Name: Yazar Spotlight: Gelişmiş Tekrarlanabilirlik için iPSC Kültürünü Otomatikleştirme
Uploaded: 2024-01-26T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Automating iPSC Culture for Enhanced Reproducibility at JoVE.com

Bu çalışma, Panasonic Production Engineering Co., Ltd., Osaka, Japonya'daki Yeni İş Geliştirme Merkezi'nden alınan bir hibe ile desteklenmiştir.

Kansai Tıp Üniversitesi Etik Komitesi, KMUR001 adlı sağlıklı gönüllü kaynaklı iPSC'lerin üretilmesini ve kullanılmasını onayladı (onay No. 2020197). Açıkça işe alınan donör, resmi bilgilendirilmiş onam verdi ve hücrelerin bilimsel kullanımını kabul etti.
NOT: Mevcut arayüz (Windows XP işletim sistemi altında çalışan "ccssHMI" adlı özel yazılım) temel işlem ekranıdır. Yukarıda belirtilen arayüz altında, kullanıcıların çeşitli işlemleri başlatmas?...

Otomatik Kültür Sistemi Kullanılarak İndüklenmiş Pluripotent Kök Hücre Farklılaşması

<ol>
	<li>Okita, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+more+efficient+method+to+generate+integration-free+human+iPS+cells.">A more efficient method to generate integration-free human iPS cells.</a> Nature Methods. 8 (5), 409-412 (2011).</li><li>Tanaka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+pharmacologic+testing+using+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">In vitro pharmacologic testing using human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 385 (4), 497-502 (2009).</li><li>Egashira, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disease+characterization+using+LQTS-specific+induced+pluripotent+stem+cells.">Disease characterization using LQTS-specific induced pluripotent stem cells.</a> Cardiovascular Research. 95 (4), 419-429 (2012).</li><li>Sasamata, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+a+robust+platform+for+induced+pluripotent+stem+cell+research+using+Maholo+LabDroid.">Establishment of a robust platform for induced pluripotent stem cell research using Maholo LabDroid.</a> SLAS technology. 26 (5), 441-453 (2021).</li><li>Tristan, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robotic+high-throughput+biomanufacturing+and+functional+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells.">Robotic high-throughput biomanufacturing and functional differentiation of human pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Reports. 16 (12), 3076-3092 (2021).</li><li>Konagaya, S., Ando, T., Yamauchi, T., Suemori, H., Iwata, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+maintenance+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+by+automated+cell+culture+system.">Long-term maintenance of human induced pluripotent stem cells by automated cell culture system.</a> Scientific Reports. 5, 16647 (2015).</li><li>McClymont, D. W., Freemont, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=With+all+due+respect+to+Maholo,+lab+automation+isn't+anthropomorphic.">With all due respect to Maholo, lab automation isn't anthropomorphic.</a> Nature Biotechnology. 35 (4), 312-314 (2017).</li><li>Gonzalez, F., Zalewski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Teaching+joint-level+robot+programming+with+a+new+robotics+software+tool.">Teaching joint-level robot programming with a new robotics software tool.</a> Robotics. 6 (4), 41 (2017).</li><li>Bando, K., Yamashita, H., Tsumori, M., Minoura, H., Okumura, K., Hattori, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compact+automated+culture+system+for+human+induced+pluripotent+stem+cell+maintenance+and+differentiation.">Compact automated culture system for human induced pluripotent stem cell maintenance and differentiation.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 10, 1074990 (2022).</li><li>Tohyama, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamine+oxidation+is+indispensable+for+survival+of+human+pluripotent+stem+cells.">Glutamine oxidation is indispensable for survival of human pluripotent stem cells.</a> Cell Metabolism. 23 (4), 663-674 (2016).</li><li>Yamashita, H., Fukuda, K., Hattori, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatocyte-like+cells+derived+from+human+pluripotent+stem+cells+can+be+enriched+by+a+combination+of+mitochondrial+content+and+activated+leukocyte+cell+adhesion+molecule.">Hepatocyte-like cells derived from human pluripotent stem cells can be enriched by a combination of mitochondrial content and activated leukocyte cell adhesion molecule.</a> JMA journal. 2 (2), 174-183 (2019).</li><li>Shimojo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid,+efficient+and+simple+motor+neuron+differentiation+from+human+pluripotent+stem+cells.">Rapid, efficient and simple motor neuron differentiation from human pluripotent stem cells.</a> Molecular Brain. 8 (1), 79 (2015).</li><li>Nishimoto, R., Kodama, C., Yamashita, H., Hattori, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+keratinocyte-like+cells+for+research+on+Protease-Activated+Receptor+2+in+nonhistaminergic+cascades+of+atopic+dermatitis.">Human induced pluripotent stem cell-derived keratinocyte-like cells for research on Protease-Activated Receptor 2 in nonhistaminergic cascades of atopic dermatitis.</a> The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 384 (2), 248-253 (2023).</li><li>International Stem Cell Initiative. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+ethnically+diverse+human+embryonic+stem+cells+identifies+a+chromosome+20+minimal+amplicon+conferring+growth+advantage.">Screening ethnically diverse human embryonic stem cells identifies a chromosome 20 minimal amplicon conferring growth advantage.</a> Nature Biotechnology. 29 (12), 1132-1144 (2011).</li><li>Keller, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+and+epigenetic+factors+which+modulate+differentiation+propensity+in+human+pluripotent+stem+cells.">Genetic and epigenetic factors which modulate differentiation propensity in human pluripotent stem cells.</a> Human Reproduction Update. 24 (2), 162-175 (2018).</li></ol>

Protokoldeki kritik bir adım, bir kullanıcı herhangi bir hata bulursa, herhangi bir zamanda iptal, durdur veya sıfırla düğmesine tıklaması ve ilk adımdan baştan başlamasıdır. Yazılım, çifte rezervasyon, sistem görevleri etkinken kapıların açılması ve ikmal eksikliği dahil olmak üzere insan hatalarından kaçınabilir. İstenilen somatik hücreye başarılı ve verimli bir şekilde farklılaşmak için bir diğer kritik nokta, pluripotent kök hücre hatlarının uygun seçimidir, çünkü her plu...

Bu makale, bir firma ile işbirliği yaparak ürettiğimiz insan kaynaklı pluripotent kök hücreler (iPSC) için otomatik bir kültür sistemi için gerçek ve ayrıntılı kullanım prosedürleri sağlamayı ve temsili sonuçları göstermeyi amaçlamaktadır.
Makalenin 2007 yılında yayınlanmasından bu yana, iPSC tüm dünyada dikkat çekmektedir1. En büyük özelliği herhangi bir somatik hücreye farklılaşabilmesi nedeniyle, rejeneratif tıp, inatçı hastalıkların nedenlerinin aydınlatılması ve yeni terapötik ilaçların geliştirilmesi gibi çeşitli alanlarda uygulanması beklenmektedir 2,3. Ek olarak, insan iPSC'den türetilen somatik hücrelerin kullanılması, önemli etik kısıtlamalara tabi olan hayvan deneylerini azaltabilir. iPSC'lerle yeni yöntemler araştırmak için sürekli olarak çok sayıda homojen iPSC'ye ihtiyaç duyulsa da, bunları yönetmek çok zahmetlidir. Ayrıca, iPSC'yi ele almak, ince kültürel ve çevresel değişikliklere karşı bile yüksek hassasiyeti nedeniyle zordur.
Bu sorunu çözmek için, insanlar yerine otomatik kültür sistemlerinin görevleri yerine getirmesi beklenir. Bazı gruplar, hücre bakımı ve farklılaşması için birkaç otomatik insan pluripotent kök hücre kültürü sistemi geliştirmiş ve başarılarını yayınlamıştır 4,5,6. Bu sistemler, çok eklemli robotik kol(lar)ı donatır. Robotik kollar, sadece insan kol hareketlerini yüksek oranda taklit etmeleri bakımından değil, aynı zamanda kol(lar) için daha yüksek maliyet(ler), daha büyük ve daha ağır sistem paketlemeleri ve hedeflenen hareketleri elde etmek için mühendisler tarafından zaman alıcı eğitim çabaları gerektirmeleri bakımından da kusurludur 7,8. Cihazın ekonomik, alan ve insan kaynakları tüketimi noktalarında daha fazla araştırma tesisine tanıtılmasını kolaylaştırmak için, iPSC'nin bakımı ve çeşitli hücre tiplerinefarklılaşması için yeni bir otomatik kültür sistemi geliştirdik 9.
Yeni sistem için gerekçemiz, çok eklemli robotik kollar yerine X-Y-Z eksenli bir ray sistemini benimsemekti9. Robotik kolların karmaşık el benzeri işlevlerini değiştirmek için, bu sisteme üç tür özel işlevsel kol ucunu otomatik olarak değiştirebilen yeni bir fikir uyguladık. Burada, süreç boyunca mühendislerin katkılarına ihtiyaç duyulmaması nedeniyle, kullanıcıların yazılım üzerinde basit siparişlerle nasıl kolayca görev programları yapabileceklerini de gösteriyoruz.
Robotik kültür sistemlerinden biri, farklılaşma için 3D hücre agregaları olarak 96 oyuklu plakalar kullanılarak embriyoid cisimlerin yapımını göstermiştir4. Burada bildirilen sistem 96 oyuklu plakaları işleyemez. Bunlardan biri, bir insan pluripotent kök hücresi olmamasına rağmen, bir hücre hattı kullanarak mevcut iyi üretim uygulaması (cGMP) derecesine ulaştı5. Burada ayrıntıları verilen otomatik kültür sistemi, laboratuvar deneylerine yardımcı olmak amacıyla geliştirilmiştir (Şekil 1). Bununla birlikte, seviye IV güvenlik kabinine eşdeğer temiz seviyeleri tutmak için yeterli sisteme sahiptir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.15% bovine serum albumin fraction V</td>
			<td>Fuji Film Wako Chemical Inc., Miyazaki, Japan</td>
			<td>9048-46-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1% GlutaMAX</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm plastic plates&#160;</td>
			<td>Corning Inc., NY, United States</td>
			<td>430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>253G1</td>
			<td>RKEN Bioresource Research Center</td>
			<td>HPS0002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21985023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Actinin&#160; mouse</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab9465</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Activin A&#160;</td>
			<td>Nacali Tesque</td>
			<td>18585-81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenine</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A14906.30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin&#160; rabbit</td>
			<td>Dako</td>
			<td>A0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>All-trans retinoic acid</td>
			<td>Fuji Film Wako Chemical Inc.&#160;</td>
			<td>186-01114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated culture system</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 supplement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bFGF</td>
			<td>Fuji Film Wako Chemical Inc.&#160;</td>
			<td>062-06661</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BMP4&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>PHC9531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Merck</td>
			<td>810037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR-99021&#160;</td>
			<td>MCE, NJ, United States #HY-10182</td>
			<td>252917-06-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Defined Keratinocyte-SFM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10744019</td>
			<td>Human keratinocyte medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Merck</td>
			<td>266785</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dihexa&#160;</td>
			<td>TRC, Ontario, Canada</td>
			<td>13071-60-8</td>
			<td>rac-1,2-Dihexadecylglycerol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable hemocytometer</td>
			<td>CountessTM Cell Counting Chamber Slides, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C10228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dorsomorphin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1219168-18-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s modified Eagle medium/F12&#160;</td>
			<td>Fuji Film Wako Chemical Inc.</td>
			<td>12634010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF</td>
			<td>Fuji Film Wako Chemical Inc.&#160;</td>
			<td>053-07751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Essential 8&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1517001</td>
			<td>Human pluripotent stem cell medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum&#160;</td>
			<td>Biowest, FL, United States</td>
			<td>S140T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF-basic&#160;</td>
			<td>Nacalai Tesque Inc.</td>
			<td>19155-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forskolin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>J63292.MF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamine</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25030081</td>
			<td>Glutamine supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat IgG(H+L) AlexaFluo546</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A11056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HNF-4A&#160; goat</td>
			<td>Santacruz</td>
			<td>6556</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A16292.06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone 21-hemisuccinate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>H2882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iMatrix511 Silk&#160;</td>
			<td>Nippi Inc., Tokyo, Japan</td>
			<td>892 021</td>
			<td>Cell culture matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin-transferrin-selenium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>41400045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Keratin 1&#160; mouse</td>
			<td>Santacruz</td>
			<td>376224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Keratin 10&#160; rabbit</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>19054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KMUR001</td>
			<td>Kansai Medical University&#160;</td>
			<td></td>
			<td>Patient-derived iPSCs&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knockout serum replacement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10828010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-ascorbic acid 2-phosphate&#160;</td>
			<td>A8960, Merck</td>
			<td>A8960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz&#8217;s L-15 medium&#160;</td>
			<td>Fuji Film Wako Chemical Inc.</td>
			<td>128-06075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning Inc.</td>
			<td>354277</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG(H+L) AlexaFluo488</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A21202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 supplement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17502048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nestin mouse</td>
			<td>Santacruz</td>
			<td>23927</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21103049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurofilament&#160; rabbit</td>
			<td>Chemicon</td>
			<td>AB1987</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutristem</td>
			<td>Sartrius AG, G&#246;ttingen, Germany</td>
			<td>05-100-1A</td>
			<td>cell culture medium&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oct 3/4&#160; mouse</td>
			<td>BD</td>
			<td>611202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS(-)</td>
			<td>Nacalai Tesque Inc., Kyoto, Japan</td>
			<td>14249-24</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit IgG(H+L) AlexaFluo488</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A21206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit IgG(H+L) AlexaFluo546</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A10040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human albumin&#160;</td>
			<td>A0237, Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>A9731</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rho kinase inhibitor, Y-27632&#160;</td>
			<td>Sellec Inc., Tokyo, Japan</td>
			<td>129830-38-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RIKEN 2F</td>
			<td>RKEN Bioresource Research Center</td>
			<td>HPS0014</td>
			<td>undifferentiated hiPSCs&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific #11875</td>
			<td>12633020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB431542</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>301836-41-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium L-ascorbate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>A4034-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SSEA-4&#160; mouse</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB4304</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemFit AK02N&#160;</td>
			<td>Ajinomoto, Tokyo, Japan</td>
			<td>AK02</td>
			<td>cell culture medium&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TnT rabbit</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab92546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRA 1-81 mouse</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB4381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triiodothyronine</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>H34068.06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TripLETM express enzyme&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, United States</td>
			<td>12604013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue solution&#160;</td>
			<td>Nacalai Tesque, Kyoto, Japan</td>
			<td>20577-34</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptose phosphate broth</td>
			<td>Merck</td>
			<td>T8782-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wnt-C59&#160;</td>
			<td>Bio-techne, NB, United Kingdom</td>
			<td>5148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;&#160;<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/65672/65672eq01v2.jpg" style="margin: auto;" /> Tublin&#160; mouse</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G712A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an automated culture system for maintaining and differentiating human-induced pluripotent stem cells

Sonsuz kendi kendine çoğalma yeteneğine sahip insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerin (hiPSC'ler), nadir hastalık patolojilerinin aydınlatılması, yeni ilaçların geliştirilmesi ve hasarlı organları restore etmeyi amaçlayan rejeneratif tıp dahil olmak üzere çok sayıda alanda uygulamaları olması beklenmektedir. Buna rağmen, hiPSC'lerin sosyal uygulaması hala sınırlıdır. Bu kısmen, iPSC'lerin küçük çevresel değişikliklere karşı yüksek duyarlılığı nedeniyle, ileri bilgi ve sofistike teknik becerilerle bile kültürdeki farklılaşmayı yeniden üretmenin zorluğundan kaynaklanmaktadır. Otomatik bir kültür sisteminin uygulanması bu sorunu çözebilir. Bir araştırmacının becerisinden bağımsız olarak yüksek tekrarlanabilirliğe sahip deneyler, çeşitli enstitüler arasında paylaşılan bir prosedüre göre beklenebilir. Daha önce iPSC kültürlerini koruyabilen ve farklılaşmayı indükleyebilen birkaç otomatik kültür sistemi geliştirilmiş olsa da, bu sistemler insanlaştırılmış, çok eklemli robotik kollardan yararlandıkları için ağır, büyük ve maliyetlidir. Yukarıdaki sorunları iyileştirmek için, daha kompakt, daha hafif ve daha ucuz olmasını sağlayan basit bir x-y-z ekseni kayar ray sistemi kullanarak yeni bir sistem geliştirdik. Ayrıca, kullanıcı yeni taşıma görevleri geliştirmek için yeni sistemdeki parametreleri kolayca değiştirebilir. Bir görev oluşturulduktan sonra, kullanıcının tek yapması gereken iPSC'yi hazırlamak, istenen görev için gereken reaktifleri ve sarf malzemelerini önceden sağlamak, görev numarasını seçmek ve zamanı belirtmektir. Sistemin, besleyici hücreler olmadan birkaç geçiş yoluyla iPSC'leri farklılaşmamış bir durumda tutabildiğini ve kardiyomiyositler, hepatositler, nöral progenitörler ve keratinositler dahil olmak üzere çeşitli hücre tiplerine farklılaşabildiğini doğruladık. Sistem, yetenekli araştırmacılara ihtiyaç duymadan kurumlar arasında yüksek oranda tekrarlanabilir deneylere olanak tanıyacak ve yeni girişlerin önündeki engelleri azaltarak hiPSC'lerin daha geniş bir araştırma alanı yelpazesinde sosyal olarak uygulanmasını kolaylaştıracaktır.

This article aims to provide actual and detailed handling procedures for an automated culture system for human induced pluripotent stem cells (iPSC), which we produced by collaborating with a company, and to show representative results.
Since the publication of the article in 2007, iPSC has been attracting attention all over the world1. Due to its greatest feature of being able to differentiate into any type of somatic cell, it is expected to be applied in various fields such as regenerative medicine, elucidating the causes of intractable diseases, and developing new therapeutic drugs2,3. In addition, using human iPSC-derived somatic cells could reduce animal experiments, which are subject to significant ethical restrictions. Although numerous homogeneous iPSCs are constantly required to research new methods with iPSCs, it is too laborious to manage them. Moreover, handling iPSC is difficult because of its high sensitivity, even to subtle cultural and environmental changes.
To solve this problem, automated culture systems are expected to perform tasks instead of humans. Some groups have developed a few automated human pluripotent stem cell culture systems for cell maintenance and differentiation and published their achievements4,5,6. These systems equip multiarticulated robotic arm(s). Robotic arms have not only merit in that they highly mimic human arm movements but also demerit in that they require higher cost(s) for the arm(s), larger and heavier system packaging, and time-consuming education efforts by the engineers to obtain the aimed movements7,8. In order to make it easier to introduce the apparatus to more research facilities at the points of economic, space, and human resource consumption, we have developed a novel automated culture system for the maintenance and differentiation of iPSC into various cell types9.
Our rationale for the new system was to adopt an X-Y-Z axis rail system instead of multiarticulated robotic arms9. To replace the complex hand-like functions of robotic arms, we applied a new idea to this system, which can automatically change three types of specific functional arm tips. Here, we also indicate how users can easily make task schedules with simple orders on software because of the lack of requirements for engineers&#39; contributions throughout the process.
One of the robotic culture systems has demonstrated the making of embryoid bodies using 96-well plates as 3D cell aggregates for differentiation4. The system reported here cannot handle 96-well plates. One achieved the current good manufacturing practice (cGMP) grade using a cell line, although it was not a human pluripotent stem cell5. The automated culture system detailed here has now been developed with the specific aim of helping laboratory experiments (Figure 1). However, it has enough systems to keep clean levels equivalent to a level IV safety cabinet.

Yazar Spotlight: Gelişmiş Tekrarlanabilirlik için iPSC Kültürünü Otomatikleştirme 

İnsan kaynaklı pluripotent kök hücrelerin korunması ve ayırt edilmesi için otomatik bir kültür sistemi

This study focuses on automating the culture of iPS cells. Our goal is to reduce the variability due to manual experimentations and human labor, by utilizing smaller and more affordable equipment, which leads to enhance the reproducibility, and provide opportunities for more researchers who are even unfamiliar with iPS cells. Several types of automated culture machines have emerged, but most of them are still large, costly, and can only perform partial tasks.The simpler structure of the working urn has reduced the size and cost of the equipment. In addition, the tasks from cell maintenance to differentiation induction can be performed automatically, with only prior material preparation, and task setting on software. Machine repetition is remarkably accurate compared to human repetition.The use of such machines not only improves repeat usability, but also reduce human labor. Furthermore, if the parameters in each protocol are shared, researchers unfamiliar with iPS cells will be able to achieve similar results as well-experienced researchers, making it possible for them to easily enter into research using iPS cells. We are exploring the possibility of incorporating an AI-based image judgment system to automate the selection of the next work schedule, setting date, and work content from the learning of the experiment results.We also anticipate that allowing researchers to tailor their working protocols to their preferences, and share them online, will not only enhance reproducibility among the world researchers, but also encourage global research collaboration.

İnsan kaynaklı pluripotent kök hücrelerin bakımı Üç hPSC hattı (RIKEN-2F, 253G1 ve KMUR001) kullandık. Günlük manuel olarak gerçekleştirilen deneylerle bakım protokolünü optimize ettik ve sistem tarafından gerçekleştirilen yedi ön deney aracılığıyla ayrıntılı programları daha da optimize ettik. Örneğin, insanlar tarafından kullanılan farklı pipetlerden ve sistemden çıkan tükürük akışının sıvı hızlarının neden olduğu kayma gerilmeleri oldukça farklıdı...

Watch this Scientific Journal Video about Automating iPSC Culture for Enhanced Reproducibility at JoVE.com

Burada, otomatik bir hücre kültürü sistemi için bir protokol sunuyoruz. Bu otomatik kültür sistemi, işçiliği azaltır ve indüklenmiş pluripotent kök (iPS) hücrelerin bakımından, çeşitli hücre tiplerine farklılaşmaya kadar, indüklenmiş pluripotent kök (iPS) hücrelerin işlenmesine aşina olmayan araştırmacılar da dahil olmak üzere kullanıcılara fayda sağlar.

Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) with infinite self-proliferating ability have been expected to have applications in numerous fields, ...

Bu çalışma, iPS hücrelerinin kültürünü otomatikleştirmeye odaklanmaktadır. Amacımız, daha küçük ve daha uygun fiyatlı ekipman kullanarak manuel deneyler ve insan emeğinden kaynaklanan değişkenliği azaltmaktır, bu da tekrarlanabilirliği arttırır ve iPS hücrelerine aşina olmayan daha fazla araştırmacı için fırsatlar sunar. Birkaç tür otomatik kültür makinesi ortaya çıkmıştır, ancak bunların çoğu hala büyüktür, maliyetlidir ve yalnızca kısmi görevleri yerine getirebilir.Çalışma vazosunun daha basit yapısı, ekipmanın boyutunu ve maliyetini azaltmıştır. Ek olarak, hücre bakımından farklılaşma indüksiyonuna kadar olan görevler, yalnızca önceden malzeme hazırlığı ve yazılım üzerinde görev ayarı ile otomatik olarak gerçekleştirilebilir. Makine tekrarı, insan tekrarına kıyasla oldukça doğrudur.Bu tür makinelerin kullanımı sadece tekrar kullanılabilirliği artırmakla kalmaz, aynı zamanda insan emeğini de azaltır. Ayrıca, her protokoldeki parametreler paylaşılırsa, iPS hücrelerine aşina olmayan araştırmacılar, deneyimli araştırmacılarla benzer sonuçlar elde edebilecek ve bu da iPS hücrelerini kullanarak kolayca araştırmaya girmelerini mümkün kılacaktır. Deney sonuçlarının öğrenilmesinden bir sonraki çalışma programının, ayar tarihinin ve çalışma içeriğinin seçimini otomatikleştirmek için yapay zeka tabanlı bir görüntü değerlendirme sistemi dahil etme olasılığını araştırıyoruz.Ayrıca, araştırmacıların çalışma protokollerini tercihlerine göre uyarlamalarına ve çevrimiçi olarak paylaşmalarına izin vermenin, yalnızca dünya araştırmacıları arasında tekrarlanabilirliği artırmakla kalmayacağını, aynı zamanda küresel araştırma işbirliğini de teşvik edeceğini tahmin ediyoruz.

an-automated-culture-system-for-maintaining-differentiating-human

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

An Automated Culture System for Maintaining and Differentiating Human-Induced Pluripotent Stem Cells

Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) with infinite self-proliferating ability have been expected to have applications in numerous fields, including the elucidation of rare disease pathologies, the development of new medicines, and regenerative medicine aiming to restore damaged organs. Despite this, the social implementation of hiPSCs is still limited. This is partly because of the difficulty of reproducing differentiation in culture, even with advanced knowledge and sophisticated technical skills, due to the high sensitivity of iPSCs to minute environmental changes. The application of an automated culture system can solve this issue. Experiments with high reproducibility independent of a researcher's skill can be expected according to a shared procedure across various institutes. Although several automated culture systems that can maintain iPSC cultures and induce differentiation have been developed previously, these systems are heavy, large, and costly because they make use of humanized, multi-articulated robotic arms. To improve on the above issues, we developed a new system using a simple x-y-z axis slide rail system, allowing it to be more compact, lighter, and cheaper. Furthermore, the user can easily modify parameters in the new system to develop new handling tasks. Once a task is established, all the user needs to do is prepare the iPSC, supply the reagents and consumables needed for the desired task in advance, select the task number, and specify the time. We confirmed that the system could maintain iPSCs in an undifferentiated state through several passages without feeder cells and differentiate into various cell types, including cardiomyocytes, hepatocytes, neural progenitors, and keratinocytes. The system will enable highly reproducible experiments across institutions without the need for skilled researchers and will facilitate the social implementation of hiPSCs in a wider range of research fields by diminishing the obstacles for new entries.

Here, we present a protocol for an automated cell culture system. This automated culture system reduces labor and benefits the users, including researchers unfamiliar with handling induced pluripotent stem (iPS) cells, from the maintenance of iPS cells to differentiation into various types of cells.