Name: Studying Neuroinflammatory Pathways Through Simultaneous Isolation of All Main CNS-Resident Cell Types (Video) | JoVE
Uploaded: 2023-10-06T13:40:00
Duration: 2 min
Description: Watch this Scientific Journal Video about Studying Neuroinflammatory Pathways Through Simultaneous Isolation of All Main CNS-Resident Cell Types at JoVE.com

تم إنشاء الأشكال باستخدام Adobe Illustrator (إصدار 2023) و Servier Medical Art (https://smart.servier.com). تم دعم أنطونيا هينز من قبل مؤسسة يورغن مانشوت.

Isolating All CNS Resident Cell Types Simultaneously from Autoimmune Mice

يعلن جميع المؤلفين أنه ليس لديهم تضارب في المصالح.

حتى الآن ، توفر طرق رسم خرائط الخلايا المقيمة في الجهاز العصبي المركزي خارج الجسم الحي من خلال الجمع بين قياس الطيف الكتلي وتسلسل الحمض النووي الريبي تنميطا خلويا دقيقا للغاية في الصحة والمرض ولكنها تتطلب معرفة وخبرة تقنية طموحة في هذا المجال50,51. علاوة على ذلك ، فهي لا تسمح بالتحليلات الوظيفية وهي مكلفة للغاية. إلى جانب ذلك ، توفر أنظمة الموائع الدقيقة على الرقاقة فحصا سريعا وبأسعار معقولة لآليات المرض واختبار الأساليب العلاجية الجديدة مع تقييد نمو الخلايا والهجرة52،53،54،55. يمكن أن تمثل عضويات الجهاز العصبي المركزي أيضا بديلا مكافئا في المستقبل للتحقيق في النمذجة الخلوية ، والاتصالات بين الخلايا ، والتفاعلات أثناء دورات المرض56،57،58،59. ومع ذلك ، فإن فرز الخلايا المنشطة بالفلورة والمغناطيسية هي حاليا أكثر الطرق فعالية لتوليد معلقات خلية واحدة نقية وقابلة للحياة خارج الجسم الحي35،60،61. حتى لو كانت بروتوكولات التصنيع الأخرى المعمول بها لعزل أنواع الخلايا المقيمة في الجهاز العصبي المركزي متشابهة فيما يتعلق بالخطوات الفردية للعزل المغناطيسي وتفكك الخلية السابق ، فمن المفترض أن يتم إجراؤها لكل نوع من أنواع الخلايا على حدة. على النقيض من ذلك ، يدمج البروتوكول الحالي طرق عزل مختلفة لكل نوع خلية مقيمة في الجهاز العصبي المركزي في سياق منطقي بحيث يمكن إجراؤها في وقت واحد في وقت واحد ومن تعليق خلية واحدة في الجهاز العصبي المركزي (الجدول 1 ، الجدول 2). وبالتالي ، فإنه يتيح إجراء تحليلات متعددة الأوميكس من تعليق خلية واحدة في الجهاز العصبي المركزي ، وفي النهاية ، استكشاف الشبكات العصبية المعقدة. حتى لو لم يكن من الضروري تجميع عدة أنسجة من متعددة لتنفيذ هذا البروتوكول ، فإن هذا التجميع يضمن عددا كافيا من الخلايا المعزولة لمزيد من التحليل النهائي. إن استخدام الفئران المختلفة لعزل أنواع الخلايا المفردة من شأنه أن يستبعد إمكانية تحليل التفاعلات الخلوية المحتملة. إلى جانب ذلك ، فإن الجمع بين طرق العزل الفردية لأنواع خلايا الجهاز العصبي المركزي المختلفة ، والتي تتبع جميعها تفككا سابقا للجهاز العصبي المركزي ، يوفر تكاليف المواد باستخدام تعليق خلية CNS منفصل واحد لجميع خطوات العزل المغناطيسي التالية. بالإضافة إلى ذلك ، يتم تقليل التحيز التقني المحتمل الناجم عن استخدام الفئران المختلفة.
يمكن أن يكون أحد قيود البروتوكول هو الاستخدام الحصري تقريبا لإناث الفئران C57BL / 6J. تم تصميم بروتوكول التحصين EAE وتأسيسه لإناث الفئران ، لذلك تم تنفيذ بروتوكول عزل الخلايا هذا في إناث الفئران C57BL / 6J أيضا. ومع ذلك ، تم استخدام الفئران الذكور الساذجة أيضا أثناء تطوير هذا البروتوكول ، دون التعرف على أي تأثير على عدد الخلايا أو النقاء الناتج. يؤثر تقييد آخر على عزل الخلايا المغناطيسية للخلايا العصبية حيث لا توجد حبات دقيقة محددة لعزل الخلايا العصبية من حيث الانتقاء الإيجابي. كان من المفترض أنه يمكن الحصول على معلق نقي أحادي الخلية عن طريق وضع علامات البيوتين واستنفاد جميع الخلايا غير العصبية (الجدول 2). تم التحقق من هذا الافتراض من خلال استخدام NeuN كعلامة نووية محددة للخلايا العصبية ، مدمجة في لوحة نقاء التدفق الخلوي المذكورة. هناك قيد آخر يتعلق بعزل الخلايا الدبقية الصغيرة في فئران EAE. هنا ، يتم تقليل إنتاجية الخلايا الناتجة مقارنة بأنواع الخلايا الأخرى بسبب خطوة الفرز الإضافية بعد بروتوكول MACS. علاوة على ذلك ، يمكن للمرء أن يجادل بأن الفرز يزيد من الضغط الميكانيكي للخلايا الدبقية الصغيرة مقارنة بمجموعات الخلايا الأخرى. قد تؤدي استراتيجيات الفرز الفردية إلى كميات مختلفة من غلة الخلايا. إذا كان رقم الخلية المعزولة أقل من المتوقع أو المطلوب ، يوصى بتعديل إعداد البوابة و / أو تحسين التمييز الحي / الميت.
وتمثل الخطوة الحاسمة في البروتوكول إزالة الحطام. يجب وضع طبقات التدرج ببطء شديد وبلطف لإنشاء المراحل الثلاث المنفصلة المطلوبة (الشكل 2 أ). فقط إذا تمت إزالة المايلين وبقايا الحطام الأخرى في المرحلتين العلويتين تماما (الشكل 2E) ، يمكن توليد معلقات نقية أحادية الخلية ، ويمكن تقليل المزيد من التلوث. إذا كانت معلقات الخلايا الناتجة تفتقر إلى النقاء ، فمن المحتمل أن يكون هذا هو قسم البروتوكول الذي يجب تحسينه أولا بجانب ضمان الاستخدام الصحيح لجميع الخرز الصغير.
قد يكون الحصول على مستويات عالية من النقاء والجدوى أمرا صعبا في هذا النوع من التجارب. بعض التوصيات لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها هي:
- العمل تحت ظروف معقمة إلزامي لمنع تلوث الخرز الدقيق المختلفة وتمكين الاستخدام المتكرر ، خاصة للزراعة اللاحقة. - يوصى بشدة بوضع علامات على كل أنبوب لمنع الاختلاط. - تجنب استخدام الكواشف / المخازن المؤقتة غير المبردة. قم بتخزين جميع معلقات الخلايا على الجليد أثناء التجربة بأكملها لضمان قابلية عالية للحياة. - حافظ على الوقت بين خطوات العمل المختلفة قصيرا قدر الإمكان. لا يوجد جزء محدد في البروتوكول حيث يوصى بإيقاف التجربة مؤقتا. - من المهم للغاية الالتزام بفترات الحضانة المحددة.
في الختام ، يوفر هذا البروتوكول الحالي للعزل المتزامن لجميع أنواع الخلايا الرئيسية المقيمة في الجهاز العصبي المركزي من نسخة متماثلة واحدة من الجهاز العصبي المركزي إمكانية تحليل الشبكات العصبية المعقدة والمسارات الالتهابية العصبية خارج الجسم الحي من تعليق خلية الجهاز العصبي المركزي. وبالتالي ، يمكن فحص الخلايا المقيمة في الجهاز العصبي المركزي خلال مراحل مختلفة من دورات المرض ، على سبيل المثال ، أثناء الالتهاب العصبي و / أو التنكس العصبي و / أو مغفرة في EAE. علاوة على ذلك ، يمكن دراسة تفاعلات الخلايا الخلوية والمسارات الكيميائية الحيوية على المستوى الفردي ويمكن تقليل التباين داخل المجموعات التجريبية. هناك أيضا فرصة لزراعة أجزاء من خلايا الجهاز العصبي المركزي المعزولة في الزراعات الأحادية لمزيد من المقايسات الوظيفية والتحقق من الصحة. الكل في واحد ، يقدم هذا البروتوكول تطورات كبيرة يحتمل أن تؤثر على مناهج البحوث قبل السريرية والسريرية.

التصلب المتعدد (MS) هو مرض مناعي ذاتي التهابي مزمن يصيب الجهاز العصبي المركزي (CNS) يتميز بإزالة الميالين وتلف المحور العصبي والتسمم والتنكس العصبي. على الرغم من العديد من الأساليب البحثية في هذا المجال ، لا تزال الفيزيولوجيا المرضية لمرض التصلب العصبي المتعدد غير مفهومة تماما1،2،3،4. النموذج الحيواني الأكثر شيوعا للتحقيق في مرض التصلب العصبي المتعدد هو ببتيد البروتين السكري قليل التغصن المايلين 35-55 (MOG35-55) - التهاب الدماغ والنخاع المناعي الذاتي التجريبي (EAE) الذي يشترك في العديد من ميزاته السريرية والفيزيولوجيةالمرضية 5،6،7،8،9. يعتمد على استجابة الجهاز المناعي ضد المستضدات الخاصة بالجهاز العصبي المركزي مما يؤدي إلى الالتهاب وإزالة الميالين والتنكس العصبي المحوري. يعد التهاب الدماغ والنخاع المناعي الذاتي التجريبي (EAE) نموذجا مناسبا للتحقيق في مسارات الالتهاب العصبي وشلالات الإشارات الموجودة في مرض التصلب العصبي المتعدد.
خيارات العلاج الحالية لمرض التصلب العصبي المتعدد فعالة جزئيا فقط وتركز في المقام الأول على المرحلة الالتهابية الأولية للمرض. ومع ذلك ، يبدو أن المكون التنكسي العصبي لمرض التصلب العصبي المتعدد هو التحدي الرئيسي للنهج العلاجية طويلة الأجل. لذلك ، هناك حاجة إلى بروتوكولات عزل الخلايا القابلة للتكرار والدقيقة للتحقيق في الآليات الجزيئية والخلوية في أمراض المناعة الذاتية بطريقة شاملة. حتى في حالة وجود بعض البروتوكولات لعزل نوع واحد من الخلايا10،11،12،13،14،15 ، فهناك حاجة غير ملباة للعزل المتزامن للعديد من مجموعات الخلايا المقيمة في الجهاز العصبي المركزي في وقت واحد. تفتقر البروتوكولات السابقة لعزل الخلايا المقيمة في الجهاز العصبي المركزي إلى الحفاظ على الوظائف الخلوية والنقاء ، مما يؤدي إلى الزراعة المشتركة مع الخلايا المجاورة16،17،18 أو عدم ملاءمة التحليلات المعقدة للشبكات داخل الخلايا خارج الجسم الحي19،20،21،22.
كان الهدف من هذا البروتوكول هو إنشاء طريقة قابلة للتكرار وشاملة للعزل المتزامن للمعلقات أحادية الخلية النقية القابلة للحياة لجميع أنواع الخلايا الرئيسية المقيمة في الجهاز العصبي المركزي المطبقة على الفئران البالغة السليمة و EAE. تم عزل أنواع الخلايا المختلفة باستخدام فرز الخلايا المنشط مغناطيسيا (MACS)23. يمكن تحقيق فصل الخلايا إما عن طريق الانتقاء الإيجابي ، أي وضع العلامات المغناطيسية لعلامات السطح الخاصة بنوع الخلية ، أو عن طريق الاختيار السلبي عن طريق البيوتينيل واستنفاد جميع الخلايا غير المرغوب فيها. تم تطبيق قياس التدفق الخلوي لضمان نقاء أعلى من 90٪ وصلاحية 80٪ على الأقل من المعلقات أحادية الخلية المعزولة.
في الختام ، كان الهدف الرئيسي هو إنشاء بروتوكول للعزل المتزامن لجميع أنواع الخلايا الرئيسية المقيمة في الجهاز العصبي المركزي كأداة متعددة الاستخدامات للتحقيق في مسارات الالتهاب العصبي التي تقدم تحليلا شاملا ودقيقا للشبكات الخلوية المعقدة وشلالات الإشارات الكيميائية الحيوية في الفئران السليمة و EAE.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>70 &#956;m cell strainers</td>
			<td>Corning, MA, USA</td>
			<td>352350</td>
			<td>CNS tissue dissociation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACSA-2 Antibody, anti-mouse, PE-Vio 615 (clone REA-969)</td>
			<td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany</td>
			<td>130-116-244</td>
			<td>Flow cytometry, store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adult Brain Dissociation Kit, mouse, and rat</td>
			<td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany</td>
			<td>130-107-677</td>
			<td>Tissue dissociation,contains debris and red blood cell removal solutions; prepare aliquots of enzyme A and P upon arrival and store them at -20 &#176;C; store the remaining kit at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-ACSA-2 MicroBead Kit, mouse</td>
			<td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany</td>
			<td>130-097-678</td>
			<td>MACS of astrocytes, store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD16/32 antibody&#160;</td>
			<td>BioLegend, London, UK</td>
			<td>101301</td>
			<td>Flow cytometry, store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-O4 MicroBeads, human, mouse, rat</td>
			<td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany</td>
			<td>130-094-543</td>
			<td>MACS of oligodendrocytes, store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AstroMACS Separation buffer</td>
			<td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany</td>
			<td>130-091-221</td>
			<td>MACS of astrocytes, store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin Antibody, PE (clone Bio3-18E7)</td>
			<td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany</td>
			<td>130-113-853</td>
			<td>Flow cytometry, store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BRAND Neubauer counting chamber</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA</td>
			<td>10195580</td>
			<td>Cell counting&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Violet 510 anti-mouse CD45 Antibody (clone 30-F11)</td>
			<td>BioLegend, London, UK</td>
			<td>103137</td>
			<td>Flow cytometry, store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD11b MicroBeads, human, mouse</td>
			<td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany</td>
			<td>130-049-601</td>
			<td>MACS of microglia, store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse I, recombinant, Rnase-free</td>
			<td>Merck KGaA, Darmstadt, Germany</td>
			<td>4716728001</td>
			<td>Flow cytometry, store at -20&#176; C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-PBS with Calcium, Magnesium, Glucose, Pyruvat</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA</td>
			<td>14287080</td>
			<td>Buffer, store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-PBS, without calcium, without magnesium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA</td>
			<td>14190250</td>
			<td>Buffer, store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eBioscience Fixable Viability Dye eFluor 780</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA</td>
			<td>65-0865-14</td>
			<td>Flow cytometry, store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eBioscience Foxp3/Transcription factor staining buffer set</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA</td>
			<td>00-5523-00</td>
			<td>Flow cytometry, store at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon (15 mL)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA</td>
			<td>11507411</td>
			<td>Cell tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon (50 mL)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA</td>
			<td>10788561</td>
			<td>Cell tube&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon&#160;Round-Bottom Polystyrene Test Tubes with Cell Strainer Snap Cap, 5 mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA</td>
			<td>08-771-23</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FcR Blocking Reagent, mouse&#160;</td>
			<td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany</td>
			<td>130-092-575</td>
			<td>MACS of oligodendrocytes, store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Female C57BL/6J mice</td>
			<td>Charles River Laboratories, Sulzfeld, Germany</td>
			<td></td>
			<td>Active EAE induction&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal calf serum (FCS)</td>
			<td>Merck KGaA, Darmstadt, Germany</td>
			<td>F2442-50ML</td>
			<td>Flow cytometry, store at -5 to -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Rat Anti-CD 11b&#160; (clone M1/70)</td>
			<td>BD Biosciences, San Jose, CA, USA</td>
			<td>553310</td>
			<td>Flow cytometry, store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freund&#8217;s Complete adjuvant</td>
			<td>Merck KGaA, Darmstadt, Germany</td>
			<td>AR001</td>
			<td>Active EAE induction, store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GentleMACS C Tubes</td>
			<td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany</td>
			<td>130-093-237</td>
			<td>CNS tissue dissociation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GentleMACS Octo Dissociator with Heaters</td>
			<td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany</td>
			<td>130-096-427</td>
			<td>CNS tissue dissociation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphpad Prism 8.4.3</td>
			<td>Graphpad by Dotmatics</td>
			<td></td>
			<td>Graphical Analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>AbbVie, North Chicago, IL, USA</td>
			<td></td>
			<td>Active EAE induction, store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kaluza Analysis Software V2.1.1</td>
			<td>Beckman Coulter, Indianapolis, IN, USA</td>
			<td></td>
			<td>Flow cytometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS Columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td>MACS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS BSA Stock Solution</td>
			<td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany</td>
			<td>130-091-376</td>
			<td>PB-buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS MultiStand</td>
			<td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany</td>
			<td>130-042-303</td>
			<td>MACS&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOG35&#8211;55 peptide</td>
			<td>Charit&#233;, Berlin, Germany; alternatives: Genosphere Biotechnologies (Paris, France) or sb-Peptide (Saint Egr&#232;ve, France)</td>
			<td></td>
			<td>Active EAE induction, store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mycobacterium tuberculosis strain H37 Ra</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company (BD),Franklin Lakes, NJ, USA</td>
			<td></td>
			<td>Active EAE induction, store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neuron Isolation Kit, mouse&#160;</td>
			<td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany</td>
			<td>130-115-390</td>
			<td>MACS of neurons, store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O4 Antibody, anti-human/mouse/rat, APC, (clone REA-576)</td>
			<td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany</td>
			<td>130-119-897</td>
			<td>Flow cytometry, store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pertussis toxin in glycerol</td>
			<td>Hooke Laboratories Inc., Lawrence, MA, USA</td>
			<td>BT-0105</td>
			<td>Active EAE induction; store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pluriStrainer Mini 100 &#956;m&#160;</td>
			<td>pluriSelect Life Science UG, Leipzig, Sachsen, Germany</td>
			<td>43-10100-40</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuadroMACS Separator&#160;</td>
			<td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany</td>
			<td>130-090-976</td>
			<td>MACS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Alexa Fluor 647 Anti-NeuN antibody (clone EPR12763)</td>
			<td>Abcam, Cambridge, UK</td>
			<td>EPR12763</td>
			<td>Flow cytometry, store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless Steel Brain Matrices, 1 mm</td>
			<td>Ted Pella, Redding, CA, USA</td>
			<td>15067</td>
			<td>CNS tissue dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue solution, 0.4%</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA</td>
			<td>15250061</td>
			<td>Cell counting&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure 0.5&#160;M EDTA, pH 8.0</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA</td>
			<td>15575020</td>
			<td>Flow cytometry, store at room temperature</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

simultaneous isolation of principal central nervous system-resident cell types from adult autoimmune encephalomyelitis mice

التهاب الدماغ والنخاع المناعي الذاتي التجريبي (EAE) هو نموذج الفئران الأكثر شيوعا لمرض التصلب المتعدد (MS) وكثيرا ما يستخدم لزيادة توضيح مسببات مرض التصلب العصبي المتعدد التي لا تزال غير معروفة من أجل تطوير استراتيجيات علاج جديدة. يقوم نموذج EAE للبروتين السكري قليل التغصن المايلين 35-55 (MOG35-55) بإعادة إنتاج مسار مرض أحادي الطور ذاتي الحد مع شلل تصاعدي في غضون 10 أيام بعد التحصين. يتم فحص الفئران يوميا باستخدام نظام التسجيل السريري. يتم تحفيز مرض التصلب العصبي المتعدد من خلال آليات مرضية مختلفة ذات نمط زمني محدد ، وبالتالي فإن التحقيق في دور أنواع الخلايا المقيمة في الجهاز العصبي المركزي (CNS) أثناء تطور المرض له أهمية كبيرة. الميزة الفريدة لهذا البروتوكول هي العزل المتزامن لجميع أنواع الخلايا الرئيسية المقيمة في الجهاز العصبي المركزي (الخلايا الدبقية الصغيرة ، oligodendrocytes ، الخلايا النجمية ، والخلايا العصبية) المطبقة على EAE البالغة والفئران السليمة. يتبع تفكك الدماغ والحبل الشوكي عن الفئران البالغة فرز الخلايا المنشط مغناطيسيا (MACS) لعزل الخلايا الدبقية الصغيرة والخلايا قليلة التغصن والخلايا النجمية والخلايا العصبية. تم استخدام قياس التدفق الخلوي لإجراء تحليلات الجودة للمعلقات أحادية الخلية المنقاة التي تؤكد الصلاحية بعد عزل الخلية وتشير إلى نقاء كل نوع من الخلايا بنسبة 90٪ تقريبا. في الختام ، يقدم هذا البروتوكول طريقة دقيقة وشاملة لتحليل الشبكات الخلوية المعقدة في الفئران السليمة و EAE. علاوة على ذلك ، يمكن تقليل أعداد الفئران المطلوبة بشكل كبير حيث يتم عزل جميع أنواع الخلايا الأربعة من نفس الفئران.

Simultaneous Isolation of Principal Central Nervous System-Resident Cell Types from Adult Autoimmune Encephalomyelitis Mice

يوفر البروتوكول الحالي إمكانية عزل جميع الخلايا الرئيسية المقيمة في الجهاز العصبي المركزي في وقت واحد ، أي الخلايا الدبقية الصغيرة ، والخلايا قليلة التغصن ، والخلايا النجمية ، والخلايا العصبية من نسخة واحدة من الجهاز العصبي المركزي. هذا مهم لتقليل أعداد الفئران اللازمة لهذه الأنواع من التجارب ولضمان إمكانية مقارنة التحليلات الجزيئية والكيميائية الحيوية على المستوى الخلوي. إذا تم عزل أنواع الخلايا الفردية من نسخ مختلفة من الجهاز العصبي المركزي ، فلا يمكن تعيين التفاعلات الخلوية بصدق ويمكن أن تؤدي الانحرافات التقنية المحتملة أثناء عمليات العزل إلى تحيز المزيد من التحليلات النهائية. بالإضافة إلى ذلك ، لن تكون النتائج الجزيئية والكيميائية الحيوية من كل نوع من الخلايا قابلة للمقارنة مع بعضها البعض لأنها ليست مشتقة من نفس سياق EAE. تم تكييف بروتوكول MACS موجود مسبقا باستخدام نظام / مجموعة تجارية لتمكين العزل المتزامن لأنواع الخلايا المذكورة أعلاه.
تم إجراء عزل الخلايا الدبقية الصغيرة باستخدام حبيبات دقيقة مضادة ل CD11b ، وتم عزل الخلايا قليلة التغصن عن طريق حبات دقيقة مضادة ل O4 (الجدول 1) ، وتم استخدام حبيبات دقيقة مضادة ل ACSA-2 لعزل الخلايا النجمية (الجدول 2). في المقابل ، يمثل عزل الخلايا العصبية اختيارا سلبيا وقد تم إنجازه عن طريق البيوتينيل ووضع العلامات المغناطيسية لجميع الخلايا غير العصبية (الجدول 2). يمكن تسمية جميع الخلايا غير العصبية (على سبيل المثال ، oligodendrocytes ، الخلايا الدبقية الصغيرة ، الخلايا النجمية ، الخلايا البطانية ، والخلايا الليفية) باستثناء خلايا الدم مغناطيسيا باستخدام جسم مضاد مقترن بالبيوتين ، موجه بشكل خاص ضد مستضد سطحي معبر عنه على هذه الخلايا غير العصبية (الجدول 2). من خلال استنفاد هذه الخلايا غير العصبية المسماة مغناطيسيا ، يمكن توليد مجموعات خلايا عصبية نقية للغاية وقابلة للحياة30،42،43.
تم تصميم لوحين جديدين لقياس التدفق الخلوي لتحليل نقاء المعلقات أحادية الخلية المتولدة. هنا ، تم استخدام علامات السطح والعلامات النووية الخاصة بنوع الخلية جنبا إلى جنب مع تمييز الخلايا الحية / الميتة.
تم تحليل إنتاجية الخلايا الناتجة لكل فأر ونوع الخلية (الشكل 3 أ) وأدت إلى متوسط 8. 4 × 105 ± 3 × 104 الخلايا الدبقية الصغيرة ، 3.23 × 106 ± 1 × 105 oligodendrocytes ، 8.6 × 105 ± 2 × 104 الخلايا النجمية ، و 4.5 × 105 ± 1 × 104 خلايا عصبية لكل فأر ساذج.
في سياق الهدف المتمثل في التحقيق في نماذج مرض التهاب الأعصاب ، تم تطبيق البروتوكول أيضا على نموذج فأر EAE. تم القتل الرحيم للفئران في اليوم 16 بعد تحريض EAE الذي يمثل الحد الأقصى للمرض. في إعداد EAE هذا ، تم عزل ما يقرب من 2.9 × 106 ± 6.7 × 105 خلايا قليلة التغصن ، 5.2 × 105 ± 9 × 104 خلايا نجمية و 4.4 × 105 ± 4 ×10 4 خلايا عصبية. انخفض إنتاج الخلايا الدبقية الصغيرة إلى ما يقرب من 1.7 × 105 ± 4 × 104 الخلايا الدبقية الصغيرة لكل ماوس EAE بسبب فرز الخلايا الإضافي بعد خطوات MACS (الشكل 3A).
بعد العزل، أثبتت توصيفات النمط الظاهري لمجموعات الخلايا المختلفة عن طريق قياس التدفق الخلوي أنه يمكن تحقيق معلقات أحادية الخلية قابلة للحياة بنقاوة تقارب 90٪ لجميع أنواع الخلايا الرئيسية المقيمة في الجهاز العصبي المركزي (الشكل 3 ب). كانت الخلايا الدبقية الصغيرة مغلقة على أنها CD45intCD11bعالية كما هو محدد في الأدبيات44،45،46،47.
في EAE ، كان لا بد من فرز الخلايا الدبقية الصغيرة من جميع خلايا CD11b + لتمييزها عن الخلايا المناعية الأخرى CD11b + مثل الخلايا الوحيدة ، والعدلات ، والخلايا القاتلة الطبيعية ، والخلايا المحببة ، والبلاعم التي تهاجر إلى الجهاز العصبي المركزي أثناء الالتهاب العصبي27،28،48. لذلك ، تم فرز الخلايا الدبقية الصغيرة على أنها خلاياعالية CD45intCD11 من تعليق خلية CD11b +. يوضح الشكل 4 استراتيجية فرز الخلايا الدبقية الصغيرة بأكملها. في الفئران الساذجة ، كان عدد الخلايا الدبقية الصغيرة 91.16٪ من جميع الخلايا المفردة الحية (96٪ من إجمالي CD11b + السكان) (الشكل 4 أ). في فئران EAE ، كان عدد الخلايا الدبقية الصغيرة 46.85٪ من جميع الخلايا المفردة الحية (55٪ من إجمالي CD11b + السكان) (الشكل 4B). على الرغم من أن كلا من إجراءات MACS و FACS تطبق الإجهاد الميكانيكي على الخلايا المفردة ، إلا أن 75.41٪ ± 8.63٪ من الخلايا الدبقية الصغيرة المنقاة المصنفة كانت قابلة للحياة (الشكل 3B).
أظهرت الخلايا النجمية والخلايا العصبية التي تم عزلها مباشرة من تعليق خلايا الجهاز العصبي المركزي الأولي تلوثا ذا صلة بالخلايا قليلة التغصن مما أدى إلى افتراض أن العزل المتزامن للخلايا العصبية والخلايا النجمية من التدفق السلبي للخلايا قليلة التغصن يمكن أن يمنع هذا التلوث. أكدت تحليلات قياس التدفق الخلوي أن الخلايا النجمية المعزولة من التدفق السلبي للخلايا قليلة التغصن كانت نقاوتها 89.23٪ ± 2.78٪ وأظهرت قابلية للحياة بنسبة 80.56٪ ± 1.41٪. على غرار هذه النتائج ، كان نقاء الخلايا العصبية المعزولة من جزء الخلية O4 81.25٪ ± 3.31٪ وكانت الصلاحية 83.90٪ ± 2.61٪ (الشكل 3B). تؤكد هذه النتائج أيضا أن العزل المتزامن لهذين النوعين من الخلايا فقط بعد عزل الخلايا قليلة التغصن ليس له أي تأثير على كمية الخلايا الوظيفية القابلة للحياة.
كانت النتائج المتعلقة بصلاحية ونقاء المعلقات أحادية الخلية المعزولة متشابهة جدا في الفئران EAE مقارنة بتلك التي تم تلقيها في الفئران الساذجة مما يؤكد أن هذا البروتوكول مناسب للفئران السليمة وكذلك في سياق EAE (الشكل 3B).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65735/65735fig03.jpg"> الشكل 3: إنتاجية الخلايا والتحقق القائم على قياس التدفق الخلوي للخلايا المعزولة المقيمة في الجهاز العصبي المركزي. (أ) تنتج الخلية لكل فأر ونوع الخلية بعد عزل الخلايا المقيمة في الجهاز العصبي المركزي في الفئران الساذجة و EAE. تصور الرسوم البيانية الشريطية مقدار إنتاجية الخلية لكل ماوس ونوع الخلية بعد تنفيذ البروتوكول المقدم. تمت معالجة خمسة مكررات بيولوجية للنتائج في الفئران الساذجة ، وتم تحليل أربعة مكررات بيولوجية في فئران EAE. يتم تصوير الوسائل ذات الصلة ± SEMs. (ب) تحليلات النقاء والصلاحية المقابلة لكسور الخلايا المنقاة. تشير الرسوم البيانية الشريطية إلى صلاحية ونقاء المعلقات أحادية الخلية الناتجة بناء على تعبيرها عن العلامات الخاصة بنوع الخلية. تم استخدام NeuN كعلامة نووية محددة لنوع الخلية للخلايا العصبية. تم الحصول على خمس نسخ بيولوجية مكررة ومقارنتها لكل نوع من الخلايا لكل من الفئران السليمة و EAE. يشار إلى الوسائل ذات الصلة ± SEMs. الاختصارات: Anti-ACSA-2 = مستضد سطح الخلية النجمية -2 ؛ CD11b = كيناز 11B المعتمد على السيكلين ؛ CD45 = مستقبلات التيروزين البروتين الفوسفاتيز C ؛ الجهاز العصبي المركزي = الجهاز العصبي المركزي. EAE = التهاب الدماغ والنخاع المناعي الذاتي التجريبي. MACS = فرز الخلايا المنشط مغناطيسيا ؛ NeuN = بروتين ربط الحمض النووي الريبي fox-1 متجانس 3 ؛ O4 = علامة الخلايا قليلة التغصن O4 ؛ SEM = خطأ قياسي للمتوسط. وقد عدل هذا الرقم من49. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65735/65735fig03large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65735/65735fig04.jpg"> الشكل 4: استراتيجية البوابات لفرز الخلايا الدبقية الصغيرة بعد عزل خلايا CD11b +. (أ) استراتيجية البوابات في الفئران الساذجة و (ب) الفئران EAE. يظهر الصف العلوي من كل لوحة مخططات نقطية قبل الفرز والصف السفلي بعد الفرز. بعد اختيار الخلايا الحية (SSC-A / FSC-A) والخلايا المفردة (FCS-H / FSC-W) ، تم فرز سكان خلايا CD45intCD11b + كمجموعات من الخلايا الدبقية الصغيرة. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65735/65735fig04large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Studying Neuroinflammatory Pathways Through Simultaneous Isolation of All Main CNS-Resident Cell Types at JoVE.com

Studying Neuroinflammatory Pathways Through Simultaneous Isolation of All Main CNS-Resident Cell Types (Video) | JoVE

حتى الآن ، تعد بروتوكولات العزل المتزامن لجميع أنواع الخلايا الرئيسية المقيمة في الجهاز العصبي المركزي من نفس الفأر طلبا غير ملباة. يظهر البروتوكول إجراء قابلا للتطبيق في الفئران الساذجة والتجريبية لالتهاب الدماغ والنخاع المناعي الذاتي للتحقيق في الشبكات الخلوية المعقدة أثناء الالتهاب العصبي وتقليل أعداد الفئران المطلوبة في نفس الوقت.

العزل المتزامن لأنواع الخلايا المقيمة في الجهاز العصبي المركزي الرئيسي من الفئران المصابة بالتهاب الدماغ والنخاع المناعي الذاتي للبالغين

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is the most common murine model for multiple sclerosis (MS) and is frequently used to further elucidate ...

للتحقيق في الآليات الجزيئية والخلوية في أمراض المناعة الذاتية مثل التصلب المتعدد ، فإن إنشاء بروتوكولات عزل الخلايا القابلة للتكرار والمتطورة هو حاجة غير ملباة. تظهر معظم التقنيات الحالية لعزل وتحليل الخلايا المقيمة في الجهاز العصبي المركزي أوجه قصور خطيرة ، مثل التركيز على نوع واحد فقط من الخلايا أو الفئران بعد الولادة فقط. يوفر البروتوكول الحالي للعزل المتزامن لجميع أنواع الخلايا الرئيسية المقيمة في الجهاز العصبي المركزي من نسخة متماثلة واحدة من الجهاز العصبي المركزي إمكانية تحليل الشبكات العصبية المعقدة والمسارات الالتهابية الجديدة ، خارج الجسم الحي من تعليق خلية واحدة ، ينطبق على الفئران السليمة وتلك التي تعاني من التهاب الدماغ والنخاع المناعي الذاتي التجريبي.بالإضافة إلى ذلك ، يتم تقليل أعداد الفئران يمكن استخدام بروتوكولنا للعزل المتزامن لجميع أنواع الخلايا الأربعة الرئيسية المقيمة في الجهاز العصبي المركزي في الفئران السليمة و EAE كأداة مفيدة للمجموعات البحثية التي تدرس مسارات التهابية جديدة ، مما يسمح بتحليل أكثر دقة للآليات الجزيئية الحيوية المعقدة والشبكات الخلوية خارج الجسم الحي. الأسئلة العلمية الجديدة التي يمكن الإجابة عليها بمساعدة بروتوكولنا هي التحقيقات الديناميكية في EAE خلال مراحل مختلفة من مسار المرض ، مثل الالتهاب العصبي والتنكس العصبي والمغفرة. أيضا ، يمكن دراسة تفاعلات الخلايا الخلوية والمسارات الكيميائية الحيوية على المستوى الفردي.وبالمثل ، يمكن إجراء المقايسات الوظيفية مع الخلايا المزروعة. نعتزم التركيز على الدراسات الديناميكية لدورة EAE للتحليل متعدد الأوميك من تجانس الجهاز العصبي المركزي الفردي لكل نقطة زمنية EAE.