Name: Author Spotlight: Optimizing iPSC Differentiation for Efficient Production to Generate Kidney Organoids
Uploaded: 2023-09-01T13:20:00
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Somos extremamente gratos a todos os membros do Mao e Hu Lab, do passado e do presente, pelas interessantes discussões e grandes contribuições para o projeto. Agradecemos ao National Clinical Research Center for Child Health pelo grande apoio. Este estudo foi financiado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (U20A20351 para Jianhua Mao, 82200784 para Lidan Hu), a Fundação de Ciências Naturais da Província de Zhejiang da China (No. LQ22C070004 a Lidan Hu) e a Fundação de Ciências Naturais da Província de Jiangsu (Subsídios nº. BK20210150 para Gang Wang).

As iPSCs utilizadas no presente estudo foram obtidas de fonte comercial. As células foram mantidas com meio mTeSR em placas revestidas com matriz de membrana basal comercialmente disponíveis (ver Tabela de Materiais). A Tabela 1 contém todas as composições dos meios utilizados no estudo.
1. Plating iPSCs para diferenciação e indução de estria primitiva posterior (PS)
<ol><li>Lave as iPSCs na placa de 6 poços revestida com matriz de...

Using Induced Pluripotent Stem Cell Suspension for Kidney Organoid Production

<ol>
	<li>Tekguc, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kidney+organoids:+a+pioneering+model+for+kidney+diseases.">Kidney organoids: a pioneering model for kidney diseases.</a> Translational Research. 250, 1-17 (2022).</li><li>Hill, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+prevalence+of+chronic+kidney+disease+-+a+systematic+review+and+meta-analysis.">Global prevalence of chronic kidney disease - a systematic review and meta-analysis.</a> PLOS ONE. 11 (7), 0158765 (2016).</li><li>Rossi, G., Manfrin, A., Lutolf, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+and+potential+in+organoid+research.">Progress and potential in organoid research.</a> Nature Reviews Genetics. 19 (11), 671-687 (2018).</li><li>Takasato, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directing+human+embryonic+stem+cell+differentiation+towards+a+renal+lineage+generates+a+self-organizing+kidney.">Directing human embryonic stem cell differentiation towards a renal lineage generates a self-organizing kidney.</a> Nature Cell Biology. 16 (1), 118-126 (2014).</li><li>Morizane, R., Lam, A. Q., Freedman, B. S., Kishi, S., Valerius, M. T., Bonventre, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nephron+organoids+derived+from+human+pluripotent+stem+cells+model+kidney+development+and+injury.">Nephron organoids derived from human pluripotent stem cells model kidney development and injury.</a> Nature Biotechnology. 33 (11), 1193-1200 (2015).</li><li>Freedman, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+kidney+disease+with+CRISPR-mutant+kidney+organoids+derived+from+human+pluripotent+epiblast+spheroids.">Modelling kidney disease with CRISPR-mutant kidney organoids derived from human pluripotent epiblast spheroids.</a> Nature Communications. 6 (1), 8715 (2015).</li><li>Takasato, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kidney+organoids+from+human+iPS+cells+contain+multiple+lineages+and+model+human+nephrogenesis.">Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis.</a> Nature. 526 (7574), 564-568 (2015).</li><li>Mugford, J. W., Sipil&#228;, P., McMahon, J. A., McMahon, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osr1+expression+demarcates+a+multi-potent+population+of+intermediate+mesoderm+that+undergoes+progressive+restriction+to+an+Osr1-dependent+nephron+progenitor+compartment+within+the+mammalian+kidney.">Osr1 expression demarcates a multi-potent population of intermediate mesoderm that undergoes progressive restriction to an Osr1-dependent nephron progenitor compartment within the mammalian kidney.</a> Developmental biology. 324 (1), 88-98 (2008).</li><li>SaxOn, L., Sariola, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+organogenesis+of+the+kidney.">Early organogenesis of the kidney.</a> Pediatric Nephrology. 1, 385-392 (1987).</li><li>Kobayashi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Six2+defines+and+regulates+a+multipotent+self-renewing+nephron+progenitor+population+throughout+mammalian+kidney+development.">Six2 defines and regulates a multipotent self-renewing nephron progenitor population throughout mammalian kidney development.</a> Cell Stem Cell. 3 (2), 169-181 (2008).</li><li>Boyle, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fate+mapping+using+Cited1-CreERT2+mice+demonstrates+that+the+cap+mesenchyme+contains+self-renewing+progenitor+cells+and+gives+rise+exclusively+to+nephronic+epithelia.">Fate mapping using Cited1-CreERT2 mice demonstrates that the cap mesenchyme contains self-renewing progenitor cells and gives rise exclusively to nephronic epithelia.</a> Developmental Biology. 313 (1), 234-245 (2008).</li><li>Nishinakamura, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+kidney+organoids:+progress+and+remaining+challenges.">Human kidney organoids: progress and remaining challenges.</a> Nature Reviews Nephrology. 15 (10), 613-624 (2019).</li><li>Kumar, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kidney+micro-organoids+in+suspension+culture+as+a+scalable+source+of+human+pluripotent+stem+cell-derived+kidney+cells.">Kidney micro-organoids in suspension culture as a scalable source of human pluripotent stem cell-derived kidney cells.</a> Development. 146 (5), 172361 (2019).</li><li>Takasato, M., Er, P. X., Chiu, H. S., Little, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+kidney+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells.">Generation of kidney organoids from human pluripotent stem cells.</a> Nature Protocols. 11 (9), 1681-1692 (2016).</li></ol>

Um protocolo detalhado foi descrito para a geração de organoides renais a partir de iPSCs, envolvendo pequenas modificações no meio basal, densidade celular inicial e concentração de CHIR99021. Em vários experimentos, os fatores críticos para o sucesso da geração de organoides renais foram a diferenciação inicial do mesoderma intermediário (IM) e o estado celular no Dia 7. Além disso, diferentes linhagens de iPSC exibiram variações na proliferação celular e potencial de diferenciação, resultando em de...

O rim desempenha um papel crítico na manutenção da homeostase fisiológica, dependendo de sua unidade funcional. Néfrons, que excretam produtos residuais, podem regular a composição dos fluidos corporais. A doença renal crônica (DRC), causada por mutações hereditárias ou outros fatores de alto risco, eventualmente evoluirá para doença renal terminal (DRCT)1,2. A DRCT é aparentemente devida à limitada capacidade de regeneração dos néfrons. Assim, a terapia renal substitutiva é necessária. A diferenciação dirigida de iPSCs humanas permite a geração in vitro de organoides renais 3D específicos para o paciente, que podem ser usados para estudar o desenvolvimento renal, modelar doenças específicas do paciente e realizar triagem de drogas nefrotóxicas 3,4.
Durante o desenvolvimento embrionário, os rins originam-se do mesoderma intermediário (IM), que se diferencia da estria primitiva (SP). A via de sinalização WNT clássica pode induzir diferenciação adicional de MI com a participação coordenada de FGF (FGF9, FGF20) e BMP (sinalização Bmp7 através de JNK)5,6,7. Produzem duas importantes populações celulares de células progenitoras nefrônicas (NPC): o broto ureteral (UB) e o mesênquima metanéfrico (MM), formando os ductos coletores e o néfron, respectivamente 8,9. Cada néfron é composto por segmentos glomerulares e tubulares, como os túbulos proximal e distal, e a alça de Henle10,11. De acordo com a teoria mencionada acima, os protocolos atualmente publicados mimetizam as cascatas de sinal e a estimulação do fator de crescimento para induzir organoides renais5,12.
Nos últimos anos, muitos protocolos foram desenvolvidos para diferenciar iPSCs humanas em organoides renais 5,6,7,12. Takasato et al.7 otimizaram a duração do tratamento com CHIR (agonista WNT) antes da reposição por FGF9. De acordo com seu protocolo, a exposição a CHIR por 4 dias, seguida de FGF9 por 3 dias, é a maneira mais eficaz de induzir IM a partir de iPSCs. Filtros transwell foram utilizados como formato de cultura em seu procedimento; no entanto, este método é difícil para iniciantes. Por isso, Kumar et al.13 tentaram mudar o formato da cultura e optaram por suspendê-la. Eles dissociaram as células aderentes no Dia 7 para semeadura em placas de baixa aderência para ajudá-las a se agrupar em corpos embrionários (EBs) que contêm estruturas semelhantes a néfrons. No entanto, o efeito em lote desses métodos foi aparente, especialmente em diferentes iPSCs. Além disso, diferentes literaturas relataram que a concentração de CHIR variou de 7 μM a 12 μM 5,13,14.
Especulamos que a concentração da densidade celular e o CHIR poderiam afetar a geração de organoides em diferentes iPSCs, e isso foi verificado inúmeras vezes em nossos experimentos. O presente protocolo modificou um pouco o método de estudo de Kumar et al.13 e forneceu aos usuários um procedimento passo a passo. O cronograma e o esquema da abordagem são mostrados na Figura 1.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96 Well Cell Culture Plate, Flat-Bottom</td>
			<td>NEST</td>
			<td>Cat #701003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>Cat #o7920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzyl alcohol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat #100-51-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzyl benzoate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat #120-51-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological Safety Cabinet</td>
			<td>Haier</td>
			<td>Cat #HR40&#160;<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/65698/65698eq01.jpg" style="margin: auto;" />&#160;A2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin anti-human LTL (1:300)</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>Cat #B-1325</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood mononuclear cells hiPS-B1 (iPSc, female)</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon dioxide level shaker</td>
			<td>HAMANY</td>
			<td>Cat #C0-06UC6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals, peptides, and recombinant proteins</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021 (Wnt pathway activator)</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>Cat #72054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Costar Multiple 6 Well Cell Culture Plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Cat #3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Costar Ultra-Low Attachment 6 Well Plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Cat #3471</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CryoStor CS10</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>Cat #07930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI stain Solution</td>
			<td>Coolaber</td>
			<td>Cat #SL7102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran, Alexa Fluor 647</td>
			<td>Thermo SCIENTIFIC</td>
			<td>Cat #D22914</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12 HEPES-free</td>
			<td>Servicebio</td>
			<td>Cat #G4610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey Anti-Sheep IgG H&#38;L (Alexa Fluor 647)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Cat #ab150179</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey serum stoste</td>
			<td>Meilunbio</td>
			<td>Cat #MB4516-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-PBS (without calcium, magnesium, phenol red)</td>
			<td>Solarbio Life Science</td>
			<td>Cat #D1040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry Bath Incubator</td>
			<td>Shanghai Jingxin</td>
			<td>Cat #JX-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dylight 488-Goat Anti-Mouse IgG (1:400)</td>
			<td>Earthox</td>
			<td>Cat #E032210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dylight 488-Goat Anti-Rabbit IgG (1:400)</td>
			<td>Earthox</td>
			<td>Cat #E032220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dylight 549-Goat Anti-Mouse IgG (1:400)</td>
			<td>Earthox</td>
			<td>Cat #E032310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dylight 549-Goat Anti-Rabbit IgG (1:400)</td>
			<td>Earthox</td>
			<td>Cat #E032320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dylight 649-Goat Anti-Rabbit IgG (1:400)</td>
			<td>Earthox</td>
			<td>Cat #E032620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Experimental models: Cell Lines</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forma Steri-Cycle CO2 Incubator</td>
			<td>Thermo SCIENTIFIC</td>
			<td>Cat #370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geltre LDEV-Free</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>Cat #A1413202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Bottom Culture Dishes</td>
			<td>NEST</td>
			<td>Cat #801002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-human CUBN (1:300)</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>Cat #sc-20607</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin Solution (Cell culture supplement)</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>Cat #07980</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Recombinant FGF-9</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>Cat #78161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Microscope</td>
			<td>OLYMPUS</td>
			<td>Cat #CKX53</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser Scanning Confocal Microscope</td>
			<td>OLYMPUS</td>
			<td>Cat #FV3000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl cellulose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat #M7027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Centrifuge</td>
			<td>HENGNUO</td>
			<td>Cat #2-4B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-human CD31 (1:300)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>Cat #555444</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-human ECAD (1:300)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>Cat #610182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-human Integrin beta 1 (1:300)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Cat #ab30394</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-human MEIS 1/2/3 (1:300)</td>
			<td>Thermo SCIENTIFIC</td>
			<td>Cat #39795</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mowiol 4-88 (Polyvinylalcohol 4-88)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat #81381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR1 5X Supplement</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>Cat #85852</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR1 Basal Medium</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>Cat #85851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc CryoTube Vials</td>
			<td>Thermo SCIENTIFIC</td>
			<td>Cat #377267</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Others</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-human GATA3 (1:300)</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>Cat #5852S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-human LRP2 (1:300)</td>
			<td>Sapphire Bioscience</td>
			<td>Cat #NBP2-39033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-human Synaptopodin (1:300)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Cat #ab224491</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-human WT1 (1:300)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Cat #ab89901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-mouse PDGFR (1:300)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Cat #ab32570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human Serum Albumin (rHSA)</td>
			<td>YEASEN</td>
			<td>Cat #20901ES03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sheep anti-human NPHS1 (1:300)</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>Cat #AF4269</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STEMdiff APEL 2 Medium</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>Cat #05275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin Cy3 (1:400)</td>
			<td>Gene Tex</td>
			<td>Cat #GTX85902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Versene (1X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>Cat #15040066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632 (Dihydrochloride)</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>Cat #72304</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generating kidney organoids in suspension from induced pluripotent stem cells

Os organoides renais podem ser gerados a partir de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) através de várias abordagens. Esses organoides são uma grande promessa para modelagem de doenças, triagem de drogas e potenciais aplicações terapêuticas. Este artigo apresenta um procedimento passo a passo para a criação de organoides renais a partir de iPSCs, partindo da estria primitiva posterior (SP) até o mesoderma intermediário (IM). A abordagem baseia-se no meio APEL 2, que é um meio definido e livre de componentes animais. É suplementado com uma alta concentração de agonista WNT (CHIR99021) por uma duração de 4 dias, seguido por fator de crescimento de fibroblastos 9 (FGF9)/heparina e uma baixa concentração de CHIR99021 por mais 3 dias. Durante esse processo, ênfase é dada à seleção da densidade celular e da concentração CHIR99021 ideais no início das iPSCs, pois esses fatores são críticos para o sucesso da geração de organoides renais. Um aspecto importante desse protocolo é a cultura da suspensão em placa de baixa aderência, permitindo que o MI evolua gradualmente para estruturas néfrons, englobando estruturas glomerulares, tubulares proximais e tubulares distais, todas apresentadas em um formato visualmente compreensível. Em geral, este protocolo detalhado oferece uma técnica eficiente e específica para produzir organoides renais a partir de diversas iPSCs, garantindo resultados bem-sucedidos e consistentes.

The kidney plays a critical role in maintaining physiological homeostasis, depending on its functional unit. Nephrons, which excrete waste products, can regulate the composition of body fluids. Chronic kidney disease (CKD), caused by hereditary mutations or other high-risk factors, will eventually progress to end-stage kidney disease (ESKD)1,2. ESKD is apparently due to the limited regeneration capacity of nephrons. Thus, renal replacement therapy is required. Directed differentiation of human iPSCs enables the in vitro generation of patient-specific 3D kidney organoids, which can be used to study kidney development, model patient-specific diseases, and perform nephrotoxic drug screening3,4.
During embryonic development, kidneys originate from the intermediate mesoderm (IM), which differentiates from the primitive streak (PS). The classical WNT signaling pathway may induce additional differentiation of IM with the coordinated participation of FGF (FGF9, FGF20) and BMP (Bmp7 signaling through JNK)5,6,7. They produce two important cell populations of nephric progenitor cells (NPC): the ureteral bud (UB), and the metanephric mesenchyme (MM), forming the collecting ducts and the nephron, respectively8,9. Each nephron consists of glomerular and tubular segments, such as the proximal and distal tubules, and the loop of Henle10,11. According to the theory mentioned above, currently published protocols mimic the signal cascades and growth factor stimulation to induce kidney organoids5,12.
Over the past several years, many protocols have been developed to differentiate human iPSCs into kidney organoids5,6,7,12. Takasato et al.7 optimized the duration of CHIR (WNT agonist) treatment before replacement by FGF9. According to their protocol, CHIR exposure for 4 days, followed by FGF9 for 3 days, is the most effective way to induce IM from iPSCs. Transwell filters were utilized as the culture format in their procedure; however, this method is difficult for beginners. Therefore, Kumar et al.13 tried to change the culture format and chose to suspend the culture. They dissociated the adherent cells on Day 7 for seeding in low adherent plates to help them assemble into embryoid bodies (EBs) that contain nephron-like structures. However, the batch effect of these methods was apparent, especially in different iPSCs. Additionally, different literature reported that the concentration of CHIR varied from 7 &#181;M to 12 &#181;M5,13,14.
We speculated that the concentration of cell density and the CHIR might affect the generation of organoids in different iPSCs, and this has been verified numerous times in our experiments. The present protocol has slightly modified the study method of Kumar et al.13 and provided users with a step-by-step procedure. The schedule and schematic of the approach are shown in Figure 1.

Author Spotlight: Optimizing iPSC Differentiation for Efficient Production to Generate Kidney Organoids 

Geração de Organoides Renais em Suspensão a partir de Células-Tronco Pluripotentes Induzidas

A produção de IM é obtida pela ativação da sinalização canônica WNT usando o inibidor de GSK3 CHIR99021, seguido de FGF9/heparina. Do Dia 0 ao Dia 4, as iPSCs se expandem rapidamente e assumem formas romboides ou triangulares. A confluência atinge 90%-100% e se acumula uniformemente até o 7º dia. Após a cultura da suspensão, os agregados formam espontaneamente estruturas de néfrons após dissociação no 7º dia. Os organoides renais criados através da cultura de suspensão apresentam estruturas tubulares ...

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Este protocolo apresenta um método abrangente e eficiente para a produção de organoides renais a partir de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) utilizando condições de cultura em suspensão. A ênfase primária deste estudo reside na determinação da densidade celular inicial e da concentração do agonista WNT, beneficiando assim os investigadores interessados na pesquisa de organoides renais.

Kidney organoids can be generated from induced pluripotent stem cells (iPSCs) through various approaches. These organoids hold great promise for disease ...

Nossa pesquisa apresenta um método abrangente e eficiente para a produção de organoides renais a partir de células-tronco pluripotentes induzidas, usando condições culturais de suspensão. Enfatizamos a importância da densidade celular inicial e da concentração de agonistas WNT durante a fase indutora, o que servirá para formar novos pesquisadores organoides. Atualmente, é difícil obter uma única linhagem celular de alta densidade para iPSCs.O impacto do lote foi perceptível, particularmente em várias linhas iPSC. Os organoides renais de cada lote, podem ter uma forma e tamanho variados. Várias tentativas são necessárias para obter a melhor densidade celular inicial e concentração de CHIR para uma linhagem de iPSC.Estabelecemos que a diferenciação inicial do método intermediário é importante para o sucesso da formação de organoides renais. Nosso protocolo descreve detalhadamente como escolher as densidades celulares ótimas e as concentrações de CHIR durante o processo, pois diferentes linhagens de iPSC mostraram variações na capacidade de proliferação e diferenciação celular. Os pesquisadores podem gerar rapidamente os organoides renais específicos de suas iPSCs.De acordo com nosso protocolo, ajustando a densidade celular e a concentração de CHIR, é sem dúvida benéfico para todos os nossos pesquisadores se concentrarem em sua doença renal. Nossa pesquisa futura em laboratório tem que otimizar o método do protocolo em modelos de doenças, regenerar novos medicamentos e a triagem de drogas. Nos últimos cinco anos, nosso laboratório se concentrará na epigenética e no desenvolvimento de drogas tópicas celulares de várias doenças renais hereditárias, com base no desenvolvimento de pacientes, iPSC e modelos de doença organizada renal.