Name: Auteur in de schijnwerpers: optimalisatie van de neurovasculaire ontwikkeling van menselijke hersenorganoïde in kuikenembryo
Uploaded: 2024-02-16T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Author Spotlight: Optimizing the Neurovascular Development of Human Brain Organoid in Chick Embryo at JoVE.com

We danken Dr. Alcántara en Dr. Ortega van UB en de rest van de leden in het laboratorium van Dr. Acosta voor de inzichtelijke discussies. S.A. is Serra-Hunter collega-assistent-professor van de Generalitat de Catalunya aan de Universitat de Barcelona.

De embryo's van de White Leghorn-kip (Gallus gallus) werden behandeld door de Guide for the Care and Use of Laboratory Animals van het Institute of Laboratory Animals Resources, Commission of Life Sciences, National Research Council, VS, te volgen, en de experimenten werden goedgekeurd door de Council for Care and Use of Experimental Animals van de Universiteit van Barcelona.
1. Niet-geleide voorbereiding van hersenorganoïden
<ol><li>Handhaaf H9 menselijke embryona...

Het enten van menselijke hersenorganoïden in het chorioallantoïsche membraan van het kuikenembryo

<ol>
	<li>Camp, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+cerebral+organoids+recapitulate+gene+expression+programs+of+fetal+neocortex+development.">Human cerebral organoids recapitulate gene expression programs of fetal neocortex development.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (51), 15672-15677 (2015).</li><li>Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organogenesis+in+a+dish:+Modeling+development+and+disease+using+organoid+technologies.">Organogenesis in a dish: Modeling development and disease using organoid technologies.</a> Science. 345 (6194), 1247125 (2014).</li><li>Yang, Q., Hong, Y., Zhao, T., Song, H., Ming, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+makes+organoids+good+models+of+human+neurogenesis.">What makes organoids good models of human neurogenesis.</a> Front Neurosci. 16, 872794 (2022).</li><li>Sun, X. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+vascularized+brain+organoids+to+study+neurovascular+interactions.">Generation of vascularized brain organoids to study neurovascular interactions.</a> Elife. 11, e76707 (2022).</li><li>Paredes, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligodendrocyte+precursor+cell+specification+is+regulated+by+bidirectional+neural+progenitor-endothelial+cell+crosstalk.">Oligodendrocyte precursor cell specification is regulated by bidirectional neural progenitor-endothelial cell crosstalk.</a> Nat Neurosci. 24 (4), 478-488 (2021).</li><li>Matsui, T. K., Tsuru, Y., Hasegawa, K., Kuwako, K. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascularization+of+human+brain+organoids.">Vascularization of human brain organoids.</a> Stem Cells. 39 (8), 1017-1024 (2021).</li><li>Apostolou, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+and+challenges+in+stem+cell+biology.">Progress and challenges in stem cell biology.</a> Nat Cell Biol. 25 (2), 203-206 (2023).</li><li>Pham, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+human+vascularized+brain+organoids.">Generation of human vascularized brain organoids.</a> Neuroreport. 29 (7), 588-593 (2018).</li><li>Cakir, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+of+human+brain+organoids+with+a+functional+vascular-like+system.">Engineering of human brain organoids with a functional vascular-like system.</a> Nat Methods. 16 (11), 1169-1175 (2019).</li><li>Shi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascularized+human+cortical+organoids+(vorganoids)+model+cortical+development+in+vivo.">Vascularized human cortical organoids (vorganoids) model cortical development in vivo.</a> PLoS Biol. 18 (5), e3000705 (2020).</li><li>Mansour, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vivo+model+of+functional+and+vascularized+human+brain+organoids.">An in vivo model of functional and vascularized human brain organoids.</a> Nat Biotechnol. 36 (5), 432-441 (2018).</li><li>Revah, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maturation+and+circuit+integration+of+transplanted+human+cortical+organoids.">Maturation and circuit integration of transplanted human cortical organoids.</a> Nature. 610 (7931), 319-326 (2022).</li><li>Ribatti, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chicken+chorioallantoic+membrane+angiogenesis+model.">Chicken chorioallantoic membrane angiogenesis model.</a> Methods Mol Biol. 843, 47-57 (2012).</li><li>Nowak-Sliwinska, P., Segura, T., Iruela-Arispe, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chicken+chorioallantoic+membrane+model+in+biology,+medicine+and+bioengineering.">The chicken chorioallantoic membrane model in biology, medicine and bioengineering.</a> Angiogenesis. 17 (4), 779-804 (2014).</li><li>Kennedy, D. C., Coen, B., Wheatley, A. M., Mccullagh, K. J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microvascular+experimentation+in+the+chick+chorioallantoic+membrane+as+a+model+for+screening+angiogenic+agents+including+from+gene-modified+cells.">Microvascular experimentation in the chick chorioallantoic membrane as a model for screening angiogenic agents including from gene-modified cells.</a> Int J Mol Sci. 23 (1), 452 (2021).</li><li>Garreta, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fine+tuning+the+extracellular+environment+accelerates+the+derivation+of+kidney+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells.">Fine tuning the extracellular environment accelerates the derivation of kidney organoids from human pluripotent stem cells.</a> Nat Mater. 18 (4), 397-405 (2019).</li><li>Kaisto, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+renal+organoid+and+organotypic+culture+for+vascularization,+extended+development,+and+improved+microscopy+imaging.">Optimization of renal organoid and organotypic culture for vascularization, extended development, and improved microscopy imaging.</a> J Vis Exp. (157), e60995 (2020).</li><li>Varzideh, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+cardiomyocytes+undergo+enhanced+maturation+in+embryonic+stem+cell-derived+organoid+transplants.">Human cardiomyocytes undergo enhanced maturation in embryonic stem cell-derived organoid transplants.</a> Biomaterials. 192, 537-550 (2019).</li><li>Komatsu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cam+model+for+cic-dux4+sarcoma+and+its+potential+use+for+precision+medicine.">The cam model for cic-dux4 sarcoma and its potential use for precision medicine.</a> Cells. 10 (10), 2613 (2021).</li><li>Worsdorfer, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+complex+human+organoid+models+including+vascular+networks+by+incorporation+of+mesodermal+progenitor+cells.">Generation of complex human organoid models including vascular networks by incorporation of mesodermal progenitor cells.</a> Sci Rep. 9 (1), 15663 (2019).</li><li>Janzer, R. C., Jaff, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytes+induce+blood-brain+barrier+properties+in+endothelial+cells.">Astrocytes induce blood-brain barrier properties in endothelial cells.</a> Nature. 325 (6101), 253-257 (1987).</li><li>Janzer, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+blood-brain+barrier:+Cellular+basis.">The blood-brain barrier: Cellular basis.</a> J Inherit Metab Dis. 16 (4), 639-647 (1993).</li><li>Lobrinus, J. A., Juillerat-Jeanneret, L., Darekar, P., Schlosshauer, B., Janzer, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+the+blood-brain+barrier+specific+ht7+and+neurothelin+epitopes+in+endothelial+cells+of+the+chick+chorioallantoic+vessels+by+a+soluble+factor+derived+from+astrocytes.">Induction of the blood-brain barrier specific ht7 and neurothelin epitopes in endothelial cells of the chick chorioallantoic vessels by a soluble factor derived from astrocytes.</a> Brain Res Dev Brain Res. 70 (2), 207-211 (1992).</li><li>Holash, J. A., Stewart, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chorioallantoic+membrane+(cam)+vessels+do+not+respond+to+blood-brain+barrier+(bbb)+induction.">Chorioallantoic membrane (cam) vessels do not respond to blood-brain barrier (bbb) induction.</a> Adv Exp Med Biol. 331, 223-228 (1993).</li><li>Holash, J. A., Noden, D. M., Stewart, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Re-evaluating+the+role+of+astrocytes+in+blood-brain+barrier+induction.">Re-evaluating the role of astrocytes in blood-brain barrier induction.</a> Dev Dyn. 197 (1), 14-25 (1993).</li><li>Giandomenico, S. L., Sutcliffe, M., Lancaster, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+and+long-term+culture+of+advanced+cerebral+organoids+for+studying+later+stages+of+neural+development.">Generation and long-term culture of advanced cerebral organoids for studying later stages of neural development.</a> Nat Protoc. 16 (2), 579-602 (2021).</li><li>Wagner-Amos, K., Seymour, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+local+shell+conductance+on+the+vascularisation+of+the+chicken+chorioallantoic+membrane.">Effect of local shell conductance on the vascularisation of the chicken chorioallantoic membrane.</a> Respir Physiol Neurobiol. 134 (2), 155-167 (2003).</li><li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo.+1951.">A series of normal stages in the development of the chick embryo. 1951.</a> Dev Dyn. 195 (4), 231-272 (1992).</li><li>Paredes, I., Himmels, P., Ruiz De Almodovar, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurovascular+communication+during+cns+development.">Neurovascular communication during cns development.</a> Dev Cell. 45 (1), 10-32 (2018).</li><li>Hogan, K. A., Ambler, C. A., Chapman, D. L., Bautch, V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neural+tube+patterns+vessels+developmentally+using+the+vegf+signaling+pathway.">The neural tube patterns vessels developmentally using the vegf signaling pathway.</a> Development. 131 (7), 1503-1513 (2004).</li><li>Bozoyan, L., Khlghatyan, J., Saghatelyan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytes+control+the+development+of+the+migration-promoting+vasculature+scaffold+in+the+postnatal+brain+via+vegf+signaling.">Astrocytes control the development of the migration-promoting vasculature scaffold in the postnatal brain via vegf signaling.</a> J Neurosci. 32 (5), 1687-1704 (2012).</li><li>Himmels, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motor+neurons+control+blood+vessel+patterning+in+the+developing+spinal+cord.">Motor neurons control blood vessel patterning in the developing spinal cord.</a> Nat Commun. 8, 14583 (2017).</li><li>Di Lullo, E., Kriegstein, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+brain+organoids+to+investigate+neural+development+and+disease.">The use of brain organoids to investigate neural development and disease.</a> Nat Rev Neurosci. 18 (10), 573-584 (2017).</li></ol>

In deze studie beschrijven we een gedetailleerd protocol met tal van belangrijke stappen die zorgen voor een gunstige groei en ontwikkeling van menselijke hersenorganoïden bij transplantatie zonder de overleving van de kippenembryo's te verstoren. We adviseerden het gebruik van steriele naalden om de luchtkamer van het ei te doorboren na 24 uur incubatie (dag 1). Daarnaast probeerden we ook de punctie op dag 4 te maken (na het controleren van de eierschaal met licht om de ontwikkeling van het vaatstelsel te testen om er...

Menselijke hersenorganoïden zijn een opkomende techniek die ons in staat stelt om de vroege ontwikkeling van het menselijk brein in vitro te recapituleren 1,2,3. Desalniettemin is een van de belangrijkste beperkingen van dit model het gebrek aan vascularisatie, dat niet alleen een onmisbare rol speelt bij de homeostase van de hersenen, maar ook bij de ontwikkeling van dehersenen4. Naast de afgifte van zuurstof en voedingsstoffen, suggereert het toenemende bewijs dat het vasculaire systeem van de hersenen neurale differentiatie, migratie en synaptogenese reguleert tijdens de ontwikkeling 5,6. Daarom is er dringend behoefte aan betrouwbare modellen die de ontbrekende vasculaire signalering en structuur aan hersenorganoïden kunnen leveren, waardoor de complexiteit van menselijke hersenorganoïdegeneratie7 wordt vergroot.
Van de voorgestelde methoden voor vascularisatie kunnen twee belangrijke stroomlijnen worden overwogen: organoïde-enting in een levend organisme en puur in-vitrotechnologieën die endotheelcellen en neurale cellen samen kweken 8,9,10,11,12. Intracerebrale transplantatie bij muizen is kostbaar en tijdrovend, waardoor andere technologieën relevant zijn voor eenvoudigere modellen. De kuikenchorioallantoïsche membraan (CAM)-test is uitgebreid gebruikt om angiogenese 13,14,15 te bestuderen. In het afgelopen decennium hebben verschillende groepen met succes verschillende soorten organoïden, waaronder nier16,17, cardiale18 en tumororganoïden19,20, in CAM's geënt. Toch is er weinig bekend over de werkzaamheid, toxiciteit/afstoting, fysiologisch effect en methoden om menselijke hersenorganoïden in de CAM te enten. Een ander interessant en nog onontgonnen aspect is de vorming van een chimere bloed-hersenbarrière (BBB) tussen de CAM en de organoïde astrocytaire interface. Eerder baanbrekend werk suggereerde de vermeende haalbaarheid van het genereren van een BBB in de CAM door astrocyten en astrocyt-geconditioneerd medium 21,22,23 te transplanteren. Volwassen astrocyten lijken echter niet in staat te zijn om deze 24,25 te bereiken. De door astrocyten geïnduceerde vorming van de BBB blijft dus discutabel, en het transplanteren van menselijke hersenorganoïden zou ons in staat stellen licht te werpen op deze controverse.
Dit video-artikel beschrijft een protocol voor een in ovo menselijke hersenorganoïdetransplantatie in CAM die groei, verbetering en vascularisatie bevordert, wat resulteert in organoïden die histologisch compatibele BBB-elementen bevatten. Hier presenteren we een protocol dat de overleving van het kippenembryo garandeert en rapporteren we over de toelaatbaarheid van de CAM om de groei van hersenorganoïden te ondersteunen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti-TUBB3 [Tuj1], mouse&#160;</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>801201</td>
			<td>1:1,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GFAP, rabbit</td>
			<td>GeneTex</td>
			<td>GTX108711</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rabbit AlexaFluor 488, goat.</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-21206</td>
			<td>1:1,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse AlexaFluor 594, goat</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>715-585-150</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fertilized White Leghorn chicken (Gallus gallus) eggs</td>
			<td>Granja Gibert (Cambrils, Spain)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1306</td>
			<td>1:10,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPX</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>100579</td>
			<td>xylene-based mounting medium&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentle Dissociation Solution</td>
			<td>CreativeBiolabs</td>
			<td>ITS-0622-YT187</td>
			<td>cell dissociation solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>356234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mowiol 4-88 mounting media</td>
			<td>Merk</td>
			<td>81381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paper towel, lab-grade</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z188956</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROCK inhibitor Y27632</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCM075</td>
			<td>10 nM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sharp-Point Surgical Scissors</td>
			<td>VWR</td>
			<td>470106-340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Plus Adhesion Microscope Slides</td>
			<td>Epredia</td>
			<td>J1800AMNZ</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

early unguided human brain organoid neurovascular niche modeling into the permissive chick embryo chorioallantoic membrane

Het enten van organoïden in gevasculariseerde weefsels in modeldieren, zoals het immunodeficiënte chorioallantoïsche membraan (CAM) van muizen of kuikenembryo's, is efficiënt gebleken voor neovascularisatiemodellering. De CAM is een rijk gevasculariseerd extraembryonaal membraan, dat een beperkte immunoreactiviteit vertoont, en wordt zo een uitstekend hostingmodel voor celtransplantaties van menselijke oorsprong.
Dit artikel beschrijft de strategie om menselijke hersenorganoïden die in meerdere rijpingsstadia zijn gedifferentieerd, in de CAM te enten. De cellulaire samenstelling van hersenorganoïden verandert met de tijd en weerspiegelt de mijlpalen van de ontwikkeling van het menselijk brein. We entten hersenorganoïden in relevante rijpingsstadia: neuro-epitheliale expansie (18 DIV), vroege neurogenese (60 DIV) en vroege gliogenese (180 DIV) in de CAM van embryonale dag (E)7 kippenembryo's. Geënte hersenorganoïden werden 5 dagen later geoogst en hun histologische kenmerken werden geanalyseerd.
Er werden geen histologische tekenen van neovascularisatie in de getransplanteerde organoïden of abnormale bloedvaten naast de transplantaties gedetecteerd. Bovendien werden opmerkelijke veranderingen waargenomen in de cellulaire samenstelling van de geënte organoïden, namelijk een toename van het aantal gliale fibrillaire zure eiwit-positief-reactieve astrocyten. De cytoarchitecturale veranderingen waren echter afhankelijk van het rijpingsstadium van de organoïde. Al met al suggereren deze resultaten dat hersenorganoïden kunnen groeien in de CAM, en ze vertonen verschillen in de cytoarchitectuur, afhankelijk van hun rijpingsstadium bij het enten.

Human brain organoids are an emerging technique that allows us to recapitulate the early development of the human brain in vitro1,2,3. Nevertheless, one of the major limitations of this model is the lack of vascularization, which plays indispensable roles not only in brain homeostasis but also in brain development4. In addition to the delivery of oxygen and nutrients, accumulating evidence suggests that the vascular system of the brain regulates neural differentiation, migration, and synaptogenesis during development5,6. Therefore, there is an urgent need to establish reliable models that can provide the missing vascular signaling and structure to brain organoids, enhancing the complexity of human brain organoid generation7.
Among the proposed methods for vascularization, two main streamlines can be considered: organoid engrafting into a living organism and purely in vitro technologies co-culturing endothelial cells and neural cells8,9,10,11,12. Intracerebral transplantation in mice is costly and time-consuming, making other technologies relevant for simpler models. The chick chorioallantoic membrane (CAM) assay has been used extensively to study angiogenesis13,14,15. In the last decade, several groups have successfully engrafted different types of organoids, including kidney16,17, cardiac18, and tumor organoids19,20, into CAMs. Nevertheless, little is known about the efficacy, toxicity/rejection, physiological effect, and methods to engraft human brain organoids into the CAM. Another interesting and yet unexplored aspect is the formation of a chimeric blood-brain barrier (BBB) between the CAM and the organoid astrocytic interface. Previous pioneering work suggested the putative feasibility of generating a BBB in the CAM by transplanting astrocytes and astrocyte-conditioned medium21,22,23. However, mature astrocytes seem to be unable to achieve this24,25. Thus, the astrocyte-induced formation of the BBB remains debatable, and transplanting human brain organoids would allow us to shed light on this controversy.
This video article describes a protocol for an in ovo human brain organoid transplant into CAM that promotes growth, improvement, and vascularization, resulting in organoids that encompass histologically compatible BBB elements. Here, we present a protocol ensuring the survival of the chicken embryo and report on the permissivity of the CAM to sustain brain organoid growth.

Auteur in de schijnwerpers: optimalisatie van de neurovasculaire ontwikkeling van menselijke hersenorganoïde in kuikenembryo

Vroege ongeleide menselijke hersenorganoïde neurovasculaire nichemodellering in het toegeeflijke kuikenembryo chorioallantoïsch membraan

The key questions I aim to address revolve around the mechanisms and processes involving human brain formation in the context of normal development, as well as various pathological states. This includes investigating the factors influencing brain development, such as genetics, environmental, and epigenetic influences. Obtaining brain organoids that closely resemble the adult human brain, including vascularization, blood brain barrier functionality, the presence of microglia and cellular diversity is challenging.Overcoming this is essential for the development of more physiologically relevant brain organoid models that can efficiently mimic the adult human brain to enhance clinical applications. Through our research, we provide optimal conditions for transplanting human brain organoids into chorioallantoic membrane to ensure good development of the microglia. This clinical improvement is central for forthcoming efforts in the field to generate synthetic vascularized environment for brain organoids.The advantage of our protocol compared to other techniques lies in its high effectiveness and cost efficiency. We have achieved a high success rate in transplanting viable organoids using fertile eggs from farm chickens. In the future, our laboratory will focus on conducting functional assessments of neo vasculature associated with organoids, exploring potential use of this vascular design model for application of intravenous nanomedicine.Additionally, we aim to evaluate the biodistribution of these nanomedicines in the human central nervous system.

Het rijpingsschema van het embryo voor de transplantatie selecteren Het experiment begint bij D0 wanneer bevruchte eieren worden uitgebroed bij 38 °C en een relatieve vochtigheid van 60%. Het chorioallantoïsche membraan (CAM) is een sterk gevasculariseerd extraembryonaal membraan dat zich ontwikkelt na het uitbroeden van eieren. Het wordt gevormd door de fusie van de allantois en chorion. Bij D1, na 24 uur incubatie, wordt de luchtkamer doorboord om te voorkomen dat de CAM zich hecht aan het binnens...

Watch this Scientific Journal Video about Author Spotlight: Optimizing the Neurovascular Development of Human Brain Organoid in Chick Embryo at JoVE.com

Hier presenteren we een protocol om menselijke hersenorganoïden in meerdere rijpingsstadia te enten in het chorioallantoïsche membraan (CAM) van het kuiken. Hersenorganoïden werden gekweekt volgens ongeleide gestandaardiseerde protocollen.

Engrafting organoids into vascularized tissues in model animals, such as the immunodeficient mouse or chick embryo chorioallantoic membrane (CAM), has ...

De belangrijkste vragen die ik wil beantwoorden, draaien om de mechanismen en processen die te maken hebben met de vorming van menselijke hersenen in de context van normale ontwikkeling, evenals verschillende pathologische toestanden. Dit omvat het onderzoeken van de factoren die de ontwikkeling van de hersenen beïnvloeden, zoals genetica, omgevings- en epigenetische invloeden. Het verkrijgen van hersenorganoïden die sterk lijken op het volwassen menselijke brein, inclusief vascularisatie, bloed-hersenbarrièrefunctionaliteit, de aanwezigheid van microglia en cellulaire diversiteit is een uitdaging.Het overwinnen hiervan is essentieel voor de ontwikkeling van meer fysiologisch relevante hersenorganoïdemodellen die het volwassen menselijke brein efficiënt kunnen nabootsen om klinische toepassingen te verbeteren. Door ons onderzoek bieden we optimale omstandigheden voor het transplanteren van menselijke hersenorganoïden in chorioallantoïsch membraan om een goede ontwikkeling van de microglia te garanderen. Deze klinische verbetering staat centraal voor toekomstige inspanningen in het veld om een synthetische gevasculariseerde omgeving voor hersenorganoïden te genereren.Het voordeel van ons protocol ten opzichte van andere technieken ligt in de hoge effectiviteit en kostenefficiëntie. We hebben een hoog slagingspercentage behaald bij het transplanteren van levensvatbare organoïden met behulp van vruchtbare eieren van boerderijkippen. In de toekomst zal ons laboratorium zich richten op het uitvoeren van functionele beoordelingen van neo-vasculatuur geassocieerd met organoïden, waarbij het mogelijke gebruik van dit vasculaire ontwerpmodel voor toepassing van intraveneuze nanogeneeskunde wordt onderzocht.Daarnaast willen we de biodistributie van deze nanogeneesmiddelen in het centrale zenuwstelsel van de mens evalueren.

early-unguided-human-brain-organoid-neurovascular-niche-modeling-into

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Early Unguided Human Brain Organoid Neurovascular Niche Modeling into the Permissive Chick Embryo Chorioallantoic Membrane

Engrafting organoids into vascularized tissues in model animals, such as the immunodeficient mouse or chick embryo chorioallantoic membrane (CAM), has proven efficient for neovascularization modeling. The CAM is a richly vascularized extraembryonic membrane, which shows limited immunoreactivity, thus becoming an excellent hosting model for human origin cell transplants.
This paper describes the strategy to engraft human brain organoids differentiated at multiple maturation stages into the CAM. The cellular composition of brain organoids changes with time, reflecting the milestones of human brain development. We grafted brain organoids at relevant maturation stages: neuroepithelial expansion (18 DIV), early neurogenesis (60 DIV), and early gliogenesis (180 DIV) into the CAM of embryonic day (E)7 chicken embryos. Engrafted brain organoids were harvested 5 days later and their histological features were analyzed.
No histological signs of neovascularization in the grafted organoids or abnormal blood vessels adjacent to the graftings were detected. Moreover, remarkable changes were observed in the cellular composition of the grafted organoids, namely, an increase in the number of glial fibrillary acidic protein-positive-reactive astrocytes. However, the cytoarchitectural changes were dependent on the organoid maturation stage. Altogether, these results suggest that brain organoids can grow in the CAM, and they show differences in the cytoarchitecture depending on their maturation stage at grafting.

Here, we present a protocol to engraft human brain organoids at multiple maturation stages into the chick chorioallantoic membrane (CAM). Brain organoids were grown following unguided standardized protocols.