Name: 저자 스포트라이트: 병아리 배아에서 인간 뇌 오가노이드의 신경혈관 발달 최적화
Uploaded: 2024-02-16T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Author Spotlight: Optimizing the Neurovascular Development of Human Brain Organoid in Chick Embryo at JoVE.com

통찰력 있는 토론을 해주신 UB의 Alcántara 박사님과 Ortega 박사님, 그리고 Acosta 박사님 연구실의 다른 분들께 감사드립니다. S.A.는 바르셀로나 대학교(Universitat de Barcelona)의 카탈루냐 총대주교(Generalitat de Catalunya)의 세라-헌터(Serra-Hunter) 동료 조교수입니다.

흰다리뿔닭(Gallus gallus) 배아는 미국 국립연구위원회(National Research Council) 생명과학위원회 실험동물자원연구소(Institute of Laboratory Animals Resources)의 실험동물 관리 및 사용 가이드(Guide for the Care and Use of Laboratory Animals)에 따라 처리되었으며, 실험은 바르셀로나 대학의 실험동물 관리 및 사용 위원회(Council for Care and Use of Experimental Animals)의 승인을 받았습니다.
1. 비유도...

인간 뇌 오가노이드를 병아리 배아의 맥락막(chorrioallantoic membrane)에 이식

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	<li>Camp, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+cerebral+organoids+recapitulate+gene+expression+programs+of+fetal+neocortex+development.">Human cerebral organoids recapitulate gene expression programs of fetal neocortex development.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (51), 15672-15677 (2015).</li><li>Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organogenesis+in+a+dish:+Modeling+development+and+disease+using+organoid+technologies.">Organogenesis in a dish: Modeling development and disease using organoid technologies.</a> Science. 345 (6194), 1247125 (2014).</li><li>Yang, Q., Hong, Y., Zhao, T., Song, H., Ming, G. 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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+the+blood-brain+barrier+specific+ht7+and+neurothelin+epitopes+in+endothelial+cells+of+the+chick+chorioallantoic+vessels+by+a+soluble+factor+derived+from+astrocytes.">Induction of the blood-brain barrier specific ht7 and neurothelin epitopes in endothelial cells of the chick chorioallantoic vessels by a soluble factor derived from astrocytes.</a> Brain Res Dev Brain Res. 70 (2), 207-211 (1992).</li><li>Holash, J. A., Stewart, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chorioallantoic+membrane+(cam)+vessels+do+not+respond+to+blood-brain+barrier+(bbb)+induction.">Chorioallantoic membrane (cam) vessels do not respond to blood-brain barrier (bbb) induction.</a> Adv Exp Med Biol. 331, 223-228 (1993).</li><li>Holash, J. A., Noden, D. 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S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+local+shell+conductance+on+the+vascularisation+of+the+chicken+chorioallantoic+membrane.">Effect of local shell conductance on the vascularisation of the chicken chorioallantoic membrane.</a> Respir Physiol Neurobiol. 134 (2), 155-167 (2003).</li><li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo.+1951.">A series of normal stages in the development of the chick embryo. 1951.</a> Dev Dyn. 195 (4), 231-272 (1992).</li><li>Paredes, I., Himmels, P., Ruiz De Almodovar, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurovascular+communication+during+cns+development.">Neurovascular communication during cns development.</a> Dev Cell. 45 (1), 10-32 (2018).</li><li>Hogan, K. A., Ambler, C. A., Chapman, D. L., Bautch, V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neural+tube+patterns+vessels+developmentally+using+the+vegf+signaling+pathway.">The neural tube patterns vessels developmentally using the vegf signaling pathway.</a> Development. 131 (7), 1503-1513 (2004).</li><li>Bozoyan, L., Khlghatyan, J., Saghatelyan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytes+control+the+development+of+the+migration-promoting+vasculature+scaffold+in+the+postnatal+brain+via+vegf+signaling.">Astrocytes control the development of the migration-promoting vasculature scaffold in the postnatal brain via vegf signaling.</a> J Neurosci. 32 (5), 1687-1704 (2012).</li><li>Himmels, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motor+neurons+control+blood+vessel+patterning+in+the+developing+spinal+cord.">Motor neurons control blood vessel patterning in the developing spinal cord.</a> Nat Commun. 8, 14583 (2017).</li><li>Di Lullo, E., Kriegstein, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+brain+organoids+to+investigate+neural+development+and+disease.">The use of brain organoids to investigate neural development and disease.</a> Nat Rev Neurosci. 18 (10), 573-584 (2017).</li></ol>

이 연구에서는 닭 배아의 생존을 방해하지 않으면서 이식 시 인간 뇌 오가노이드의 유리한 성장과 발달을 제공하는 수많은 주요 단계가 포함된 자세한 프로토콜을 설명합니다. 멸균 바늘을 사용하여 배양 24시간(1일) 후 난자의 공기실에 구멍을 뚫을 것을 권장했습니다. 또한, 우리는 또한 4일째에 구멍을 뚫으려고 시도했습니다(건강한 배아에서만 일하고 있는지 확인하기 위해 혈관 발달을 테스?...

인간 뇌 오가노이드는 인간 뇌의 초기 발달을 in vitro 1,2,3으로 요약할 수 있는 새로운 기술입니다. 그럼에도 불구하고 이 모델의 주요 한계 중 하나는 뇌 항상성뿐만 아니라 뇌 발달에도 필수적인 역할을 하는 혈관화가 부족하다는 것이다4. 축적된 증거에 따르면 산소와 영양소의 전달 외에도 뇌의 혈관계는 발달 과정에서 신경 분화, 이동 및 시냅스 형성을 조절합니다 5,6. 따라서 뇌 오가노이드에 누락된 혈관 신호전달 및 구조를 제공하여 인간 뇌 오가노이드 세대의 복잡성을 높일 수 있는 신뢰할 수 있는 모델 구축이 시급하다7.
제안된 혈관화 방법 중 두 가지 주요 유선형을 고려할 수 있습니다: 살아있는 유기체에 오가노이드 생착과 내피 세포와 신경 세포를 공동 배양하는 순수 시험관 내 기술 8,9,10,11,12. 생쥐의 뇌내 이식은 비용과 시간이 많이 들기 때문에 다른 기술은 더 간단한 모델과 관련이 있습니다. 병아리 융모막 막(CAM) 분석은 혈관신생을 연구하는 데 광범위하게 사용되었습니다 13,14,15. 지난 10년 동안 여러 그룹이 신장 16,17, 심장18 및 종양 오가노이드19,20을 포함한 다양한 유형의 오가노이드를 CAM에 성공적으로 생착했습니다. 그럼에도 불구하고 인간의 뇌 오가노이드를 CAM에 생착시키는 효능, 독성/거부 반응, 생리학적 효과 및 방법에 대해서는 알려진 바가 거의 없습니다. 또 다른 흥미롭지만 아직 탐구되지 않은 측면은 CAM과 오가노이드 성상세포 인터페이스 사이에 키메라 혈액-뇌 장벽(BBB)이 형성된다는 것입니다. 이전의 선구적인 연구는 성상교세포와 성상교세포가 조건화된 배지를 이식하여 CAM에서 BBB를 생성하는 추정 가능성을 제안했습니다 21,22,23. 그러나 성숙한 성상교세포는 이24,25를 달성할 수 없는 것으로 보인다. 따라서 성상교세포에 의한 BBB의 형성은 여전히 논쟁의 여지가 있으며, 인간 뇌 오가노이드를 이식하면 이 논란에 대한 실마리를 제공할 수 있습니다.
이 비디오 기사는 성장, 개선 및 혈관화를 촉진하여 조직학적으로 호환되는 BBB 요소를 포함하는 오가노이드를 생성하는 CAM으로의 난형 인간 뇌 오가노이드 이식 프로토콜에 대해 설명합니다. 여기에서 우리는 닭 배아의 생존을 보장하는 프로토콜을 제시하고 뇌 오가노이드 성장을 유지하기 위한 CAM의 허용성에 대해 보고합니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti-TUBB3 [Tuj1], mouse&#160;</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>801201</td>
			<td>1:1,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GFAP, rabbit</td>
			<td>GeneTex</td>
			<td>GTX108711</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rabbit AlexaFluor 488, goat.</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-21206</td>
			<td>1:1,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse AlexaFluor 594, goat</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>715-585-150</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fertilized White Leghorn chicken (Gallus gallus) eggs</td>
			<td>Granja Gibert (Cambrils, Spain)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1306</td>
			<td>1:10,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPX</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>100579</td>
			<td>xylene-based mounting medium&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentle Dissociation Solution</td>
			<td>CreativeBiolabs</td>
			<td>ITS-0622-YT187</td>
			<td>cell dissociation solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>356234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mowiol 4-88 mounting media</td>
			<td>Merk</td>
			<td>81381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paper towel, lab-grade</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z188956</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROCK inhibitor Y27632</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCM075</td>
			<td>10 nM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sharp-Point Surgical Scissors</td>
			<td>VWR</td>
			<td>470106-340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Plus Adhesion Microscope Slides</td>
			<td>Epredia</td>
			<td>J1800AMNZ</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

early unguided human brain organoid neurovascular niche modeling into the permissive chick embryo chorioallantoic membrane

면역 결핍 마우스 또는 병아리 배아 융모막(CAM)과 같은 모델 동물의 혈관 조직에 오가노이드를 생착하는 것은 신생혈관 형성 모델링에 효율적인 것으로 입증되었습니다. CAM은 혈관이 풍부하게 형성된 배아외 막으로, 면역 반응이 제한되어 인간 유래 세포 이식을 위한 훌륭한 호스팅 모델이 되었습니다.
본 논문은 여러 성숙 단계에서 분화된 인간 뇌 오가노이드를 CAM에 이식하는 전략을 설명합니다. 뇌 오가노이드의 세포 구성은 시간이 지남에 따라 변화하며, 이는 인간 뇌 발달의 이정표를 반영합니다. 신경 상피 확장(18 DIV), 초기 신경 발생(60 DIV) 및 초기 신경 형성(180 DIV)과 같은 관련 성숙 단계의 뇌 오가노이드를 배아일(E)7 닭 배아의 CAM에 이식했습니다. 생착된 뇌 오가노이드를 5일 후에 수확하고 조직학적 특징을 분석했습니다.
이식된 오가노이드에서 신생혈관 형성의 조직학적 징후나 이식편에 인접한 비정상적인 혈관은 발견되지 않았습니다. 또한, 이식된 오가노이드의 세포 구성에서 현저한 변화, 즉 신경교세포(glial fibrillary acidic protein-positive-reactive astrocyte)의 수가 증가하는 것이 관찰되었습니다. 그러나 세포구조적 변화는 오가노이드 성숙 단계에 따라 달라졌습니다. 이러한 결과는 뇌 오가노이드가 CAM에서 자랄 수 있음을 시사하며, 이식 시 성숙 단계에 따라 세포 구조의 차이를 보여줍니다.

Human brain organoids are an emerging technique that allows us to recapitulate the early development of the human brain in vitro1,2,3. Nevertheless, one of the major limitations of this model is the lack of vascularization, which plays indispensable roles not only in brain homeostasis but also in brain development4. In addition to the delivery of oxygen and nutrients, accumulating evidence suggests that the vascular system of the brain regulates neural differentiation, migration, and synaptogenesis during development5,6. Therefore, there is an urgent need to establish reliable models that can provide the missing vascular signaling and structure to brain organoids, enhancing the complexity of human brain organoid generation7.
Among the proposed methods for vascularization, two main streamlines can be considered: organoid engrafting into a living organism and purely in vitro technologies co-culturing endothelial cells and neural cells8,9,10,11,12. Intracerebral transplantation in mice is costly and time-consuming, making other technologies relevant for simpler models. The chick chorioallantoic membrane (CAM) assay has been used extensively to study angiogenesis13,14,15. In the last decade, several groups have successfully engrafted different types of organoids, including kidney16,17, cardiac18, and tumor organoids19,20, into CAMs. Nevertheless, little is known about the efficacy, toxicity/rejection, physiological effect, and methods to engraft human brain organoids into the CAM. Another interesting and yet unexplored aspect is the formation of a chimeric blood-brain barrier (BBB) between the CAM and the organoid astrocytic interface. Previous pioneering work suggested the putative feasibility of generating a BBB in the CAM by transplanting astrocytes and astrocyte-conditioned medium21,22,23. However, mature astrocytes seem to be unable to achieve this24,25. Thus, the astrocyte-induced formation of the BBB remains debatable, and transplanting human brain organoids would allow us to shed light on this controversy.
This video article describes a protocol for an in ovo human brain organoid transplant into CAM that promotes growth, improvement, and vascularization, resulting in organoids that encompass histologically compatible BBB elements. Here, we present a protocol ensuring the survival of the chicken embryo and report on the permissivity of the CAM to sustain brain organoid growth.

저자 스포트라이트: 병아리 배아에서 인간 뇌 오가노이드의 신경혈관 발달 최적화

초기 비유도 인간 뇌 오가노이드 신경 혈관 틈새 모델링을 허용 병아리 배아 맥락막으로 모델링

The key questions I aim to address revolve around the mechanisms and processes involving human brain formation in the context of normal development, as well as various pathological states. This includes investigating the factors influencing brain development, such as genetics, environmental, and epigenetic influences. Obtaining brain organoids that closely resemble the adult human brain, including vascularization, blood brain barrier functionality, the presence of microglia and cellular diversity is challenging.Overcoming this is essential for the development of more physiologically relevant brain organoid models that can efficiently mimic the adult human brain to enhance clinical applications. Through our research, we provide optimal conditions for transplanting human brain organoids into chorioallantoic membrane to ensure good development of the microglia. This clinical improvement is central for forthcoming efforts in the field to generate synthetic vascularized environment for brain organoids.The advantage of our protocol compared to other techniques lies in its high effectiveness and cost efficiency. We have achieved a high success rate in transplanting viable organoids using fertile eggs from farm chickens. In the future, our laboratory will focus on conducting functional assessments of neo vasculature associated with organoids, exploring potential use of this vascular design model for application of intravenous nanomedicine.Additionally, we aim to evaluate the biodistribution of these nanomedicines in the human central nervous system.

이식을 위한 배아 성숙 일정 선택 실험은 수정란이 38°C 및 60% 상대 습도에서 배양될 때 D0에서 시작됩니다. 융모막막(chorioallantoic membrane, CAM)은 난자 배양 후 발달하는 고도로 혈관화된 배아외 막입니다. 그것은 알란토아와 융모막의 융합에 의해 형성됩니다. D1에서 24시간의 배양 후 CAM이 내부 쉘 멤브레인에 부착되는 것을 방지하기 위해 공기 챔버에 구멍이 뚫립니다. D1에서 공기 챔...

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여기에서는 여러 성숙 단계에서 인간 뇌 오가노이드를 병아리 융모막(CAM)에 생착하는 프로토콜을 제시합니다. 뇌 오가노이드는 유도되지 않은 표준화된 프로토콜에 따라 성장했습니다.

Engrafting organoids into vascularized tissues in model animals, such as the immunodeficient mouse or chick embryo chorioallantoic membrane (CAM), has ...

내가 다루고자 하는 핵심 질문은 다양한 병리학적 상태뿐만 아니라 정상적인 발달의 맥락에서 인간의 뇌 형성과 관련된 메커니즘과 과정을 중심으로 합니다. 여기에는 유전학, 환경 및 후성 유전 학적 영향과 같은 뇌 발달에 영향을 미치는 요인을 조사하는 것이 포함됩니다. 혈관 형성, 혈액 뇌 장벽 기능, 미세아교세포의 존재 및 세포 다양성을 포함하여 성인 인간의 뇌와 매우 유사한 뇌 오가노이드를 얻는 것은 어려운 일입니다.이를 극복하는 것은 임상 응용을 강화하기 위해 성인 인간의 뇌를 효율적으로 모방할 수 있는 생리학적으로 더 관련성이 높은 뇌 오가노이드 모델을 개발하는 데 필수적입니다. 연구를 통해 인간의 뇌 오가노이드를 융모막에 이식하여 미세아교세포의 원활한 발달을 보장하기 위한 최적의 조건을 제공합니다. 이러한 임상적 개선은 뇌 오가노이드를 위한 합성 혈관 환경을 생성하기 위한 향후 노력의 핵심입니다.다른 기술에 비해 우리 프로토콜의 장점은 높은 효율성과 비용 효율성에 있습니다. 우리는 농장 닭의 유정란을 사용하여 생존 가능한 오가노이드를 이식하는 데 높은 성공률을 달성했습니다. 앞으로 우리 연구실은 오가노이드와 관련된 신생혈관의 기능적 평가를 수행하는 데 중점을 두고 정맥 나노의학 적용을 위한 이 혈관 설계 모델의 잠재적 사용을 모색할 것입니다.게다가, 우리는 인간 중추 신경계에 있는 이 nanomedicines의 biodistribution를 평가하는 것을 작정입니다.

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Early Unguided Human Brain Organoid Neurovascular Niche Modeling into the Permissive Chick Embryo Chorioallantoic Membrane

Engrafting organoids into vascularized tissues in model animals, such as the immunodeficient mouse or chick embryo chorioallantoic membrane (CAM), has proven efficient for neovascularization modeling. The CAM is a richly vascularized extraembryonic membrane, which shows limited immunoreactivity, thus becoming an excellent hosting model for human origin cell transplants.
This paper describes the strategy to engraft human brain organoids differentiated at multiple maturation stages into the CAM. The cellular composition of brain organoids changes with time, reflecting the milestones of human brain development. We grafted brain organoids at relevant maturation stages: neuroepithelial expansion (18 DIV), early neurogenesis (60 DIV), and early gliogenesis (180 DIV) into the CAM of embryonic day (E)7 chicken embryos. Engrafted brain organoids were harvested 5 days later and their histological features were analyzed.
No histological signs of neovascularization in the grafted organoids or abnormal blood vessels adjacent to the graftings were detected. Moreover, remarkable changes were observed in the cellular composition of the grafted organoids, namely, an increase in the number of glial fibrillary acidic protein-positive-reactive astrocytes. However, the cytoarchitectural changes were dependent on the organoid maturation stage. Altogether, these results suggest that brain organoids can grow in the CAM, and they show differences in the cytoarchitecture depending on their maturation stage at grafting.

Here, we present a protocol to engraft human brain organoids at multiple maturation stages into the chick chorioallantoic membrane (CAM). Brain organoids were grown following unguided standardized protocols.