Name: Pleins feux sur l’auteur : Optimisation du développement neurovasculaire d’un organoïde cérébral humain dans un embryon de poussin
Uploaded: 2024-02-16T13:00:00
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Nous remercions le Dr Alcántara et le Dr Ortega de l’UB et le reste des membres du laboratoire du Dr Acosta pour ces discussions perspicaces. S.A. est professeur adjoint à la Generalitat de Catalunya de l’Université de Barcelone.

Les embryons de poulet Leghorn blanc (Gallus gallus) ont été traités en suivant le Guide pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire de l’Institut des ressources pour les animaux de laboratoire, Commission des sciences de la vie, Conseil national de la recherche, États-Unis, et les expériences ont été approuvées par le Conseil pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire de l’Université de Barcelone.
1. Préparation non guidée d’organ...

Greffe d’organoïdes cérébraux humains dans la membrane chorioallantoïdienne de l’embryon de poussin

<ol>
	<li>Camp, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+cerebral+organoids+recapitulate+gene+expression+programs+of+fetal+neocortex+development.">Human cerebral organoids recapitulate gene expression programs of fetal neocortex development.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (51), 15672-15677 (2015).</li><li>Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organogenesis+in+a+dish:+Modeling+development+and+disease+using+organoid+technologies.">Organogenesis in a dish: Modeling development and disease using organoid technologies.</a> Science. 345 (6194), 1247125 (2014).</li><li>Yang, Q., Hong, Y., Zhao, T., Song, H., Ming, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+makes+organoids+good+models+of+human+neurogenesis.">What makes organoids good models of human neurogenesis.</a> Front Neurosci. 16, 872794 (2022).</li><li>Sun, X. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+vascularized+brain+organoids+to+study+neurovascular+interactions.">Generation of vascularized brain organoids to study neurovascular interactions.</a> Elife. 11, e76707 (2022).</li><li>Paredes, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligodendrocyte+precursor+cell+specification+is+regulated+by+bidirectional+neural+progenitor-endothelial+cell+crosstalk.">Oligodendrocyte precursor cell specification is regulated by bidirectional neural progenitor-endothelial cell crosstalk.</a> Nat Neurosci. 24 (4), 478-488 (2021).</li><li>Matsui, T. K., Tsuru, Y., Hasegawa, K., Kuwako, K. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascularization+of+human+brain+organoids.">Vascularization of human brain organoids.</a> Stem Cells. 39 (8), 1017-1024 (2021).</li><li>Apostolou, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+and+challenges+in+stem+cell+biology.">Progress and challenges in stem cell biology.</a> Nat Cell Biol. 25 (2), 203-206 (2023).</li><li>Pham, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+human+vascularized+brain+organoids.">Generation of human vascularized brain organoids.</a> Neuroreport. 29 (7), 588-593 (2018).</li><li>Cakir, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+of+human+brain+organoids+with+a+functional+vascular-like+system.">Engineering of human brain organoids with a functional vascular-like system.</a> Nat Methods. 16 (11), 1169-1175 (2019).</li><li>Shi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascularized+human+cortical+organoids+(vorganoids)+model+cortical+development+in+vivo.">Vascularized human cortical organoids (vorganoids) model cortical development in vivo.</a> PLoS Biol. 18 (5), e3000705 (2020).</li><li>Mansour, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vivo+model+of+functional+and+vascularized+human+brain+organoids.">An in vivo model of functional and vascularized human brain organoids.</a> Nat Biotechnol. 36 (5), 432-441 (2018).</li><li>Revah, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maturation+and+circuit+integration+of+transplanted+human+cortical+organoids.">Maturation and circuit integration of transplanted human cortical organoids.</a> Nature. 610 (7931), 319-326 (2022).</li><li>Ribatti, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chicken+chorioallantoic+membrane+angiogenesis+model.">Chicken chorioallantoic membrane angiogenesis model.</a> Methods Mol Biol. 843, 47-57 (2012).</li><li>Nowak-Sliwinska, P., Segura, T., Iruela-Arispe, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chicken+chorioallantoic+membrane+model+in+biology,+medicine+and+bioengineering.">The chicken chorioallantoic membrane model in biology, medicine and bioengineering.</a> Angiogenesis. 17 (4), 779-804 (2014).</li><li>Kennedy, D. C., Coen, B., Wheatley, A. M., Mccullagh, K. J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microvascular+experimentation+in+the+chick+chorioallantoic+membrane+as+a+model+for+screening+angiogenic+agents+including+from+gene-modified+cells.">Microvascular experimentation in the chick chorioallantoic membrane as a model for screening angiogenic agents including from gene-modified cells.</a> Int J Mol Sci. 23 (1), 452 (2021).</li><li>Garreta, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fine+tuning+the+extracellular+environment+accelerates+the+derivation+of+kidney+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells.">Fine tuning the extracellular environment accelerates the derivation of kidney organoids from human pluripotent stem cells.</a> Nat Mater. 18 (4), 397-405 (2019).</li><li>Kaisto, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+renal+organoid+and+organotypic+culture+for+vascularization,+extended+development,+and+improved+microscopy+imaging.">Optimization of renal organoid and organotypic culture for vascularization, extended development, and improved microscopy imaging.</a> J Vis Exp. (157), e60995 (2020).</li><li>Varzideh, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+cardiomyocytes+undergo+enhanced+maturation+in+embryonic+stem+cell-derived+organoid+transplants.">Human cardiomyocytes undergo enhanced maturation in embryonic stem cell-derived organoid transplants.</a> Biomaterials. 192, 537-550 (2019).</li><li>Komatsu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cam+model+for+cic-dux4+sarcoma+and+its+potential+use+for+precision+medicine.">The cam model for cic-dux4 sarcoma and its potential use for precision medicine.</a> Cells. 10 (10), 2613 (2021).</li><li>Worsdorfer, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+complex+human+organoid+models+including+vascular+networks+by+incorporation+of+mesodermal+progenitor+cells.">Generation of complex human organoid models including vascular networks by incorporation of mesodermal progenitor cells.</a> Sci Rep. 9 (1), 15663 (2019).</li><li>Janzer, R. C., Jaff, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytes+induce+blood-brain+barrier+properties+in+endothelial+cells.">Astrocytes induce blood-brain barrier properties in endothelial cells.</a> Nature. 325 (6101), 253-257 (1987).</li><li>Janzer, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+blood-brain+barrier:+Cellular+basis.">The blood-brain barrier: Cellular basis.</a> J Inherit Metab Dis. 16 (4), 639-647 (1993).</li><li>Lobrinus, J. A., Juillerat-Jeanneret, L., Darekar, P., Schlosshauer, B., Janzer, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+the+blood-brain+barrier+specific+ht7+and+neurothelin+epitopes+in+endothelial+cells+of+the+chick+chorioallantoic+vessels+by+a+soluble+factor+derived+from+astrocytes.">Induction of the blood-brain barrier specific ht7 and neurothelin epitopes in endothelial cells of the chick chorioallantoic vessels by a soluble factor derived from astrocytes.</a> Brain Res Dev Brain Res. 70 (2), 207-211 (1992).</li><li>Holash, J. A., Stewart, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chorioallantoic+membrane+(cam)+vessels+do+not+respond+to+blood-brain+barrier+(bbb)+induction.">Chorioallantoic membrane (cam) vessels do not respond to blood-brain barrier (bbb) induction.</a> Adv Exp Med Biol. 331, 223-228 (1993).</li><li>Holash, J. A., Noden, D. M., Stewart, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Re-evaluating+the+role+of+astrocytes+in+blood-brain+barrier+induction.">Re-evaluating the role of astrocytes in blood-brain barrier induction.</a> Dev Dyn. 197 (1), 14-25 (1993).</li><li>Giandomenico, S. L., Sutcliffe, M., Lancaster, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+and+long-term+culture+of+advanced+cerebral+organoids+for+studying+later+stages+of+neural+development.">Generation and long-term culture of advanced cerebral organoids for studying later stages of neural development.</a> Nat Protoc. 16 (2), 579-602 (2021).</li><li>Wagner-Amos, K., Seymour, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+local+shell+conductance+on+the+vascularisation+of+the+chicken+chorioallantoic+membrane.">Effect of local shell conductance on the vascularisation of the chicken chorioallantoic membrane.</a> Respir Physiol Neurobiol. 134 (2), 155-167 (2003).</li><li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo.+1951.">A series of normal stages in the development of the chick embryo. 1951.</a> Dev Dyn. 195 (4), 231-272 (1992).</li><li>Paredes, I., Himmels, P., Ruiz De Almodovar, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurovascular+communication+during+cns+development.">Neurovascular communication during cns development.</a> Dev Cell. 45 (1), 10-32 (2018).</li><li>Hogan, K. A., Ambler, C. A., Chapman, D. L., Bautch, V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neural+tube+patterns+vessels+developmentally+using+the+vegf+signaling+pathway.">The neural tube patterns vessels developmentally using the vegf signaling pathway.</a> Development. 131 (7), 1503-1513 (2004).</li><li>Bozoyan, L., Khlghatyan, J., Saghatelyan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytes+control+the+development+of+the+migration-promoting+vasculature+scaffold+in+the+postnatal+brain+via+vegf+signaling.">Astrocytes control the development of the migration-promoting vasculature scaffold in the postnatal brain via vegf signaling.</a> J Neurosci. 32 (5), 1687-1704 (2012).</li><li>Himmels, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motor+neurons+control+blood+vessel+patterning+in+the+developing+spinal+cord.">Motor neurons control blood vessel patterning in the developing spinal cord.</a> Nat Commun. 8, 14583 (2017).</li><li>Di Lullo, E., Kriegstein, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+brain+organoids+to+investigate+neural+development+and+disease.">The use of brain organoids to investigate neural development and disease.</a> Nat Rev Neurosci. 18 (10), 573-584 (2017).</li></ol>

Dans cette étude, nous décrivons un protocole détaillé avec de nombreuses étapes clés qui assurent une croissance et un développement favorables des organoïdes cérébraux humains lors de la greffe sans perturber la survie des embryons de poulet. Nous avons recommandé l’utilisation d’aiguilles stériles pour percer la chambre à air de l’œuf après 24 h d’incubation (jour 1). De plus, nous avons également essayé de faire la ponction au jour 4 (après avoir vérifié la coquille de l’œuf à la lumi?...

Les organoïdes cérébraux humains sont une technique émergente qui nous permet de récapituler le développement précoce du cerveau humain in vitro 1,2,3. Néanmoins, l’une des limites majeures de ce modèle est le manque de vascularisation, qui joue un rôle indispensable non seulement dans l’homéostasie cérébrale mais aussi dans le développement du cerveau4. En plus de l’apport d’oxygène et de nutriments, de plus en plus de preuves suggèrent que le système vasculaire du cerveau régule la différenciation, la migration et la synaptogenèse neuronales au cours du développement 5,6. Par conséquent, il est urgent d’établir des modèles fiables capables de fournir la signalisation vasculaire et la structure manquantes aux organoïdes cérébraux, augmentant ainsi la complexité de la génération d’organoïdes cérébraux humains7.
Parmi les méthodes de vascularisation proposées, deux axes principaux peuvent être envisagés : la greffe d’organoïdes dans un organisme vivant et les technologies purement in vitro co-cultivant des cellules endothéliales et des cellules neurales 8,9,10,11,12. La transplantation intracérébrale chez la souris est coûteuse et prend du temps, ce qui rend d’autres technologies pertinentes pour des modèles plus simples. Le test de la membrane chorioallantoïdienne (CAM) du poulet a été largement utilisé pour étudier l’angiogenèse 13,14,15. Au cours de la dernière décennie, plusieurs groupes ont réussi à greffer différents types d’organoïdes, notamment des organoïdes rénaux16,17, cardiaques18 et tumoraux19,20, dans des CAM. Néanmoins, on sait peu de choses sur l’efficacité, la toxicité/rejet, l’effet physiologique et les méthodes de greffe d’organoïdes cérébraux humains dans la MCA. Un autre aspect intéressant et encore inexploré est la formation d’une barrière hémato-encéphalique chimérique (BHE) entre la CAM et l’interface astrocytaire organoïde. Des travaux pionniers antérieurs ont suggéré la faisabilité présumée de générer une BHE dans le CAM en transplantant des astrocytes et un milieu conditionné par les astrocytes 21,22,23. Cependant, les astrocytes matures semblent incapables d’atteindre ce24,25. Ainsi, la formation de la BHE induite par les astrocytes reste discutable, et la transplantation d’organoïdes cérébraux humains permettrait de faire la lumière sur cette controverse.
Cet article vidéo décrit un protocole de greffe d’organoïdes cérébraux humains in ovo dans la MCA qui favorise la croissance, l’amélioration et la vascularisation, ce qui permet d’obtenir des organoïdes qui englobent des éléments de la BHE histologiquement compatibles. Ici, nous présentons un protocole assurant la survie de l’embryon de poulet et rapportons la permissivité de la CAM pour soutenir la croissance des organoïdes cérébraux.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti-TUBB3 [Tuj1], mouse&#160;</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>801201</td>
			<td>1:1,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GFAP, rabbit</td>
			<td>GeneTex</td>
			<td>GTX108711</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rabbit AlexaFluor 488, goat.</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-21206</td>
			<td>1:1,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse AlexaFluor 594, goat</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>715-585-150</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fertilized White Leghorn chicken (Gallus gallus) eggs</td>
			<td>Granja Gibert (Cambrils, Spain)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1306</td>
			<td>1:10,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPX</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>100579</td>
			<td>xylene-based mounting medium&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentle Dissociation Solution</td>
			<td>CreativeBiolabs</td>
			<td>ITS-0622-YT187</td>
			<td>cell dissociation solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>356234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mowiol 4-88 mounting media</td>
			<td>Merk</td>
			<td>81381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paper towel, lab-grade</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z188956</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROCK inhibitor Y27632</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCM075</td>
			<td>10 nM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sharp-Point Surgical Scissors</td>
			<td>VWR</td>
			<td>470106-340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Plus Adhesion Microscope Slides</td>
			<td>Epredia</td>
			<td>J1800AMNZ</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

early unguided human brain organoid neurovascular niche modeling into the permissive chick embryo chorioallantoic membrane

La greffe d’organoïdes dans des tissus vascularisés chez des animaux modèles, tels que la membrane chorioallantoïde (CAM) immunodéficiente de souris ou d’embryon de poussin, s’est avérée efficace pour la modélisation de la néovascularisation. La CAM est une membrane extraembryonnaire richement vascularisée, qui présente une immunoréactivité limitée, devenant ainsi un excellent modèle d’accueil pour les greffes de cellules d’origine humaine.
Cet article décrit la stratégie pour greffer des organoïdes cérébraux humains différenciés à plusieurs stades de maturation dans la CAM. La composition cellulaire des organoïdes cérébraux change avec le temps, reflétant les étapes importantes du développement du cerveau humain. Nous avons greffé des organoïdes cérébraux aux stades de maturation pertinents : expansion neuroépithéliale (18 DIV), neurogenèse précoce (60 DIV) et gliogenèse précoce (180 DIV) dans la CAM d’embryons embryonnaires de poulet jour (E)7. Des organoïdes cérébraux greffés ont été prélevés 5 jours plus tard et leurs caractéristiques histologiques ont été analysées.
Aucun signe histologique de néovascularisation dans les organoïdes greffés ou vaisseaux sanguins anormaux adjacents aux greffes n’a été détecté. De plus, des changements remarquables ont été observés dans la composition cellulaire des organoïdes greffés, à savoir une augmentation du nombre d’astrocytes réactifs à l’acide fibrillaire glial. Cependant, les changements cytoarchitecturaux dépendaient du stade de maturation des organoïdes. Dans l’ensemble, ces résultats suggèrent que les organoïdes cérébraux peuvent se développer dans la CAM, et ils montrent des différences dans la cytoarchitecture en fonction de leur stade de maturation à la greffe.

Human brain organoids are an emerging technique that allows us to recapitulate the early development of the human brain in vitro1,2,3. Nevertheless, one of the major limitations of this model is the lack of vascularization, which plays indispensable roles not only in brain homeostasis but also in brain development4. In addition to the delivery of oxygen and nutrients, accumulating evidence suggests that the vascular system of the brain regulates neural differentiation, migration, and synaptogenesis during development5,6. Therefore, there is an urgent need to establish reliable models that can provide the missing vascular signaling and structure to brain organoids, enhancing the complexity of human brain organoid generation7.
Among the proposed methods for vascularization, two main streamlines can be considered: organoid engrafting into a living organism and purely in vitro technologies co-culturing endothelial cells and neural cells8,9,10,11,12. Intracerebral transplantation in mice is costly and time-consuming, making other technologies relevant for simpler models. The chick chorioallantoic membrane (CAM) assay has been used extensively to study angiogenesis13,14,15. In the last decade, several groups have successfully engrafted different types of organoids, including kidney16,17, cardiac18, and tumor organoids19,20, into CAMs. Nevertheless, little is known about the efficacy, toxicity/rejection, physiological effect, and methods to engraft human brain organoids into the CAM. Another interesting and yet unexplored aspect is the formation of a chimeric blood-brain barrier (BBB) between the CAM and the organoid astrocytic interface. Previous pioneering work suggested the putative feasibility of generating a BBB in the CAM by transplanting astrocytes and astrocyte-conditioned medium21,22,23. However, mature astrocytes seem to be unable to achieve this24,25. Thus, the astrocyte-induced formation of the BBB remains debatable, and transplanting human brain organoids would allow us to shed light on this controversy.
This video article describes a protocol for an in ovo human brain organoid transplant into CAM that promotes growth, improvement, and vascularization, resulting in organoids that encompass histologically compatible BBB elements. Here, we present a protocol ensuring the survival of the chicken embryo and report on the permissivity of the CAM to sustain brain organoid growth.

Pleins feux sur l’auteur : Optimisation du développement neurovasculaire d’un organoïde cérébral humain dans un embryon de poussin

Modélisation précoce non guidée de la niche neurovasculaire organoïde du cerveau humain dans la membrane chorioallantoïde permissive de l’embryon de poussin

The key questions I aim to address revolve around the mechanisms and processes involving human brain formation in the context of normal development, as well as various pathological states. This includes investigating the factors influencing brain development, such as genetics, environmental, and epigenetic influences. Obtaining brain organoids that closely resemble the adult human brain, including vascularization, blood brain barrier functionality, the presence of microglia and cellular diversity is challenging.Overcoming this is essential for the development of more physiologically relevant brain organoid models that can efficiently mimic the adult human brain to enhance clinical applications. Through our research, we provide optimal conditions for transplanting human brain organoids into chorioallantoic membrane to ensure good development of the microglia. This clinical improvement is central for forthcoming efforts in the field to generate synthetic vascularized environment for brain organoids.The advantage of our protocol compared to other techniques lies in its high effectiveness and cost efficiency. We have achieved a high success rate in transplanting viable organoids using fertile eggs from farm chickens. In the future, our laboratory will focus on conducting functional assessments of neo vasculature associated with organoids, exploring potential use of this vascular design model for application of intravenous nanomedicine.Additionally, we aim to evaluate the biodistribution of these nanomedicines in the human central nervous system.

Sélection du calendrier de maturation embryonnaire pour la greffe L’expérience commence à J0 lorsque les œufs fécondés sont incubés à 38 °C et 60 % d’humidité relative. La membrane chorioallantoïdienne (CAM) est une membrane extraembryonnaire hautement vascularisée qui se développe après l’incubation de l’œuf. Il est formé par la fusion de l’allantoïde et du chorion. À J1, après 24 h d’incubation, la chambre à air est perforée pour empêcher le CAM de se fixer à la me...

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Ici, nous présentons un protocole pour greffer des organoïdes cérébraux humains à plusieurs stades de maturation dans la membrane chorioallantoïdienne (CAM) du poulet. Les organoïdes cérébraux ont été cultivés selon des protocoles standardisés non guidés.

Engrafting organoids into vascularized tissues in model animals, such as the immunodeficient mouse or chick embryo chorioallantoic membrane (CAM), has ...

Les questions clés que je cherche à aborder tournent autour des mécanismes et des processus impliquant la formation du cerveau humain dans le contexte du développement normal, ainsi que de divers états pathologiques. Cela comprend l’étude des facteurs influençant le développement du cerveau, tels que les influences génétiques, environnementales et épigénétiques. Il est difficile d’obtenir des organoïdes cérébraux qui ressemblent étroitement au cerveau humain adulte, y compris la vascularisation, la fonctionnalité de la barrière hémato-encéphalique, la présence de microglie et la diversité cellulaire.Surmonter ce problème est essentiel pour le développement de modèles d’organoïdes cérébraux plus pertinents sur le plan physiologique qui peuvent imiter efficacement le cerveau humain adulte afin d’améliorer les applications cliniques. Grâce à nos recherches, nous fournissons des conditions optimales pour transplanter des organoïdes cérébraux humains dans la membrane chorioallantoïdienne afin d’assurer un bon développement de la microglie. Cette amélioration clinique est essentielle pour les efforts à venir dans le domaine visant à générer un environnement vascularisé synthétique pour les organoïdes cérébraux.L’avantage de notre protocole par rapport à d’autres techniques réside dans sa grande efficacité et sa rentabilité. Nous avons obtenu un taux de réussite élevé dans la transplantation d’organoïdes viables à partir d’œufs fertiles de poulets d’élevage. À l’avenir, notre laboratoire se concentrera sur la réalisation d’évaluations fonctionnelles de la néovascularisation associée aux organoïdes, en explorant l’utilisation potentielle de ce modèle de conception vasculaire pour l’application de la nanomédecine intraveineuse.De plus, nous visons à évaluer la biodistribution de ces nanomédicaments dans le système nerveux central humain.

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Early Unguided Human Brain Organoid Neurovascular Niche Modeling into the Permissive Chick Embryo Chorioallantoic Membrane

Engrafting organoids into vascularized tissues in model animals, such as the immunodeficient mouse or chick embryo chorioallantoic membrane (CAM), has proven efficient for neovascularization modeling. The CAM is a richly vascularized extraembryonic membrane, which shows limited immunoreactivity, thus becoming an excellent hosting model for human origin cell transplants.
This paper describes the strategy to engraft human brain organoids differentiated at multiple maturation stages into the CAM. The cellular composition of brain organoids changes with time, reflecting the milestones of human brain development. We grafted brain organoids at relevant maturation stages: neuroepithelial expansion (18 DIV), early neurogenesis (60 DIV), and early gliogenesis (180 DIV) into the CAM of embryonic day (E)7 chicken embryos. Engrafted brain organoids were harvested 5 days later and their histological features were analyzed.
No histological signs of neovascularization in the grafted organoids or abnormal blood vessels adjacent to the graftings were detected. Moreover, remarkable changes were observed in the cellular composition of the grafted organoids, namely, an increase in the number of glial fibrillary acidic protein-positive-reactive astrocytes. However, the cytoarchitectural changes were dependent on the organoid maturation stage. Altogether, these results suggest that brain organoids can grow in the CAM, and they show differences in the cytoarchitecture depending on their maturation stage at grafting.

Here, we present a protocol to engraft human brain organoids at multiple maturation stages into the chick chorioallantoic membrane (CAM). Brain organoids were grown following unguided standardized protocols.