Name: Author Spotlight: Streamlining Composite Plant Production via Agrobacterium rhizogenes-Mediated Hairy Root Transformation
Uploaded: 2023-06-30T14:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Streamlining Composite Plant Production via Agrobacterium rhizogenes-Mediated Hairy Root Transformation at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av forskningsfondet ved Liaocheng University (318012028) og Natural Science Foundation of Shandong Province (ZR2020MC034).

1. Plantevekstforhold og A. rhizogenes kultur
<ol><li>Frø såing MERK: Wild soyabønnefrø ble samlet i Yanggu County, Liaocheng, Kina; frø av S. americanum og gresskar lokal variasjon Yinsu ble kjøpt fra et marked.<ol><li>Samle frø av vill soyabønne, S. americanum og det lokale sortimentet av gresskar, så dem i vermikulitt på en dybde på 1 cm, og vann dem grundig. Plant 20 frø i 8 cm x 11 cm x 9 cm plastbokser. Dyrk plantene i et vekstkammer ved 24 ± 2 °C med ...

One-Step Hairy Root Transformation Method for Advancing Root-Related Biology

<ol>
	<li>Chilton, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agrobacterium+rhizogenes+inserts+T-DNA+into+the+genome+of+the+host+plant+root+cells.">Agrobacterium rhizogenes inserts T-DNA into the genome of the host plant root cells.</a> Nature. 295, 432-434 (1982).</li><li>Fan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fast,+simple,+high+efficient+and+one-step+generation+of+composite+cucumber+plants+with+transgenic+roots+by+Agrobacterium+rhizogenes-mediated+transformation.">A fast, simple, high efficient and one-step generation of composite cucumber plants with transgenic roots by Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation.</a> Plant Cell, Tissue and Organ Culture (PCTOC). 141, 207-216 (2020).</li><li>Du, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+targeted+mutagenesis+in+soybean+by+TALENs+and+CRISPR/Cas9.">Efficient targeted mutagenesis in soybean by TALENs and CRISPR/Cas9.</a> Journal of Biotechnology. 217, 90-97 (2016).</li><li>Nguyen, D. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+hairy+root+system+for+validation+of+plant+transformation+vector+and+CRISPR/Cas+construct+activities+in+cucumber+(Cucumis+sativus+L.).">An efficient hairy root system for validation of plant transformation vector and CRISPR/Cas construct activities in cucumber (Cucumis sativus L.).</a> Frontiers in Plant Science. 12, 770062 (2022).</li><li>Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AtGCS+promoter-driven+clustered+regularly+interspaced+short+palindromic+repeats/Cas9+highly+efficiently+generates+homozygous/biallelic+mutations+in+the+transformed+roots+by+Agrobacterium+rhizogenes-mediated+transformation.">AtGCS promoter-driven clustered regularly interspaced short palindromic repeats/Cas9 highly efficiently generates homozygous/biallelic mutations in the transformed roots by Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation.</a> Frontiers in Plant Science. 13, 952428 (2022).</li><li>Irigoyen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+hairy+roots+enable+high+throughput+identification+of+antimicrobials+against+Candidatus+Liberibacter+spp.">Plant hairy roots enable high throughput identification of antimicrobials against Candidatus Liberibacter spp.</a> Nature Communications. 11 (1), 5802 (2020).</li><li>Plasencia, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eucalyptus+hairy+roots,+a+fast,+efficient+and+versatile+tool+to+explore+function+and+expression+of+genes+involved+in+wood+formation.">Eucalyptus hairy roots, a fast, efficient and versatile tool to explore function and expression of genes involved in wood formation.</a> Plant Biotechnology Journal. 14 (6), 1381-1393 (2016).</li><li>Gutierrez-Valdes, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hairy+root+cultures-a+versatile+tool+with+multiple+applications.">Hairy root cultures-a versatile tool with multiple applications.</a> Frontiers in Plant Science. 11, 33 (2020).</li><li>Stougaard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agrobacterium+rhizogenes+as+a+vector+for+transforming+higher+plants.+Application+in+Lotus+corniculatus+transformation.">Agrobacterium rhizogenes as a vector for transforming higher plants. Application in Lotus corniculatus transformation.</a> Methods in Molecular Biology. 49, 49-61 (1995).</li><li>Kereszt, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agrobacterium+rhizogenes-mediated+transformation+of+soybean+to+study+root+biology.">Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation of soybean to study root biology.</a> Nature Protocols. 2 (4), 948-952 (2007).</li><li>Ho-Pl&#225;garo, T., Huertas, R., Tamayo-Navarrete, M. I., Ocampo, J. A., Garc&#237;a-Garrido, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+method+for+Agrobacterium+rhizogenes-mediated+transformation+of+tomato+suitable+for+the+study+of+arbuscular+mycorrhizal+symbiosis.">An improved method for Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation of tomato suitable for the study of arbuscular mycorrhizal symbiosis.</a> Plant Methods. 14, 34 (2018).</li><li>Yu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+phosphatidylserine+synthase+IbPSS1+affords+cellular+Na++homeostasis+and+salt+tolerance+by+activating+plasma+membrane+Na+/H++antiport+activity+in+sweet+potato+roots.">Overexpression of phosphatidylserine synthase IbPSS1 affords cellular Na+ homeostasis and salt tolerance by activating plasma membrane Na+/H+ antiport activity in sweet potato roots.</a> Horticulture Research. 7, 131 (2020).</li><li>Boisson-Dernier, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agrobacterium+rhizogenes-transformed+roots+of+Medicago+truncatula+for+the+study+of+nitrogen-fixing+and+endomycorrhizal+symbiotic+associations.">Agrobacterium rhizogenes-transformed roots of Medicago truncatula for the study of nitrogen-fixing and endomycorrhizal symbiotic associations.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions: MPMI. 14 (6), 695-700 (2001).</li><li>Fan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+generation+of+composite+soybean+plants+with+transgenic+roots+by+Agrobacterium+rhizogenes-mediated+transformation.">One-step generation of composite soybean plants with transgenic roots by Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation.</a> BMC Plant Biology. 20 (1), 208 (2020).</li><li>Fan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anthocyanin,+a+novel+and+user-friendly+reporter+for+convenient,+non-destructive,+low+cost,+directly+visual+selection+of+transgenic+hairy+roots+in+the+study+of+rhizobia-legume+symbiosis.">Anthocyanin, a novel and user-friendly reporter for convenient, non-destructive, low cost, directly visual selection of transgenic hairy roots in the study of rhizobia-legume symbiosis.</a> Plant Methods. 16, 94 (2020).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+AtMYB75+as+a+reporter+gene+in+the+study+of+symbiosis+between+tomato+and+Funneliformis+mosseae.">Application of AtMYB75 as a reporter gene in the study of symbiosis between tomato and Funneliformis mosseae.</a> Mycorrhiza. 33 (3), 181-185 (2023).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+set+of+novel+binary+expression+vectors+for+plant+gene+function+analysis+and+genetic+transformation.">Development of a set of novel binary expression vectors for plant gene function analysis and genetic transformation.</a> Frontiers in Plant Science. 13, 1104905 (2023).</li><li>Li, Q. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phytochrome+B+inhibits+darkness-induced+hypocotyl+adventitious+root+formation+by+stabilizing+IAA14+and+suppressing+ARF7+and+ARF19.">Phytochrome B inhibits darkness-induced hypocotyl adventitious root formation by stabilizing IAA14 and suppressing ARF7 and ARF19.</a> The Plant Journal: For Cell and Molecular Biology. 105 (6), 1689-1702 (2021).</li></ol>

Den en-trinns A. rhizogenes-medierte hårete rotmetoden er en enklere og mer effektiv metode for å produsere komposittplanter enn hypokotylinjeksjonsmetoden. Ett-trinns ARM-metoden forbedrer effektiviteten av hårete rottransformasjon betydelig, forkorter tiden for å produsere hårete røtter, øker antall hårete røtter og reduserer mengden arbeid som er involvert. Den forbedrede transformasjonsprotokollen er optimal for studier på symbioser mellom bælgplanter og rhizobia og mellom planter og arbuskulære ...

Agrobacterium rhizogenes er en gram-negativ jordbakterie fra familien Rhizobiaceae. A. rhizogenes kan infisere nesten alle dikotyledoner, noen monokotyledoner og individuelle gymnospermer gjennom sår, og produserer hårete røtter i smittede planter. Bakterien bærer Ri (rotinduserende) plasmid, og T-DNA av Ri-plasmidet bærer opinsyntesegenet og rol-gener (rotlokusgener). Etter at T-DNA fra Ri-plasmidet kommer inn i en plantecelle og er integrert i et vertskromosom, induserer uttrykket av rol-genene produksjon av hårete røtter1. En plantebinær uttrykksvektor som bærer et målgen blir transformert til A. rhizogenes, og de transformerte A. rhizogenes brukes til å infisere en plante. Transgene røtter kan induseres i infiserte planter, og produserer sammensatte planter som inneholder transgene røtter og ikke-transgene stammer og knopper. Vanligvis kan en komposittplante oppnås innen 14-20 dager. A. rhizogenes-mediert hårete rottransformasjon er generelt ikke begrenset av genotype i dikotyledonøse planter2. De hårete røttene produsert av A. rhizogenes-infiserte planter er preget av en rask vekst, stabil arv og enkel betjening. Hårete rottransformasjon mediert av A. rhizogenes er for tiden mye brukt til å studere rotrelatert biologi. Videre kan transformasjonen av hårete røtter også brukes til å validere og optimalisere målredigeringseffektiviteten til CRISPR / Cas9-systemet 3,4,5 og protein subcellulær lokalisering. Derfor er hårete rottransformasjon et viktig verktøy i forskning på plantegenfunksjon, metabolsk engineering og interaksjoner mellom røtter og rhizosfærens mikroorganismer 6,7,8.
Sammensatte planter som inneholder transgene røtter oppnådd gjennom hårete rottransformasjon har blitt mye produsert i dikotyledonøse planter, spesielt i belgfrukter. Den tradisjonelle metoden for å injisere hypocotyl med A. rhizogenes har blitt brukt til å produsere sammensatt Lotus corniculatus9, soyabønner 10, tomat11, søtpoteter12 og mange andre planter 5,8. Hypokotylinjeksjonsmetoden er ineffektiv og vil sannsynligvis føre til død av unge eller små hypokotylplanter. Derfor ble metoden forbedret ved å kutte av embryonale røtter, belegge frøplantesnittet med A. rhizogenes, og deretter plassere hypocotyl på sterilt kulturmedium for rooting dyrking13. Disse trinnene utføres imidlertid i et sterilt miljø, og operasjonstrinnene er relativt tungvinte. Spesielt må de resulterende komposittplantene transplanteres, noe som øker arbeidsmengden. I tidligere arbeid ble ett-trinns A. rhizogenes-mediert (ARM) hårete rottransformasjon etablert i agurk, soyabønne, Lotus japonicus, Medicago truncatula og tomat 2,14,15,16,17. Den primære roten og delvis hypokotyl ble fjernet, snittstedet for den gjenværende hypokotylen ble belagt med transformerte A. rhizogenes, og frøplanten ble deretter plantet i fuktig steril vermikulitt. Etter 12 dagers dyrking ble hårete røtter produsert på snittstedet. Ett-trinns ARM-metoden er svært effektiv og krever mindre tid å produsere hårete røtter. Transplantasjon etter å ha dannet hårete røtter er heller ikke nødvendig. Fordi mikrobiell forurensning kan unngås uten transplantasjon, kan en-trinns ARM-metoden være spesielt nyttig når man studerer interaksjoner mellom planter og mikroorganismer, for eksempel symbiotisk nitrogenfiksering mellom bælgplanter og Rhizobia, og symbioser mellom planter og arbuskulær mykorrhizal sopp. I dette papiret er en detaljert ett-trinns A. rhizogenes-mediert hårete rottransformasjonsprotokoll utstyrt med eksempler på sammensatte planter produsert i vill soyabønne, Solanum americanum og gresskar. Med protokollen kan forskere jevnt utføre ett-trinns ARM-transformasjonen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>kanamycin</td>
			<td>Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.</td>
			<td>A506636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB medium</td>
			<td>Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.</td>
			<td>B540113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plastic box</td>
			<td>LiaoSu</td>
			<td></td>
			<td>8 cm x 11 cm x 9 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pumpkin</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>local variety Yinsu</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>streptomycin</td>
			<td>Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.</td>
			<td>A610494&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tanon-5200Multi machine</td>
			<td>Tanon Co., Ltd., China</td>
			<td>5200Multi</td>
			<td>chemiluminescence imaging system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tomato</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>local variety Zhongshu4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>wild soybean</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>collected in Yanggu County, Liaocheng, China</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an efficient and reproducible method for producing composite plants by agrobacterium rhizogenes-based hairy root transformation

Å produsere sammensatte planter med transgene røtter og ikke-transgene stammer og knopper ved hjelp av Agrobacterium rhizogenes-mediert hårete rottransformasjon er et kraftig verktøy for å studere rotrelatert biologi. Hårete rottransformasjon er etablert i et bredt spekter av dikotyledoner og i flere monokotyledonarter og er nesten uavhengig av genotypen. Den tradisjonelle metoden for hypokotylinjeksjon med A. rhizogenes for å oppnå sammensatte planter er ineffektiv, tidkrevende, arbeidskrevende og forårsaker ofte død av ømme og små hypokotylplanter. En svært effektiv, ett-trinns hårete rottransformasjon mediert av A. rhizogenes ble etablert tidligere, noe som eliminerer behovet for transplantasjon etter å ha produsert hårete røtter. I denne studien ble en delvis hypokotyl og primærrot fjernet, hypokotylsnittstedet ble belagt med A. rhizogenes, og deretter ble hypokotyler plantet i steril vermikulitt. Etter 12 dagers dyrkning utvidet hypokotylsnittet seg og nye hårete røtter ble indusert. Denne artikkelen gir den detaljerte protokollen for en ett-trinns transformasjonsmetode mediert av A. rhizogenes, med dens effektivitet demonstrert ved å produsere sammensatte planter av vill soyabønne, Solanum americanum og gresskar.

Agrobacterium rhizogenes is a gram-negative soil bacterium from the family Rhizobiaceae. A. rhizogenes can infect almost all dicotyledons, a few monocotyledons, and individual gymnosperms through wounds, producing hairy roots in infected plants. The bacterium carries the Ri (root-inducing) plasmid, and the T-DNA of the Ri plasmid carries the opine synthesis gene and rol genes (root locus genes). After the T-DNA of the Ri plasmid enters a plant cell and is integrated into a host chromosome, the expression of the rol genes induces production of hairy roots1. A plant binary expression vector carrying a target gene is transformed into A. rhizogenes, and the transformed A. rhizogenes is used to infect a plant. Transgenic roots can be induced in infected plants, producing composite plants containing transgenic roots and nontransgenic stems and buds. Generally, a composite plant can be obtained within 14-20 days. A. rhizogenes-mediated hairy root transformation is generally not limited by genotype in dicotyledonous plants2. The hairy roots produced by A. rhizogenes-infected plants are characterized by a fast growth rate, stable inheritance, and easy operation. Hairy root transformation mediated by A. rhizogenes is currently widely used to study root-related biology. Furthermore, the transformation of hairy roots can also be used to validate and optimize the target-editing efficiency of the CRISPR/Cas9 system3,4,5 and protein subcellular localization. Therefore, hairy root transformation is an important tool in research on plant gene function, metabolic engineering, and interactions between roots and rhizosphere microorganisms6,7,8.
Composite plants containing transgenic roots obtained through hairy root transformation have been widely produced in dicotyledonous plants, especially in legumes. The traditional method of injecting the hypocotyl with A. rhizogenes has been used to produce composite Lotus corniculatus9, soybeans10, tomato11, sweet potatoes12,&#160;and many other plants5,8. The hypocotyl-injection method is inefficient and is likely to cause the death of young or tiny hypocotyl plants. Therefore, the method was improved by cutting off the embryonic roots, coating the seedling incision with A. rhizogenes, and then placing the hypocotyl on sterile culture medium for rooting cultivation13. However, those steps are performed in a sterile environment, and the operation steps are relatively cumbersome. In particular, the resulting composite plants need to be transplanted, which increases the amount of work. In previous work, one-step A. rhizogenes-mediated (ARM) hairy root transformation was established in cucumber, soybean, Lotus japonicus, Medicago truncatula,&#160;and tomato2,14,15,16,17. The primary root and partial hypocotyl were removed, the incision site of the remaining hypocotyl was coated with transformed A. rhizogenes, and the seedling was then planted into moist sterile vermiculite. After 12 days of cultivation, hairy roots were produced at the incision site. The one-step ARM method is highly efficient and requires less time to produce hairy roots. Transplanting after forming hairy roots is also not necessary. Because microbial contamination can be avoided without transplantation, the one-step ARM method can be particularly useful when studying interactions between plants and microorganisms, such as symbiotic nitrogen fixation between leguminous plants and Rhizobia, and symbioses between plants and arbuscular mycorrhizal fungi. In this paper, a detailed one-step A. rhizogenes-mediated&#160;hairy root transformation protocol is provided with examples of composite plants produced in wild soybean, Solanum americanum, and pumpkin. With the protocol, researchers can smoothly perform the one-step ARM transformation.

Author Spotlight: Streamlining Composite Plant Production via Agrobacterium rhizogenes-Mediated Hairy Root Transformation 

En effektiv og reproduserbar metode for å produsere komposittplanter ved Agrobacterium rhizogenes-basert hårete rottransformasjon

Svært effektiv ett-trinns A. rhizogenes-mediert hårete rottransformasjon Hårete røtter ble produsert på hypokotylsnittstedet 12 dager etter inokulering med konstruert K599. Transgene hårete røtter ble bestemt basert på uttrykket av reportergenet inneholdt i den binære vektoren. Transgene røtter transformert med reportergenet DsRed2 av sammensatt villsoyabønne, S. americanum og gresskar ble observert under naturlig (figur 2A, figur 2C og figur <strong class...

Watch this Scientific Journal Video about Streamlining Composite Plant Production via Agrobacterium rhizogenes-Mediated Hairy Root Transformation at JoVE.com

Her gir vi den detaljerte protokollen for en ett-trinns transformasjonsmetode mediert av Agrobacterium tumefaciens for å produsere komposittplanter.

Producing composite plants with transgenic roots and nontransgenic stems and buds using Agrobacterium rhizogenes-mediated hairy root transformation is a ...

Vårt team fokuserer på Agrobacterium rhizogenes-basert hårete rottransformasjon. Hårete rottransformasjon er avgjørende for å studere plantegenfunksjon, metabolsk prosjektering og interaksjoner mellom røtter og mikroorganismer i rhizosfæren. Denne artikkelen gir en ett-trinns transformasjonsmetode, formidlet av Agrobacterium rhizogenes.Hårete rottransformasjon er etablert i forskjellige dikotyledoner og monokotyledonarter, og er nesten uavhengig med genotypen. Ett-trinns metoden mediert av Agrobacterium rhizogenes for å indusere hårete røtter er enklere og mer effektiv for å lage komposittplanter sammenlignet med hypocotylinjeksjonsmetoden. Hypokotylinjeksjonsmetoden er ineffektiv og vil sannsynligvis føre til at unge eller små hypokotylplanter dør.Den ett-trinns Agrobacterium rhizogenes-medierte metoden er svært effektiv og krever mindre tid for å produsere hårete røtter. Videre er det ikke behov for transplantasjon forbi dannelsen av hårete røtter. Alfa-tegnreguleringsgener og beta-tegnsyntesegener ble brukt som virale skjermmarkører i hårete rottransformasjon mediert av Agrobacterium rhizogenes.