Name: מחבר זרקור: אופטימיזציה של התפתחות נוירו-וסקולרית של אורגנואיד מוח אנושי בעובר אפרוחים
Uploaded: 2024-02-16T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Author Spotlight: Optimizing the Neurovascular Development of Human Brain Organoid in Chick Embryo at JoVE.com

אנו מודים לד"ר אלקנטרה ולד"ר אורטגה מ-UB ולשאר החברים במעבדה של ד"ר אקוסטה על הדיונים מלאי התובנה. S.A. הוא סרה-האנטר עמית עוזר פרופסור מ Generalitat de Catalunya באוניברסיטת ברצלונה.

עוברי תרנגולת הלגהורן הלבנה (Gallus gallus) טופלו על ידי מעקב אחר המדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה מהמכון למשאבי חיות מעבדה, הוועדה למדעי החיים, המועצה הלאומית למחקר, ארה"ב, והניסויים אושרו על ידי המועצה לטיפול ושימוש בחיות ניסוי מאוניברסיטת ברצלונה.
1. הכנת אורגנואיד מוח ?...

השתלת אורגנואידים של המוח האנושי בקרום הכוריאואלנטואי של עובר הגוזל

<ol>
	<li>Camp, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+cerebral+organoids+recapitulate+gene+expression+programs+of+fetal+neocortex+development.">Human cerebral organoids recapitulate gene expression programs of fetal neocortex development.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (51), 15672-15677 (2015).</li><li>Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organogenesis+in+a+dish:+Modeling+development+and+disease+using+organoid+technologies.">Organogenesis in a dish: Modeling development and disease using organoid technologies.</a> Science. 345 (6194), 1247125 (2014).</li><li>Yang, Q., Hong, Y., Zhao, T., Song, H., Ming, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+makes+organoids+good+models+of+human+neurogenesis.">What makes organoids good models of human neurogenesis.</a> Front Neurosci. 16, 872794 (2022).</li><li>Sun, X. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+vascularized+brain+organoids+to+study+neurovascular+interactions.">Generation of vascularized brain organoids to study neurovascular interactions.</a> Elife. 11, e76707 (2022).</li><li>Paredes, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligodendrocyte+precursor+cell+specification+is+regulated+by+bidirectional+neural+progenitor-endothelial+cell+crosstalk.">Oligodendrocyte precursor cell specification is regulated by bidirectional neural progenitor-endothelial cell crosstalk.</a> Nat Neurosci. 24 (4), 478-488 (2021).</li><li>Matsui, T. K., Tsuru, Y., Hasegawa, K., Kuwako, K. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascularization+of+human+brain+organoids.">Vascularization of human brain organoids.</a> Stem Cells. 39 (8), 1017-1024 (2021).</li><li>Apostolou, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+and+challenges+in+stem+cell+biology.">Progress and challenges in stem cell biology.</a> Nat Cell Biol. 25 (2), 203-206 (2023).</li><li>Pham, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+human+vascularized+brain+organoids.">Generation of human vascularized brain organoids.</a> Neuroreport. 29 (7), 588-593 (2018).</li><li>Cakir, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+of+human+brain+organoids+with+a+functional+vascular-like+system.">Engineering of human brain organoids with a functional vascular-like system.</a> Nat Methods. 16 (11), 1169-1175 (2019).</li><li>Shi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascularized+human+cortical+organoids+(vorganoids)+model+cortical+development+in+vivo.">Vascularized human cortical organoids (vorganoids) model cortical development in vivo.</a> PLoS Biol. 18 (5), e3000705 (2020).</li><li>Mansour, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vivo+model+of+functional+and+vascularized+human+brain+organoids.">An in vivo model of functional and vascularized human brain organoids.</a> Nat Biotechnol. 36 (5), 432-441 (2018).</li><li>Revah, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maturation+and+circuit+integration+of+transplanted+human+cortical+organoids.">Maturation and circuit integration of transplanted human cortical organoids.</a> Nature. 610 (7931), 319-326 (2022).</li><li>Ribatti, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chicken+chorioallantoic+membrane+angiogenesis+model.">Chicken chorioallantoic membrane angiogenesis model.</a> Methods Mol Biol. 843, 47-57 (2012).</li><li>Nowak-Sliwinska, P., Segura, T., Iruela-Arispe, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chicken+chorioallantoic+membrane+model+in+biology,+medicine+and+bioengineering.">The chicken chorioallantoic membrane model in biology, medicine and bioengineering.</a> Angiogenesis. 17 (4), 779-804 (2014).</li><li>Kennedy, D. C., Coen, B., Wheatley, A. M., Mccullagh, K. J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microvascular+experimentation+in+the+chick+chorioallantoic+membrane+as+a+model+for+screening+angiogenic+agents+including+from+gene-modified+cells.">Microvascular experimentation in the chick chorioallantoic membrane as a model for screening angiogenic agents including from gene-modified cells.</a> Int J Mol Sci. 23 (1), 452 (2021).</li><li>Garreta, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fine+tuning+the+extracellular+environment+accelerates+the+derivation+of+kidney+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells.">Fine tuning the extracellular environment accelerates the derivation of kidney organoids from human pluripotent stem cells.</a> Nat Mater. 18 (4), 397-405 (2019).</li><li>Kaisto, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+renal+organoid+and+organotypic+culture+for+vascularization,+extended+development,+and+improved+microscopy+imaging.">Optimization of renal organoid and organotypic culture for vascularization, extended development, and improved microscopy imaging.</a> J Vis Exp. (157), e60995 (2020).</li><li>Varzideh, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+cardiomyocytes+undergo+enhanced+maturation+in+embryonic+stem+cell-derived+organoid+transplants.">Human cardiomyocytes undergo enhanced maturation in embryonic stem cell-derived organoid transplants.</a> Biomaterials. 192, 537-550 (2019).</li><li>Komatsu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cam+model+for+cic-dux4+sarcoma+and+its+potential+use+for+precision+medicine.">The cam model for cic-dux4 sarcoma and its potential use for precision medicine.</a> Cells. 10 (10), 2613 (2021).</li><li>Worsdorfer, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+complex+human+organoid+models+including+vascular+networks+by+incorporation+of+mesodermal+progenitor+cells.">Generation of complex human organoid models including vascular networks by incorporation of mesodermal progenitor cells.</a> Sci Rep. 9 (1), 15663 (2019).</li><li>Janzer, R. C., Jaff, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytes+induce+blood-brain+barrier+properties+in+endothelial+cells.">Astrocytes induce blood-brain barrier properties in endothelial cells.</a> Nature. 325 (6101), 253-257 (1987).</li><li>Janzer, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+blood-brain+barrier:+Cellular+basis.">The blood-brain barrier: Cellular basis.</a> J Inherit Metab Dis. 16 (4), 639-647 (1993).</li><li>Lobrinus, J. A., Juillerat-Jeanneret, L., Darekar, P., Schlosshauer, B., Janzer, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+the+blood-brain+barrier+specific+ht7+and+neurothelin+epitopes+in+endothelial+cells+of+the+chick+chorioallantoic+vessels+by+a+soluble+factor+derived+from+astrocytes.">Induction of the blood-brain barrier specific ht7 and neurothelin epitopes in endothelial cells of the chick chorioallantoic vessels by a soluble factor derived from astrocytes.</a> Brain Res Dev Brain Res. 70 (2), 207-211 (1992).</li><li>Holash, J. A., Stewart, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chorioallantoic+membrane+(cam)+vessels+do+not+respond+to+blood-brain+barrier+(bbb)+induction.">Chorioallantoic membrane (cam) vessels do not respond to blood-brain barrier (bbb) induction.</a> Adv Exp Med Biol. 331, 223-228 (1993).</li><li>Holash, J. A., Noden, D. M., Stewart, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Re-evaluating+the+role+of+astrocytes+in+blood-brain+barrier+induction.">Re-evaluating the role of astrocytes in blood-brain barrier induction.</a> Dev Dyn. 197 (1), 14-25 (1993).</li><li>Giandomenico, S. L., Sutcliffe, M., Lancaster, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+and+long-term+culture+of+advanced+cerebral+organoids+for+studying+later+stages+of+neural+development.">Generation and long-term culture of advanced cerebral organoids for studying later stages of neural development.</a> Nat Protoc. 16 (2), 579-602 (2021).</li><li>Wagner-Amos, K., Seymour, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+local+shell+conductance+on+the+vascularisation+of+the+chicken+chorioallantoic+membrane.">Effect of local shell conductance on the vascularisation of the chicken chorioallantoic membrane.</a> Respir Physiol Neurobiol. 134 (2), 155-167 (2003).</li><li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo.+1951.">A series of normal stages in the development of the chick embryo. 1951.</a> Dev Dyn. 195 (4), 231-272 (1992).</li><li>Paredes, I., Himmels, P., Ruiz De Almodovar, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurovascular+communication+during+cns+development.">Neurovascular communication during cns development.</a> Dev Cell. 45 (1), 10-32 (2018).</li><li>Hogan, K. A., Ambler, C. A., Chapman, D. L., Bautch, V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neural+tube+patterns+vessels+developmentally+using+the+vegf+signaling+pathway.">The neural tube patterns vessels developmentally using the vegf signaling pathway.</a> Development. 131 (7), 1503-1513 (2004).</li><li>Bozoyan, L., Khlghatyan, J., Saghatelyan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytes+control+the+development+of+the+migration-promoting+vasculature+scaffold+in+the+postnatal+brain+via+vegf+signaling.">Astrocytes control the development of the migration-promoting vasculature scaffold in the postnatal brain via vegf signaling.</a> J Neurosci. 32 (5), 1687-1704 (2012).</li><li>Himmels, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motor+neurons+control+blood+vessel+patterning+in+the+developing+spinal+cord.">Motor neurons control blood vessel patterning in the developing spinal cord.</a> Nat Commun. 8, 14583 (2017).</li><li>Di Lullo, E., Kriegstein, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+brain+organoids+to+investigate+neural+development+and+disease.">The use of brain organoids to investigate neural development and disease.</a> Nat Rev Neurosci. 18 (10), 573-584 (2017).</li></ol>

במחקר זה, אנו מתארים פרוטוקול מפורט עם שלבים מרכזיים רבים המספקים צמיחה והתפתחות חיובית של אורגנואידים במוח האנושי עם השתלתם מבלי להפריע להישרדותם של עוברי התרנגולות. המלצנו להשתמש במחטים סטריליות כדי לנקב את תא האוויר של הביצה לאחר 24 שעות של דגירה (יום 1). בנוסף, ניסינו גם לבצע את הניקור ב?...

אורגנואידים של המוח האנושי הם טכניקה מתפתחת המאפשרת לנו לשחזר את ההתפתחות המוקדמת של המוח האנושי במבחנה 1,2,3. עם זאת, אחת המגבלות העיקריות של מודל זה היא חוסר כלי דם, אשר ממלא תפקידים חיוניים לא רק בהומאוסטזיס המוח אלא גם בהתפתחות המוח4. בנוסף לאספקת חמצן וחומרים מזינים, עדויות מצטברות מצביעות על כך שמערכת כלי הדם במוח מווסתת התמיינות עצבית, נדידה וסינפטוגנזה במהלך התפתחות 5,6. לכן, יש צורך דחוף להקים מודלים אמינים שיכולים לספק את האיתות והמבנה הווסקולרי החסר לאורגנואידים במוח, ולשפר את המורכבות של דור אורגנואיד המוח האנושי7.
בין השיטות המוצעות לכלי דם, ניתן לשקול שני ייעולים עיקריים: השתלת אורגנואידים לאורגניזם חי וטכנולוגיות חוץ גופיות גרידא בגידול משותף של תאי אנדותל ותאים עצביים 8,9,10,11,12. השתלה תוך-מוחית בעכברים היא יקרה וגוזלת זמן, מה שהופך טכנולוגיות אחרות לרלוונטיות עבור מודלים פשוטים יותר. בדיקת הממברנה הכוריאואלנטואית של אפרוח (CAM) שימשה באופן נרחב לחקר אנגיוגנזה 13,14,15. בעשור האחרון, מספר קבוצות הצליחו להשתיל סוגים שונים של אורגנואידים, כולל כליות16,17, לב18 ואורגנואידים סרטניים19,20, לתוך CAMs. עם זאת, מעט ידוע על היעילות, רעילות/דחייה, השפעה פיזיולוגית ושיטות להשתלת אורגנואידים במוח האנושי לתוך CAM. היבט מעניין נוסף שעדיין לא נחקר הוא היווצרות מחסום דם-מוח כימרי (BBB) בין ה-CAM לבין הממשק האסטרוציטי האורגנואידי. עבודה חלוצית קודמת הציעה את ההיתכנות המשוערת של יצירת BBB ב- CAM על ידי השתלת אסטרוציטים ותווך מותנה אסטרוציטים 21,22,23. עם זאת, נראה כי אסטרוציטים בוגרים אינם מסוגלים להשיג זאת24,25. לפיכך, היווצרות האסטרוציטים של BBB נותרה שנויה במחלוקת, והשתלת אורגנואידים במוח אנושי תאפשר לנו לשפוך אור על מחלוקת זו.
מאמר וידאו זה מתאר פרוטוקול להשתלת אורגנואיד מוח אנושי לתוך CAM המקדם צמיחה, שיפור וכלי דם, וכתוצאה מכך אורגנואידים הכוללים אלמנטים היסטולוגיים תואמים BBB. כאן, אנו מציגים פרוטוקול המבטיח את הישרדותו של עובר התרנגולת ומדווחים על המתירנות של CAM כדי לשמור על צמיחת אורגנואידים במוח.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti-TUBB3 [Tuj1], mouse&#160;</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>801201</td>
			<td>1:1,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GFAP, rabbit</td>
			<td>GeneTex</td>
			<td>GTX108711</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rabbit AlexaFluor 488, goat.</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-21206</td>
			<td>1:1,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse AlexaFluor 594, goat</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>715-585-150</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fertilized White Leghorn chicken (Gallus gallus) eggs</td>
			<td>Granja Gibert (Cambrils, Spain)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1306</td>
			<td>1:10,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPX</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>100579</td>
			<td>xylene-based mounting medium&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentle Dissociation Solution</td>
			<td>CreativeBiolabs</td>
			<td>ITS-0622-YT187</td>
			<td>cell dissociation solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>356234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mowiol 4-88 mounting media</td>
			<td>Merk</td>
			<td>81381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paper towel, lab-grade</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z188956</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROCK inhibitor Y27632</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCM075</td>
			<td>10 nM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sharp-Point Surgical Scissors</td>
			<td>VWR</td>
			<td>470106-340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Plus Adhesion Microscope Slides</td>
			<td>Epredia</td>
			<td>J1800AMNZ</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

early unguided human brain organoid neurovascular niche modeling into the permissive chick embryo chorioallantoic membrane

השתלת אורגנואידים ברקמות כלי דם בחיות מודל, כגון עכבר מדוכא חיסון או קרום כוריואלנטואי של עובר אפרוח (CAM), הוכחה כיעילה עבור מודלים neovascularization. ה- CAM הוא קרום חוץ-עוברי עשיר בכלי הדם, אשר מראה תגובתיות חיסונית מוגבלת, ובכך הופך למודל אירוח מצוין להשתלות תאים ממקור אנושי.
מאמר זה מתאר את האסטרטגיה להשתלת אורגנואידים במוח האנושי המובחנים בשלבי הבשלה מרובים לתוך CAM. ההרכב התאי של אורגנואידים במוח משתנה עם הזמן, ומשקף את אבני הדרך של התפתחות המוח האנושי. השתלנו אורגנואידים במוח בשלבי הבשלה רלוונטיים: התרחבות נוירואפיתל (18 DIV), נוירוגנזה מוקדמת (60 DIV) וגליוגנזה מוקדמת (180 DIV) לתוך CAM של עוברי תרנגולות ביום העוברי (E)7. אורגנואידים מושתלים במוח נקטפו 5 ימים לאחר מכן ותכונותיהם ההיסטולוגיות נותחו.
לא התגלו סימנים היסטולוגיים של ניאו-וסקולריזציה באורגנואידים המושתלים או בכלי דם חריגים הסמוכים להשתלות. יתר על כן, שינויים מדהימים נצפו בהרכב התאי של האורגנואידים המושתלים, כלומר, עלייה במספר האסטרוציטים של חלבון גליה פיברילרי חומצי-חיובי-תגובתי. עם זאת, השינויים הציטוארכיטקטוניים היו תלויים בשלב ההבשלה האורגנואידי. בסך הכל, תוצאות אלה מצביעות על כך שאורגנואידים במוח יכולים לגדול ב- CAM, והם מראים הבדלים בציטוארכיטקטורה בהתאם לשלב ההבשלה שלהם בהשתלה.

Human brain organoids are an emerging technique that allows us to recapitulate the early development of the human brain in vitro1,2,3. Nevertheless, one of the major limitations of this model is the lack of vascularization, which plays indispensable roles not only in brain homeostasis but also in brain development4. In addition to the delivery of oxygen and nutrients, accumulating evidence suggests that the vascular system of the brain regulates neural differentiation, migration, and synaptogenesis during development5,6. Therefore, there is an urgent need to establish reliable models that can provide the missing vascular signaling and structure to brain organoids, enhancing the complexity of human brain organoid generation7.
Among the proposed methods for vascularization, two main streamlines can be considered: organoid engrafting into a living organism and purely in vitro technologies co-culturing endothelial cells and neural cells8,9,10,11,12. Intracerebral transplantation in mice is costly and time-consuming, making other technologies relevant for simpler models. The chick chorioallantoic membrane (CAM) assay has been used extensively to study angiogenesis13,14,15. In the last decade, several groups have successfully engrafted different types of organoids, including kidney16,17, cardiac18, and tumor organoids19,20, into CAMs. Nevertheless, little is known about the efficacy, toxicity/rejection, physiological effect, and methods to engraft human brain organoids into the CAM. Another interesting and yet unexplored aspect is the formation of a chimeric blood-brain barrier (BBB) between the CAM and the organoid astrocytic interface. Previous pioneering work suggested the putative feasibility of generating a BBB in the CAM by transplanting astrocytes and astrocyte-conditioned medium21,22,23. However, mature astrocytes seem to be unable to achieve this24,25. Thus, the astrocyte-induced formation of the BBB remains debatable, and transplanting human brain organoids would allow us to shed light on this controversy.
This video article describes a protocol for an in ovo human brain organoid transplant into CAM that promotes growth, improvement, and vascularization, resulting in organoids that encompass histologically compatible BBB elements. Here, we present a protocol ensuring the survival of the chicken embryo and report on the permissivity of the CAM to sustain brain organoid growth.

מחבר זרקור: אופטימיזציה של התפתחות נוירו-וסקולרית של אורגנואיד מוח אנושי בעובר אפרוחים

אורגנואיד מוח אנושי מוקדם לא מונחה מידול נישה נוירו-וסקולרית לתוך קרום עובר אפרוח מתירני Chorioallantoic

The key questions I aim to address revolve around the mechanisms and processes involving human brain formation in the context of normal development, as well as various pathological states. This includes investigating the factors influencing brain development, such as genetics, environmental, and epigenetic influences. Obtaining brain organoids that closely resemble the adult human brain, including vascularization, blood brain barrier functionality, the presence of microglia and cellular diversity is challenging.Overcoming this is essential for the development of more physiologically relevant brain organoid models that can efficiently mimic the adult human brain to enhance clinical applications. Through our research, we provide optimal conditions for transplanting human brain organoids into chorioallantoic membrane to ensure good development of the microglia. This clinical improvement is central for forthcoming efforts in the field to generate synthetic vascularized environment for brain organoids.The advantage of our protocol compared to other techniques lies in its high effectiveness and cost efficiency. We have achieved a high success rate in transplanting viable organoids using fertile eggs from farm chickens. In the future, our laboratory will focus on conducting functional assessments of neo vasculature associated with organoids, exploring potential use of this vascular design model for application of intravenous nanomedicine.Additionally, we aim to evaluate the biodistribution of these nanomedicines in the human central nervous system.

בחירת לוח הזמנים להבשלת העובר להשתלה הניסוי מתחיל ב-D0 כאשר ביצים מופרות מודגרות בטמפרטורה של 38°C ו-60% לחות יחסית. הממברנה הכוריאואלנטואית (CAM) היא קרום חוץ-עוברי מאוד וסקולרי המתפתח לאחר דגירה של ביציות. הוא נוצר על ידי מיזוג של allantois ו chorion. ב-D1, לאחר 24 שעות של דגירה, תא האוויר מנוקב ...

Watch this Scientific Journal Video about Author Spotlight: Optimizing the Neurovascular Development of Human Brain Organoid in Chick Embryo at JoVE.com

כאן, אנו מציגים פרוטוקול להשתלת אורגנואידים במוח האנושי בשלבי הבשלה מרובים לתוך קרום כוריואלנטואי אפרוח (CAM). אורגנואידים במוח גודלו בעקבות פרוטוקולים סטנדרטיים לא מונחים.

Engrafting organoids into vascularized tissues in model animals, such as the immunodeficient mouse or chick embryo chorioallantoic membrane (CAM), has ...

שאלות המפתח שאני מבקש לעסוק בהן סובבות סביב המנגנונים והתהליכים המערבים את היווצרות המוח האנושי בהקשר של התפתחות נורמלית, כמו גם מצבים פתולוגיים שונים. זה כולל חקירת הגורמים המשפיעים על התפתחות המוח, כגון גנטיקה, השפעות סביבתיות ואפיגנטיות. השגת אורגנואידים במוח הדומים מאוד למוח האנושי הבוגר, כולל כלי דם, פונקציונליות מחסום דם במוח, נוכחות מיקרוגליה ומגוון תאי היא מאתגרת.התגברות על כך חיונית לפיתוח מודלים פיזיולוגיים יותר של אורגנואידים במוח שיכולים לחקות ביעילות את המוח האנושי הבוגר כדי לשפר את היישומים הקליניים. באמצעות המחקר שלנו, אנו מספקים תנאים אופטימליים להשתלת אורגנואידים במוח האנושי לתוך קרום chorioallantoic כדי להבטיח התפתחות טובה של מיקרוגליה. שיפור קליני זה הוא מרכזי במאמצים הבאים בתחום ליצור סביבה וסקולרית סינתטית עבור אורגנואידים במוח.היתרון של הפרוטוקול שלנו בהשוואה לטכניקות אחרות טמון ביעילות הגבוהה וביעילות העלות שלו. השגנו שיעור הצלחה גבוה בהשתלת אורגנואידים בני קיימא באמצעות ביצים פוריות מתרנגולות משק. בעתיד, המעבדה שלנו תתמקד בביצוע הערכות תפקודיות של ניאו-וסקולטורה הקשורה לאורגנואידים, ותבחן שימוש פוטנציאלי במודל תכנון כלי דם זה ליישום ננו-רפואה תוך ורידית.בנוסף, אנו שואפים להעריך את ההפצה הביולוגית של ננו-תרופות אלה במערכת העצבים המרכזית של האדם.

early-unguided-human-brain-organoid-neurovascular-niche-modeling-into

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Early Unguided Human Brain Organoid Neurovascular Niche Modeling into the Permissive Chick Embryo Chorioallantoic Membrane

Engrafting organoids into vascularized tissues in model animals, such as the immunodeficient mouse or chick embryo chorioallantoic membrane (CAM), has proven efficient for neovascularization modeling. The CAM is a richly vascularized extraembryonic membrane, which shows limited immunoreactivity, thus becoming an excellent hosting model for human origin cell transplants.
This paper describes the strategy to engraft human brain organoids differentiated at multiple maturation stages into the CAM. The cellular composition of brain organoids changes with time, reflecting the milestones of human brain development. We grafted brain organoids at relevant maturation stages: neuroepithelial expansion (18 DIV), early neurogenesis (60 DIV), and early gliogenesis (180 DIV) into the CAM of embryonic day (E)7 chicken embryos. Engrafted brain organoids were harvested 5 days later and their histological features were analyzed.
No histological signs of neovascularization in the grafted organoids or abnormal blood vessels adjacent to the graftings were detected. Moreover, remarkable changes were observed in the cellular composition of the grafted organoids, namely, an increase in the number of glial fibrillary acidic protein-positive-reactive astrocytes. However, the cytoarchitectural changes were dependent on the organoid maturation stage. Altogether, these results suggest that brain organoids can grow in the CAM, and they show differences in the cytoarchitecture depending on their maturation stage at grafting.

Here, we present a protocol to engraft human brain organoids at multiple maturation stages into the chick chorioallantoic membrane (CAM). Brain organoids were grown following unguided standardized protocols.