необходимости в квалифицированных исследователях и будет способствовать социальному внедрению ИПСК в более широкий спектр областей исследований, уменьшая препятствия для новых заявок.

This article aims to provide actual and detailed handling procedures for an automated culture system for human induced pluripotent stem cells (iPSC), which we produced by collaborating with a company, and to show representative results.
Since the publication of the article in 2007, iPSC has been attracting attention all over the world1. Due to its greatest feature of being able to differentiate into any type of somatic cell, it is expected to be applied in various fields such as regenerative medicine, elucidating the causes of intractable diseases, and developing new therapeutic drugs2,3. In addition, using human iPSC-derived somatic cells could reduce animal experiments, which are subject to significant ethical restrictions. Although numerous homogeneous iPSCs are constantly required to research new methods with iPSCs, it is too laborious to manage them. Moreover, handling iPSC is difficult because of its high sensitivity, even to subtle cultural and environmental changes.
To solve this problem, automated culture systems are expected to perform tasks instead of humans. Some groups have developed a few automated human pluripotent stem cell culture systems for cell maintenance and differentiation and published their achievements4,5,6. These systems equip multiarticulated robotic arm(s). Robotic arms have not only merit in that they highly mimic human arm movements but also demerit in that they require higher cost(s) for the arm(s), larger and heavier system packaging, and time-consuming education efforts by the engineers to obtain the aimed movements7,8. In order to make it easier to introduce the apparatus to more research facilities at the points of economic, space, and human resource consumption, we have developed a novel automated culture system for the maintenance and differentiation of iPSC into various cell types9.
Our rationale for the new system was to adopt an X-Y-Z axis rail system instead of multiarticulated robotic arms9. To replace the complex hand-like functions of robotic arms, we applied a new idea to this system, which can automatically change three types of specific functional arm tips. Here, we also indicate how users can easily make task schedules with simple orders on software because of the lack of requirements for engineers&#39; contributions throughout the process.
One of the robotic culture systems has demonstrated the making of embryoid bodies using 96-well plates as 3D cell aggregates for differentiation4. The system reported here cannot handle 96-well plates. One achieved the current good manufacturing practice (cGMP) grade using a cell line, although it was not a human pluripotent stem cell5. The automated culture system detailed here has now been developed with the specific aim of helping laboratory experiments (Figure 1). However, it has enough systems to keep clean levels equivalent to a level IV safety cabinet.

В центре внимания автора: Автоматизация культуры iPSC для повышения воспроизводимости 

Автоматизированная система культивирования для поддержания и дифференцировки индуцированных человеком плюрипотентных стволовых клеток

This study focuses on automating the culture of iPS cells. Our goal is to reduce the variability due to manual experimentations and human labor, by utilizing smaller and more affordable equipment, which leads to enhance the reproducibility, and provide opportunities for more researchers who are even unfamiliar with iPS cells. Several types of automated culture machines have emerged, but most of them are still large, costly, and can only perform partial tasks.The simpler structure of the working urn has reduced the size and cost of the equipment. In addition, the tasks from cell maintenance to differentiation induction can be performed automatically, with only prior material preparation, and task setting on software. Machine repetition is remarkably accurate compared to human repetition.The use of such machines not only improves repeat usability, but also reduce human labor. Furthermore, if the parameters in each protocol are shared, researchers unfamiliar with iPS cells will be able to achieve similar results as well-experienced researchers, making it possible for them to easily enter into research using iPS cells. We are exploring the possibility of incorporating an AI-based image judgment system to automate the selection of the next work schedule, setting date, and work content from the learning of the experiment results.We also anticipate that allowing researchers to tailor their working protocols to their preferences, and share them online, will not only enhance reproducibility among the world researchers, but also encourage global research collaboration.

Поддержание индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека Мы использовали три линии hPSC (RIKEN-2F, 253G1 и KMUR001). Мы оптимизировали протокол технического обслуживания с помощью ежедневных экспериментов, выполняемых вручную, и дополнительно оптимизировали подробные прог...

Watch this Scientific Journal Video about Automating iPSC Culture for Enhanced Reproducibility at JoVE.com

Здесь мы представляем протокол для автоматизированной системы культивирования клеток. Эта автоматизированная система культивирования сокращает трудозатраты и приносит пользу пользователям, в том числе исследователям, незнакомым с обращением с индуцированными плюрипотентными стволовыми клетками (iPS), от поддержания iPS-клеток до дифференцировки в различные типы клеток.

Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) with infinite self-proliferating ability have been expected to have applications in numerous fields, ...

Это исследование посвящено автоматизации культивирования iPS-клеток. Наша цель состоит в том, чтобы уменьшить вариабельность из-за ручных экспериментов и человеческого труда, используя меньшее и более доступное оборудование, что приводит к повышению воспроизводимости и предоставляет возможности большему количеству исследователей, которые даже не знакомы с iPS-клетками. Появилось несколько типов автоматизированных машин для культивирования, но большинство из них по-прежнему большие, дорогостоящие и могут выполнять только частичные задачи.Более простая конструкция рабочей урны позволила уменьшить размеры и стоимость оборудования. Кроме того, задачи от обслуживания клетки до индукции дифференцировки могут выполняться автоматически, с предварительной подготовкой материала и постановкой задач в программном обеспечении. Машинное повторение удивительно точно по сравнению с человеческим.Использование таких машин не только повышает удобство повторного использования, но и сокращает человеческий труд. Кроме того, если параметры в каждом протоколе будут общими, исследователи, незнакомые с iPS-клетками, смогут достичь тех же результатов, что и опытные исследователи, что позволит им легко участвовать в исследованиях с использованием iPS-клеток. Мы изучаем возможность внедрения системы оценки изображений на основе искусственного интеллекта для автоматизации выбора следующего рабочего графика, установления даты и содержания работы на основе изучения результатов эксперимента.Мы также ожидаем, что предоставление исследователям возможности адаптировать свои рабочие протоколы к своим предпочтениям и делиться ими в Интернете не только повысит воспроизводимость среди исследователей со всего мира, но и будет способствовать глобальному сотрудничеству в области исследований.

an-automated-culture-system-for-maintaining-differentiating-human

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

An Automated Culture System for Maintaining and Differentiating Human-Induced Pluripotent Stem Cells

Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) with infinite self-proliferating ability have been expected to have applications in numerous fields, including the elucidation of rare disease pathologies, the development of new medicines, and regenerative medicine aiming to restore damaged organs. Despite this, the social implementation of hiPSCs is still limited. This is partly because of the difficulty of reproducing differentiation in culture, even with advanced knowledge and sophisticated technical skills, due to the high sensitivity of iPSCs to minute environmental changes. The application of an automated culture system can solve this issue. Experiments with high reproducibility independent of a researcher's skill can be expected according to a shared procedure across various institutes. Although several automated culture systems that can maintain iPSC cultures and induce differentiation have been developed previously, these systems are heavy, large, and costly because they make use of humanized, multi-articulated robotic arms. To improve on the above issues, we developed a new system using a simple x-y-z axis slide rail system, allowing it to be more compact, lighter, and cheaper. Furthermore, the user can easily modify parameters in the new system to develop new handling tasks. Once a task is established, all the user needs to do is prepare the iPSC, supply the reagents and consumables needed for the desired task in advance, select the task number, and specify the time. We confirmed that the system could maintain iPSCs in an undifferentiated state through several passages without feeder cells and differentiate into various cell types, including cardiomyocytes, hepatocytes, neural progenitors, and keratinocytes. The system will enable highly reproducible experiments across institutions without the need for skilled researchers and will facilitate the social implementation of hiPSCs in a wider range of research fields by diminishing the obstacles for new entries.

Here, we present a protocol for an automated cell culture system. This automated culture system reduces labor and benefits the users, including researchers unfamiliar with handling induced pluripotent stem (iPS) cells, from the maintenance of iPS cells to differentiation into various types of cells.