Name: Autor im Rampenlicht: Optimierung der neurovaskulären Entwicklung von menschlichen Gehirnorganoiden im Hühnerembryo
Uploaded: 2024-02-16T13:00:00
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Wir danken Dr. Alcántara und Dr. Ortega von der UB und den übrigen Mitgliedern in Dr. Acostas Labor für die aufschlussreichen Diskussionen. S.A. ist Serra-Hunter-Assistenzprofessor an der Generalitat de Catalunya an der Universitat de Barcelona.

Die Embryonen des Weißen Leghornhuhns (Gallus gallus) wurden gemäß dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren des Institute of Laboratory Animals Resources, Commission of Life Sciences, National Research Council, USA, behandelt, und die Experimente wurden vom Council for Care and Use of Experimental Animals der Universität Barcelona genehmigt.
1. Ungesteuerte Präparation von Gehirnorganoiden
<ol><li>Halten Sie H9 humane embryonale Stammzellen ...

Transplantation von Organoiden des menschlichen Gehirns in die chorioallantoische Membran des Hühnerembryos

<ol>
	<li>Camp, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+cerebral+organoids+recapitulate+gene+expression+programs+of+fetal+neocortex+development.">Human cerebral organoids recapitulate gene expression programs of fetal neocortex development.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (51), 15672-15677 (2015).</li><li>Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organogenesis+in+a+dish:+Modeling+development+and+disease+using+organoid+technologies.">Organogenesis in a dish: Modeling development and disease using organoid technologies.</a> Science. 345 (6194), 1247125 (2014).</li><li>Yang, Q., Hong, Y., Zhao, T., Song, H., Ming, G. 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Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+vascularized+brain+organoids+to+study+neurovascular+interactions.">Generation of vascularized brain organoids to study neurovascular interactions.</a> Elife. 11, e76707 (2022).</li><li>Paredes, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligodendrocyte+precursor+cell+specification+is+regulated+by+bidirectional+neural+progenitor-endothelial+cell+crosstalk.">Oligodendrocyte precursor cell specification is regulated by bidirectional neural progenitor-endothelial cell crosstalk.</a> Nat Neurosci. 24 (4), 478-488 (2021).</li><li>Matsui, T. K., Tsuru, Y., Hasegawa, K., Kuwako, K. 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M., Stewart, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Re-evaluating+the+role+of+astrocytes+in+blood-brain+barrier+induction.">Re-evaluating the role of astrocytes in blood-brain barrier induction.</a> Dev Dyn. 197 (1), 14-25 (1993).</li><li>Giandomenico, S. L., Sutcliffe, M., Lancaster, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+and+long-term+culture+of+advanced+cerebral+organoids+for+studying+later+stages+of+neural+development.">Generation and long-term culture of advanced cerebral organoids for studying later stages of neural development.</a> Nat Protoc. 16 (2), 579-602 (2021).</li><li>Wagner-Amos, K., Seymour, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+local+shell+conductance+on+the+vascularisation+of+the+chicken+chorioallantoic+membrane.">Effect of local shell conductance on the vascularisation of the chicken chorioallantoic membrane.</a> Respir Physiol Neurobiol. 134 (2), 155-167 (2003).</li><li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo.+1951.">A series of normal stages in the development of the chick embryo. 1951.</a> Dev Dyn. 195 (4), 231-272 (1992).</li><li>Paredes, I., Himmels, P., Ruiz De Almodovar, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurovascular+communication+during+cns+development.">Neurovascular communication during cns development.</a> Dev Cell. 45 (1), 10-32 (2018).</li><li>Hogan, K. A., Ambler, C. A., Chapman, D. L., Bautch, V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neural+tube+patterns+vessels+developmentally+using+the+vegf+signaling+pathway.">The neural tube patterns vessels developmentally using the vegf signaling pathway.</a> Development. 131 (7), 1503-1513 (2004).</li><li>Bozoyan, L., Khlghatyan, J., Saghatelyan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytes+control+the+development+of+the+migration-promoting+vasculature+scaffold+in+the+postnatal+brain+via+vegf+signaling.">Astrocytes control the development of the migration-promoting vasculature scaffold in the postnatal brain via vegf signaling.</a> J Neurosci. 32 (5), 1687-1704 (2012).</li><li>Himmels, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motor+neurons+control+blood+vessel+patterning+in+the+developing+spinal+cord.">Motor neurons control blood vessel patterning in the developing spinal cord.</a> Nat Commun. 8, 14583 (2017).</li><li>Di Lullo, E., Kriegstein, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+brain+organoids+to+investigate+neural+development+and+disease.">The use of brain organoids to investigate neural development and disease.</a> Nat Rev Neurosci. 18 (10), 573-584 (2017).</li></ol>

In dieser Studie beschreiben wir ein detailliertes Protokoll mit zahlreichen Schlüsselschritten, die ein günstiges Wachstum und eine günstige Entwicklung menschlicher Gehirnorganoide nach der Transplantation ermöglichen, ohne das Überleben der Hühnerembryonen zu beeinträchtigen. Wir empfahlen die Verwendung steriler Nadeln, um die Luftkammer des Eies nach 24 Stunden Inkubation (Tag 1) zu punktieren. Zusätzlich versuchten wir auch, die Punktion an Tag 4 durchzuführen (nachdem wir die Eierschale mit Licht überpr?...

Organoide des menschlichen Gehirns sind eine aufstrebende Technik, die es uns ermöglicht, die frühe Entwicklung des menschlichen Gehirns in vitro zu rekapitulieren 1,2,3. Eine der größten Einschränkungen dieses Modells ist jedoch die fehlende Vaskularisierung, die nicht nur bei der Homöostase des Gehirns, sondern auch bei der Entwicklung des Gehirns eine unverzichtbare Rolle spielt4. Zusätzlich zur Zufuhr von Sauerstoff und Nährstoffen gibt es immer mehr Hinweise darauf, dass das Gefäßsystem des Gehirns die neuronale Differenzierung, Migration und Synaptogenese während der Entwicklung reguliert 5,6. Daher ist es dringend erforderlich, zuverlässige Modelle zu etablieren, die die fehlende vaskuläre Signalübertragung und Struktur für Gehirnorganoide liefern können, was die Komplexität der Generation menschlicher Gehirnorganoideerhöht 7.
Unter den vorgeschlagenen Methoden zur Vaskularisierung können zwei Hauptstromlinien in Betracht gezogen werden: die Organoid-Transplantation in einen lebenden Organismus und reine In-vitro-Technologien zur Kokultivierung von Endothelzellen und Nervenzellen 8,9,10,11,12. Die intrazerebrale Transplantation bei Mäusen ist kostspielig und zeitaufwändig, so dass andere Technologien für einfachere Modelle relevant sind. Der Chick Chorioallantoic Membran (CAM)-Assay wurde ausgiebig zur Untersuchung der Angiogeneseverwendet 13,14,15. In den letzten zehn Jahren haben mehrere Gruppen erfolgreich verschiedene Arten von Organoiden, darunter Nieren16,17, Herz18 und Tumororganoide19,20, in CAMs transplantiert. Dennoch ist wenig über die Wirksamkeit, Toxizität/Abstoßung, physiologische Wirkung und Methoden zur Transplantation menschlicher Gehirnorganoide in die CAM bekannt. Ein weiterer interessanter und noch unerforschter Aspekt ist die Bildung einer chimären Blut-Hirn-Schranke (BHS) zwischen der CAM und der organoiden astrozytischen Grenzfläche. Frühere Pionierarbeiten deuteten auf die mutmaßliche Machbarkeit der Erzeugung einer BHS in der CAM durch Transplantation von Astrozyten und Astrozyten-konditioniertem Mediumhin 21,22,23. Reife Astrozyten scheinen jedoch nicht in der Lage zu sein, dies zu erreichen24,25. Daher bleibt die Astrozyten-induzierte Bildung der BHS umstritten, und die Transplantation menschlicher Gehirnorganoide würde es uns ermöglichen, Licht in diese Kontroverse zu bringen.
Dieser Videoartikel beschreibt ein Protokoll für eine In-Ovo-Organoidtransplantation des menschlichen Gehirns in CAM, die Wachstum, Verbesserung und Vaskularisierung fördert und zu Organoiden führt, die histologisch kompatible BHS-Elemente umfassen. Hier stellen wir ein Protokoll vor, das das Überleben des Hühnerembryos sicherstellt, und berichten über die Permissivität der CAM zur Aufrechterhaltung des Wachstums von Gehirnorganoiden.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti-TUBB3 [Tuj1], mouse&#160;</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>801201</td>
			<td>1:1,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GFAP, rabbit</td>
			<td>GeneTex</td>
			<td>GTX108711</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rabbit AlexaFluor 488, goat.</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-21206</td>
			<td>1:1,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse AlexaFluor 594, goat</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>715-585-150</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fertilized White Leghorn chicken (Gallus gallus) eggs</td>
			<td>Granja Gibert (Cambrils, Spain)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1306</td>
			<td>1:10,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPX</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>100579</td>
			<td>xylene-based mounting medium&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentle Dissociation Solution</td>
			<td>CreativeBiolabs</td>
			<td>ITS-0622-YT187</td>
			<td>cell dissociation solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>356234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mowiol 4-88 mounting media</td>
			<td>Merk</td>
			<td>81381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paper towel, lab-grade</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z188956</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROCK inhibitor Y27632</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCM075</td>
			<td>10 nM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sharp-Point Surgical Scissors</td>
			<td>VWR</td>
			<td>470106-340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Plus Adhesion Microscope Slides</td>
			<td>Epredia</td>
			<td>J1800AMNZ</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

early unguided human brain organoid neurovascular niche modeling into the permissive chick embryo chorioallantoic membrane

Die Transplantation von Organoiden in vaskularisierte Gewebe von Modelltieren, wie z. B. der immundefizienten Chorioallantoismembran (CAM) von Maus- oder Hühnerembryonen, hat sich für die Modellierung der Neovaskularisation als effizient erwiesen. Die CAM ist eine reich vaskularisierte extraembryonale Membran, die eine begrenzte Immunreaktivität aufweist und somit zu einem hervorragenden Wirtsmodell für Zelltransplantationen menschlichen Ursprungs wird.
Diese Arbeit beschreibt die Strategie, menschliche Gehirnorganoide, die sich in mehreren Reifungsstadien differenziert haben, in die CAM zu transplantieren. Die zelluläre Zusammensetzung von Gehirnorganoiden ändert sich mit der Zeit und spiegelt die Meilensteine der menschlichen Gehirnentwicklung wider. Wir transplantierten Gehirnorganoide in relevanten Reifungsstadien: neuroepitheliale Expansion (18 DIV), frühe Neurogenese (60 DIV) und frühe Gliogenese (180 DIV) in das CAM von embryonalen Tag (E)7 Hühnerembryonen. Transplantierte Hirnorganoide wurden 5 Tage später entnommen und ihre histologischen Merkmale analysiert.
Es wurden keine histologischen Anzeichen einer Neovaskularisation in den transplantierten Organoiden oder abnormalen Blutgefäßen neben den Transplantaten festgestellt. Darüber hinaus wurden bemerkenswerte Veränderungen in der zellulären Zusammensetzung der transplantierten Organoide beobachtet, nämlich eine Zunahme der Anzahl der sauren Gliaprotein-positiv-reaktiven Astrozyten. Die zytoarchitektonischen Veränderungen waren jedoch vom Organoid-Reifungsstadium abhängig. Insgesamt deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass Gehirnorganoide in der CAM wachsen können, und sie zeigen Unterschiede in der Zytoarchitektur in Abhängigkeit von ihrem Reifestadium bei der Transplantation.

Human brain organoids are an emerging technique that allows us to recapitulate the early development of the human brain in vitro1,2,3. Nevertheless, one of the major limitations of this model is the lack of vascularization, which plays indispensable roles not only in brain homeostasis but also in brain development4. In addition to the delivery of oxygen and nutrients, accumulating evidence suggests that the vascular system of the brain regulates neural differentiation, migration, and synaptogenesis during development5,6. Therefore, there is an urgent need to establish reliable models that can provide the missing vascular signaling and structure to brain organoids, enhancing the complexity of human brain organoid generation7.
Among the proposed methods for vascularization, two main streamlines can be considered: organoid engrafting into a living organism and purely in vitro technologies co-culturing endothelial cells and neural cells8,9,10,11,12. Intracerebral transplantation in mice is costly and time-consuming, making other technologies relevant for simpler models. The chick chorioallantoic membrane (CAM) assay has been used extensively to study angiogenesis13,14,15. In the last decade, several groups have successfully engrafted different types of organoids, including kidney16,17, cardiac18, and tumor organoids19,20, into CAMs. Nevertheless, little is known about the efficacy, toxicity/rejection, physiological effect, and methods to engraft human brain organoids into the CAM. Another interesting and yet unexplored aspect is the formation of a chimeric blood-brain barrier (BBB) between the CAM and the organoid astrocytic interface. Previous pioneering work suggested the putative feasibility of generating a BBB in the CAM by transplanting astrocytes and astrocyte-conditioned medium21,22,23. However, mature astrocytes seem to be unable to achieve this24,25. Thus, the astrocyte-induced formation of the BBB remains debatable, and transplanting human brain organoids would allow us to shed light on this controversy.
This video article describes a protocol for an in ovo human brain organoid transplant into CAM that promotes growth, improvement, and vascularization, resulting in organoids that encompass histologically compatible BBB elements. Here, we present a protocol ensuring the survival of the chicken embryo and report on the permissivity of the CAM to sustain brain organoid growth.

Autor im Rampenlicht: Optimierung der neurovaskulären Entwicklung von menschlichen Gehirnorganoiden im Hühnerembryo

Frühe ungesteuerte neurovaskuläre Nischenmodellierung des menschlichen Gehirns in die permissive Chorioallantoismembran des Hühnerembryos

The key questions I aim to address revolve around the mechanisms and processes involving human brain formation in the context of normal development, as well as various pathological states. This includes investigating the factors influencing brain development, such as genetics, environmental, and epigenetic influences. Obtaining brain organoids that closely resemble the adult human brain, including vascularization, blood brain barrier functionality, the presence of microglia and cellular diversity is challenging.Overcoming this is essential for the development of more physiologically relevant brain organoid models that can efficiently mimic the adult human brain to enhance clinical applications. Through our research, we provide optimal conditions for transplanting human brain organoids into chorioallantoic membrane to ensure good development of the microglia. This clinical improvement is central for forthcoming efforts in the field to generate synthetic vascularized environment for brain organoids.The advantage of our protocol compared to other techniques lies in its high effectiveness and cost efficiency. We have achieved a high success rate in transplanting viable organoids using fertile eggs from farm chickens. In the future, our laboratory will focus on conducting functional assessments of neo vasculature associated with organoids, exploring potential use of this vascular design model for application of intravenous nanomedicine.Additionally, we aim to evaluate the biodistribution of these nanomedicines in the human central nervous system.

Auswahl des Embryoreifungsplans für die Transplantation Das Experiment beginnt bei D0, wenn befruchtete Eier bei 38 °C und 60 % relativer Luftfeuchtigkeit bebrütet werden. Die Chorioallantoismembran (CAM) ist eine stark vaskularisierte extraembryonale Membran, die sich nach der Inkubation von Eiern entwickelt. Es entsteht durch die Verschmelzung von Allantois und Chorion. Bei D1, nach 24 Stunden Inkubation, wird die Luftkammer punktiert, um zu verhindern, dass sich das CAM an der inneren Schalenmem...

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Hier stellen wir ein Protokoll vor, um menschliche Gehirnorganoide in mehreren Reifungsstadien in die Chorioallantoismembran (CAM) des Kükens einzutransplantieren. Gehirnorganoide wurden nach ungesteuerten standardisierten Protokollen gezüchtet.

Engrafting organoids into vascularized tissues in model animals, such as the immunodeficient mouse or chick embryo chorioallantoic membrane (CAM), has ...

Die Schlüsselfragen, die ich beantworten möchte, drehen sich um die Mechanismen und Prozesse der menschlichen Gehirnbildung im Kontext der normalen Entwicklung sowie um verschiedene pathologische Zustände. Dazu gehört die Untersuchung der Faktoren, die die Gehirnentwicklung beeinflussen, wie Genetik, Umwelteinflüsse und epigenetische Einflüsse. Die Gewinnung von Gehirnorganoiden, die dem erwachsenen menschlichen Gehirn sehr ähnlich sind, einschließlich Vaskularisierung, Funktionalität der Blut-Hirn-Schranke, Vorhandensein von Mikroglia und zellulärer Vielfalt, ist eine Herausforderung.Die Überwindung dieses Problems ist für die Entwicklung physiologisch relevanterer Gehirnorganoidmodelle unerlässlich, die das erwachsene menschliche Gehirn effizient nachahmen können, um klinische Anwendungen zu verbessern. Durch unsere Forschung schaffen wir optimale Bedingungen für die Transplantation menschlicher Gehirnorganoide in die Chorioallantoismembran, um eine gute Entwicklung der Mikroglia zu gewährleisten. Diese klinische Verbesserung ist von zentraler Bedeutung für die bevorstehenden Bemühungen auf diesem Gebiet, eine synthetische vaskularisierte Umgebung für Gehirnorganoide zu schaffen.Der Vorteil unseres Protokolls gegenüber anderen Techniken liegt in seiner hohen Effektivität und Kosteneffizienz. Wir haben eine hohe Erfolgsquote bei der Transplantation lebensfähiger Organoide mit befruchteten Eiern von Nutzhühnern erzielt. In Zukunft wird sich unser Labor auf die Durchführung funktioneller Bewertungen von Neovaskulatur im Zusammenhang mit Organoiden konzentrieren und die potenzielle Verwendung dieses Gefäßdesignmodells für die Anwendung der intravenösen Nanomedizin untersuchen.Darüber hinaus wollen wir die Biodistribution dieser Nanomedikamente im menschlichen Zentralnervensystem untersuchen.

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Early Unguided Human Brain Organoid Neurovascular Niche Modeling into the Permissive Chick Embryo Chorioallantoic Membrane

Engrafting organoids into vascularized tissues in model animals, such as the immunodeficient mouse or chick embryo chorioallantoic membrane (CAM), has proven efficient for neovascularization modeling. The CAM is a richly vascularized extraembryonic membrane, which shows limited immunoreactivity, thus becoming an excellent hosting model for human origin cell transplants.
This paper describes the strategy to engraft human brain organoids differentiated at multiple maturation stages into the CAM. The cellular composition of brain organoids changes with time, reflecting the milestones of human brain development. We grafted brain organoids at relevant maturation stages: neuroepithelial expansion (18 DIV), early neurogenesis (60 DIV), and early gliogenesis (180 DIV) into the CAM of embryonic day (E)7 chicken embryos. Engrafted brain organoids were harvested 5 days later and their histological features were analyzed.
No histological signs of neovascularization in the grafted organoids or abnormal blood vessels adjacent to the graftings were detected. Moreover, remarkable changes were observed in the cellular composition of the grafted organoids, namely, an increase in the number of glial fibrillary acidic protein-positive-reactive astrocytes. However, the cytoarchitectural changes were dependent on the organoid maturation stage. Altogether, these results suggest that brain organoids can grow in the CAM, and they show differences in the cytoarchitecture depending on their maturation stage at grafting.

Here, we present a protocol to engraft human brain organoids at multiple maturation stages into the chick chorioallantoic membrane (CAM). Brain organoids were grown following unguided standardized protocols.