Name: Studying Neuroinflammatory Pathways Through Simultaneous Isolation of All Main CNS-Resident Cell Types (Video) | JoVE
Uploaded: 2023-10-06T13:40:00
Duration: 2 min
Description: Watch this Scientific Journal Video about Studying Neuroinflammatory Pathways Through Simultaneous Isolation of All Main CNS-Resident Cell Types at JoVE.com

Figurerna skapades med hjälp av Adobe Illustrator (version 2023) och Servier Medical Art (https://smart.servier.com). Antonia Henes fick stöd av Jürgen Manchot Stiftung.

Isolating All CNS Resident Cell Types Simultaneously from Autoimmune Mice

Samtliga författare uppger att de inte har några intressekonflikter.

Hittills har metoder för att kartlägga CNS-residenta celler ex vivo genom att kombinera masspektrometri och RNA-sekvensering erbjudit en mycket exakt cellulär profilering inom hälsa och sjukdom, men kräver ambitiös teknisk kunskap och expertis inom detta område50,51. Dessutom tillåter de inte funktionella analyser och är mycket dyra. Utöver det ger mikrofluidiska brain-on-a-chip-system en snabb och prisvärd screening för sjukdomsmekanismer och testning av nya terapeutiska metoder med begränsning av celltillväxt och migration 52,53,54,55. CNS-organoider kan också utgöra ett likvärdigt alternativ i framtiden för undersökning av cellulär modellering, intercellulära kopplingar och interaktioner under sjukdomsförlopp 56,57,58,59. Fluorescens- och magnetaktiverad cellsortering är dock för närvarande de mest effektiva metoderna för att generera rena och livskraftiga encellssuspensioner ex vivo 35,60,61. Även om andra etablerade tillverkningsprotokoll för isolering av CNS-residenta celltyper är likartade när det gäller de enskilda stegen i den magnetiska isoleringen och den tidigare celldissociationen, är de avsedda att utföras separat för varje celltyp. I det nuvarande protokollet integreras däremot olika isoleringsmetoder för varje celltyp med CNS-hemvist i ett logiskt sammanhang så att de kan utföras samtidigt på en gång och från en enda CNS-cellsuspension (tabell 1, tabell 2). Således möjliggör det multi-omics-analyser från en enda CNS-cellsuspension och, så småningom, utforskning av komplexa neuronala nätverk. Även om det inte är ett måste att poola flera vävnader från flera djur för att utföra detta protokoll, säkerställer denna poolning ett tillräckligt antal isolerade celler för vidare nedströmsanalys. Användningen av olika möss för isolering av de enskilda celltyperna skulle utesluta möjligheten att analysera potentiella cellulära interaktioner. Genom att kombinera individuella isoleringsmetoder för de olika CNS-celltyperna, som alla följer en tidigare CNS-dissociation, sparar man dessutom materialkostnader genom att använda en dissocierad CNS-cellsuspension för alla följande magnetiska isoleringssteg. Dessutom minimeras en potentiell teknisk bias som orsakas av användningen av olika möss.
En begränsning i protokollet kan vara den nästan uteslutande användningen av C57BL/6J-möss av honkön. EAE-immuniseringsprotokollet har utformats och etablerats för honmöss, så detta cellisoleringsprotokoll implementerades även på honmöss av typen C57BL/6J. Ändå användes även naiva hanmöss under utvecklingen av detta protokoll, utan att känna igen någon effekt på det resulterande cellantalet eller renheten. En annan restriktion påverkar den magnetiska cellisoleringen av neuroner eftersom det inte finns några specifika mikrokulor för isolering av neuroner i form av ett positivt urval. Det antogs att en ren encellssuspension kunde erhållas genom biotinmärkning och utarmning av alla icke-neuronala celler (tabell 2). Detta antagande verifierades genom användningen av NeuN som en specifik nukleär markör för neuroner, integrerad i den nämnda flödescytometrins renhetspanel. En annan begränsning gäller isoleringen av mikroglia hos EAE-möss. Här minskar den resulterande cellavkastningen jämfört med de andra celltyperna på grund av det extra sorteringssteget efter MACS-protokollet. Dessutom kan man hävda att sortering ökar den mekaniska spänningen i mikroglia jämfört med de andra cellpopulationerna. Individuella sorteringsstrategier kan leda till olika mängder cellutbyte. Om det isolerade cellantalet är mindre än förväntat eller önskvärt rekommenderar vi att du justerar grindinställningen och/eller förbättrar diskrimineringen mellan levande och döda.
Ett kritiskt steg i protokollet är avlägsnandet av skräp. Gradienten måste skiktas mycket långsamt och försiktigt för att skapa de tre önskade separata faserna (figur 2A). Endast om myelinet och andra rester av skräp i de två översta faserna avlägsnas helt (figur 2E) kan rena encellssuspensioner genereras och ytterligare kontaminering minskas. Om de resulterande cellsuspensionerna saknar renhet, är detta förmodligen den del av protokollet som bör förbättras först efter försäkran om korrekt användning av alla mikropärlor.
Att få höga nivåer i renhet och livskraft kan vara utmanande i denna typ av experiment. Några rekommendationer för felsökning är:
-Arbete under sterila förhållanden är obligatoriskt för att förhindra kontaminering av de olika mikrokulorna och möjliggöra upprepad användning, särskilt för efterföljande odling. -Märkning av varje rör för att förhindra förväxlingar rekommenderas starkt. -Undvik användning av okylda reagenser/buffertar. Förvara alla cellsuspensioner på is under hela experimentet för att säkerställa hög livskraft. -Håll tiden mellan de olika arbetsmomenten så kort som möjligt. Det finns ingen specifik del i protokollet där det rekommenderas att pausa experimentet. -Det är högst relevant att hålla sig till de angivna inkubationstiderna.
Sammanfattningsvis erbjuder detta nuvarande protokoll för samtidig isolering av alla huvudcelltyper som är bosatta i CNS från ett CNS-replikat möjligheten att analysera komplexa neuronala nätverk och neuroinflammatoriska vägar ex vivo från en CNS-cellsuspension. Således kan CNS-residenta celler undersökas under olika stadier av sjukdomsförlopp, t.ex. under neuroinflammation, neurodegeneration och/eller remission i EAE. Dessutom kan cell-cellinteraktioner och biokemiska vägar studeras på individnivå och variabiliteten inom experimentella grupper kan minskas. Det finns också möjlighet att odla fraktioner av de isolerade CNS-cellerna i monokulturer för ytterligare funktionella analyser och validering. Sammantaget erbjuder detta protokoll betydande framsteg som potentiellt påverkar prekliniska och kliniska forskningsmetoder.

Multipel skleros (MS) är en kronisk inflammatorisk autoimmun sjukdom i centrala nervsystemet (CNS) som kännetecknas av demyelinisering, axonal skada, glios och neurodegeneration. Trots många forskningsmetoder inom detta område är patofysiologin vid MS fortfarande inte helt klarlagd 1,2,3,4. Den vanligaste djurmodellen för att undersöka MS är myelinoligodendrocytglykoproteinpeptid 35-55 (MOG35-55)-inducerad experimentell autoimmun encefalomyelit (EAE) som delar många av dess kliniska och patofysiologiska egenskaper 5,6,7,8,9 . Den är baserad på immunsystemets svar mot CNS-specifika antigener som leder till inflammation, demyelinisering och neuroaxonal degeneration. Experimentell autoimmun encefalomyelit (EAE) är en lämplig modell för undersökning av neuroinflammatoriska vägar och signalkaskader som finns vid MS.
Nuvarande behandlingsalternativ för MS är endast delvis effektiva och fokuserar främst på den initiala inflammatoriska fasen av sjukdomen. Den neurodegenerativa komponenten av MS verkar dock vara den största utmaningen för långsiktiga terapeutiska metoder. Därför krävs reproducerbara och exakta cellisoleringsprotokoll för att undersöka molekylära och cellulära mekanismer i autoimmuna sjukdomar på ett heltäckande sätt. Även om det finns vissa protokoll för isolering av en enda celltyp 10,11,12,13,14,15, finns det ett otillfredsställt behov av samtidig isolering av flera CNS-residenta cellpopulationer samtidigt. Tidigare protokoll för isolering av CNS-residenta celler brister i att bevara cellulär funktionalitet och renhet, vilket resulterar i samodling med närliggande celler 16,17,18 eller olämplighet för komplexa analyser av intracellulära nätverk ex vivo19,20,21,22.
Syftet med detta protokoll var att etablera en reproducerbar och heltäckande metod för samtidig isolering av rena, livsdugliga encellssuspensioner av alla de viktigaste CNS-residenta celltyperna som är tillämpliga på vuxna friska möss och EAE-möss. De olika celltyperna isolerades med hjälp av magnetaktiverad cellsortering (MACS)23. Cellseparationen kan åstadkommas antingen genom positiv selektion, dvs magnetisk märkning av celltypsspecifika ytmarkörer, eller genom negativ selektion via biotinylering och utarmning av alla oönskade celler. Flödescytometri tillämpades för att säkerställa en renhet på över 90 % och en viabilitet på minst 80 % av de isolerade encellssuspensionerna.
Sammanfattningsvis var huvudmålet att etablera ett protokoll för samtidig isolering av alla huvudcelltyper som är bosatta i CNS som ett mångsidigt verktyg för undersökning av neuroinflammatoriska vägar som erbjuder en omfattande och exakt analys av komplexa cellulära nätverk och biokemiska signalkaskader i friska möss och EAE-möss.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>70 &#956;m cell strainers</td>
			<td>Corning, MA, USA</td>
			<td>352350</td>
			<td>CNS tissue dissociation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACSA-2 Antibody, anti-mouse, PE-Vio 615 (clone REA-969)</td>
			<td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany</td>
			<td>130-116-244</td>
			<td>Flow cytometry, store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adult Brain Dissociation Kit, mouse, and rat</td>
			<td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany</td>
			<td>130-107-677</td>
			<td>Tissue dissociation,contains debris and red blood cell removal solutions; prepare aliquots of enzyme A and P upon arrival and store them at -20 &#176;C; store the remaining kit at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-ACSA-2 MicroBead Kit, mouse</td>
			<td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany</td>
			<td>130-097-678</td>
			<td>MACS of astrocytes, store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD16/32 antibody&#160;</td>
			<td>BioLegend, London, UK</td>
			<td>101301</td>
			<td>Flow cytometry, store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-O4 MicroBeads, human, mouse, rat</td>
			<td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany</td>
			<td>130-094-543</td>
			<td>MACS of oligodendrocytes, store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AstroMACS Separation buffer</td>
			<td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany</td>
			<td>130-091-221</td>
			<td>MACS of astrocytes, store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin Antibody, PE (clone Bio3-18E7)</td>
			<td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany</td>
			<td>130-113-853</td>
			<td>Flow cytometry, store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BRAND Neubauer counting chamber</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA</td>
			<td>10195580</td>
			<td>Cell counting&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Violet 510 anti-mouse CD45 Antibody (clone 30-F11)</td>
			<td>BioLegend, London, UK</td>
			<td>103137</td>
			<td>Flow cytometry, store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD11b MicroBeads, human, mouse</td>
			<td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany</td>
			<td>130-049-601</td>
			<td>MACS of microglia, store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse I, recombinant, Rnase-free</td>
			<td>Merck KGaA, Darmstadt, Germany</td>
			<td>4716728001</td>
			<td>Flow cytometry, store at -20&#176; C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-PBS with Calcium, Magnesium, Glucose, Pyruvat</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA</td>
			<td>14287080</td>
			<td>Buffer, store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-PBS, without calcium, without magnesium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA</td>
			<td>14190250</td>
			<td>Buffer, store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eBioscience Fixable Viability Dye eFluor 780</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA</td>
			<td>65-0865-14</td>
			<td>Flow cytometry, store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eBioscience Foxp3/Transcription factor staining buffer set</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA</td>
			<td>00-5523-00</td>
			<td>Flow cytometry, store at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon (15 mL)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA</td>
			<td>11507411</td>
			<td>Cell tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon (50 mL)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA</td>
			<td>10788561</td>
			<td>Cell tube&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon&#160;Round-Bottom Polystyrene Test Tubes with Cell Strainer Snap Cap, 5 mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA</td>
			<td>08-771-23</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FcR Blocking Reagent, mouse&#160;</td>
			<td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany</td>
			<td>130-092-575</td>
			<td>MACS of oligodendrocytes, store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Female C57BL/6J mice</td>
			<td>Charles River Laboratories, Sulzfeld, Germany</td>
			<td></td>
			<td>Active EAE induction&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal calf serum (FCS)</td>
			<td>Merck KGaA, Darmstadt, Germany</td>
			<td>F2442-50ML</td>
			<td>Flow cytometry, store at -5 to -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Rat Anti-CD 11b&#160; (clone M1/70)</td>
			<td>BD Biosciences, San Jose, CA, USA</td>
			<td>553310</td>
			<td>Flow cytometry, store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freund&#8217;s Complete adjuvant</td>
			<td>Merck KGaA, Darmstadt, Germany</td>
			<td>AR001</td>
			<td>Active EAE induction, store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GentleMACS C Tubes</td>
			<td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany</td>
			<td>130-093-237</td>
			<td>CNS tissue dissociation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GentleMACS Octo Dissociator with Heaters</td>
			<td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany</td>
			<td>130-096-427</td>
			<td>CNS tissue dissociation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphpad Prism 8.4.3</td>
			<td>Graphpad by Dotmatics</td>
			<td></td>
			<td>Graphical Analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>AbbVie, North Chicago, IL, USA</td>
			<td></td>
			<td>Active EAE induction, store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kaluza Analysis Software V2.1.1</td>
			<td>Beckman Coulter, Indianapolis, IN, USA</td>
			<td></td>
			<td>Flow cytometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS Columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td>MACS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS BSA Stock Solution</td>
			<td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany</td>
			<td>130-091-376</td>
			<td>PB-buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS MultiStand</td>
			<td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany</td>
			<td>130-042-303</td>
			<td>MACS&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOG35&#8211;55 peptide</td>
			<td>Charit&#233;, Berlin, Germany; alternatives: Genosphere Biotechnologies (Paris, France) or sb-Peptide (Saint Egr&#232;ve, France)</td>
			<td></td>
			<td>Active EAE induction, store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mycobacterium tuberculosis strain H37 Ra</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company (BD),Franklin Lakes, NJ, USA</td>
			<td></td>
			<td>Active EAE induction, store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neuron Isolation Kit, mouse&#160;</td>
			<td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany</td>
			<td>130-115-390</td>
			<td>MACS of neurons, store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O4 Antibody, anti-human/mouse/rat, APC, (clone REA-576)</td>
			<td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany</td>
			<td>130-119-897</td>
			<td>Flow cytometry, store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pertussis toxin in glycerol</td>
			<td>Hooke Laboratories Inc., Lawrence, MA, USA</td>
			<td>BT-0105</td>
			<td>Active EAE induction; store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pluriStrainer Mini 100 &#956;m&#160;</td>
			<td>pluriSelect Life Science UG, Leipzig, Sachsen, Germany</td>
			<td>43-10100-40</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuadroMACS Separator&#160;</td>
			<td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany</td>
			<td>130-090-976</td>
			<td>MACS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Alexa Fluor 647 Anti-NeuN antibody (clone EPR12763)</td>
			<td>Abcam, Cambridge, UK</td>
			<td>EPR12763</td>
			<td>Flow cytometry, store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless Steel Brain Matrices, 1 mm</td>
			<td>Ted Pella, Redding, CA, USA</td>
			<td>15067</td>
			<td>CNS tissue dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue solution, 0.4%</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA</td>
			<td>15250061</td>
			<td>Cell counting&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure 0.5&#160;M EDTA, pH 8.0</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA</td>
			<td>15575020</td>
			<td>Flow cytometry, store at room temperature</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

simultaneous isolation of principal central nervous system-resident cell types from adult autoimmune encephalomyelitis mice

Experimentell autoimmun encefalomyelit (EAE) är den vanligaste murina modellen för multipel skleros (MS) och används ofta för att ytterligare belysa den fortfarande okända etiologin för MS i syfte att utveckla nya behandlingsstrategier. Myelinoligodendrocytglykoproteinpeptid 35-55 (MOG35-55) EAE-modellen reproducerar ett självbegränsande monofasiskt sjukdomsförlopp med stigande förlamning inom 10 dagar efter immunisering. Mössen undersöks dagligen med hjälp av ett kliniskt poängsystem. MS drivs av olika patomekanismer med ett specifikt tidsmönster, varför undersökningen av vilken roll celltyper som är bosatta i centrala nervsystemet (CNS) spelar under sjukdomsprogression är av stort intresse. Det unika med detta protokoll är den samtidiga isoleringen av alla huvudsakliga CNS-residenta celltyper (mikroglia, oligodendrocyter, astrocyter och neuroner) som är tillämpliga på vuxna EAE och friska möss. Dissociationen av hjärnan och ryggmärgen från vuxna möss följs av magnetaktiverad cellsortering (MACS) för att isolera mikroglia, oligodendrocyter, astrocyter och neuroner. Flödescytometri användes för att utföra kvalitetsanalyser av de renade encellssuspensionerna som bekräftade viabilitet efter cellisolering och indikerade renheten för varje celltyp på cirka 90 %. Sammanfattningsvis erbjuder detta protokoll ett exakt och omfattande sätt att analysera komplexa cellulära nätverk i friska och EAE-möss. Dessutom kan antalet möss minskas avsevärt eftersom alla fyra celltyperna isoleras från samma möss.

Simultaneous Isolation of Principal Central Nervous System-Resident Cell Types from Adult Autoimmune Encephalomyelitis Mice

Det nuvarande protokollet erbjuder möjligheten att samtidigt isolera alla viktiga CNS-residenta celler, dvs mikroglia, oligodendrocyter, astrocyter och neuroner från ett enda CNS-replikat. Detta är viktigt för att minska antalet möss som behövs för den här typen av experiment och för att säkerställa jämförbarheten av molekylära och biokemiska analyser på cellnivå. Om de enskilda celltyperna isoleras från olika CNS-replikat kan cellulära interaktioner inte kartläggas sanningsenligt och potentiella tekniska avvikelser under isoleringsprocesserna kan snedvrida ytterligare nedströmsanalyser. Dessutom skulle molekylära och biokemiska fynd från varje celltyp inte vara jämförbara med varandra eftersom de inte härrör från samma EAE-sammanhang. Ett befintligt MACS-protokoll med hjälp av ett kommersiellt system/kit anpassades för att möjliggöra samtidig isolering av de ovan nämnda celltyperna.
Isoleringen av mikroglia utfördes med hjälp av anti-CD11b-mikropärlor, oligodendrocyter isolerades via anti-O4-mikropärlor (tabell 1) och anti-ACSA-2-mikropärlor användes för att isolera astrocyter (tabell 2). Däremot representerar isoleringen av neuroner en negativ selektion och åstadkoms genom biotinylering och magnetisk märkning av alla icke-neuronala celler (tabell 2). Alla icke-neuronala celler (t.ex. oligodendrocyter, mikroglia, astrocyter, endotelceller och fibroblaster) utom blodceller kan märkas magnetiskt med hjälp av en biotinkonjugerad antikropp, specifikt riktad mot ett ytantigen som uttrycks på dessa icke-neuronala celler (tabell 2). Genom utarmning av dessa magnetiskt märkta icke-neuronala celler kan mycket rena och livskraftiga neuronala cellpopulationer genereras 30,42,43.
Två nya flödescytometripaneler för renhetsanalyser av de genererade encellssuspensionerna designades. Här användes celltypsspecifika yt- och kärnmarkörer i kombination med diskriminering mellan levande och döda celler.
Det resulterande cellutbytet per mus och celltyp (Figur 3A) analyserades och ledde till ett genomsnitt på 8. 4 x 105 ± 3 x 104 mikroglia, 3,23 x 106 ± 1 x 105 oligodendrocyter, 8,6 x 105 ± 2 x 104 astrocyter och 4,5 x 105 ± 1 x 104 neuroner per naiv mus.
I samband med syftet att undersöka sjukdomsmodeller för neuroinflammation tillämpades protokollet även på en musmodell av EAE. Mössen avlivades på dag 16 efter EAE-induktion, vilket motsvarar sjukdomsmaximum. I denna EAE-inställning isolerades cirka 2,9 x 106 ± 6,7 x 105 oligodendrocyter, 5,2 x 105 ± 9 x 104 astrocyter och 4,4 x 105 ± 4 x 104 neuroner. Utbytet av mikrogliaceller minskade till cirka 1,7 x 105 ± 4 x 104 mikroglia per EAE-mus på grund av den extra cellsorteringen efter MACS-stegen (Figur 3A).
Efter isolering visade fenotypiska karakteriseringar av de olika cellpopulationerna via flödescytometri att livskraftiga encellssuspensioner med en renhet på cirka 90 % för alla huvudcelltyper som är bosatta i CNS (Figur 3B) kunde uppnås. Microglia var inhägnade som CD45intCD11bhigh enligt definitionen i litteraturen 44,45,46,47.
I EAE var mikroglia tvungna att sorteras från alla CD11b+-celler för att skilja dem från andra CD11b+-immunceller som monocyter, neutrofiler, naturliga mördarceller, granulocyter och makrofager som immigrerar in i CNS under neuroinflammation 27,28,48. Därför sorterades mikroglia som CD45intCD11high cells från CD11b+ cellsuspensionen. Hela sorteringsstrategin för mikroglia visas i figur 4. Hos naiva möss utgjorde mikrogliapopulationen 91,16 % av alla levande enskilda celler (96 % av den totala CD11b+-populationen) (Figur 4A). Hos EAE-möss utgjorde mikrogliapopulationen 46,85 % av alla levande enskilda celler (55 % av den totala CD11b+-populationen) (Figur 4B). Även om både MACS- och FACS-procedurer applicerar mekanisk stress på de enskilda cellerna, var 75,41 % ± 8,63 % av de sorterade renade mikroglia livskraftiga (Figur 3B).
Astrocyter och nervceller som isolerades direkt från den initiala CNS-cellsuspensionen uppvisade relevant kontaminering med oligodendrocyter, vilket ledde till antagandet att samtidig isolering av nervceller och astrocyter från det negativa flödet av oligodendrocyter kunde förhindra denna kontamination. Flödescytometrianalyser bekräftade att astrocyter isolerade från det negativa genomflödet av oligodendrocyter hade en renhet på 89,23 % ± 2,78 % och visade en viabilitet på 80,56 % ± 1,41 %. I likhet med dessa resultat var renheten hos de neuroner som isolerats från O4-cellfraktionen 81,25 % ± 3,31 % och viabiliteten var 83,90 % ± 2,61 % (figur 3B). Dessa fynd bekräftar också att samtidig isolering av dessa två celltyper först efter isolering av oligodendrocyter inte har någon inverkan på mängden livskraftiga funktionella celler.
Resultaten avseende viabiliteten och renheten hos de isolerade encelliga suspensionerna var mycket likartade hos EAE-möss jämfört med de som erhölls hos naiva möss, vilket bekräftar att detta protokoll är lämpligt för friska möss såväl som i samband med EAE (Figur 3B).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65735/65735fig03.jpg"> Figur 3: Cellutbyten och flödescytometribaserad validering av isolerade CNS-residenta celler. (A) Cellavkastning per mus och celltyp efter isolering av CNS-residenta celler i naiva möss och EAE-möss. Stapeldiagram visualiserar mängden cellutbyte per mus och celltyp efter implementeringen av det presenterade protokollet. Fem biologiska replikat bearbetades för resultaten i naiva möss, och fyra biologiska replikat analyserades i EAE-möss. Respektive medel ± SEM avbildas. B) Motsvarande renhets- och viabilitetsanalyser av de renade cellfraktionerna. Stapeldiagram visar viabiliteten och renheten hos de resulterande encellssuspensionerna baserat på deras uttryck av celltypsspecifika markörer. NeuN användes som en celltypsspecifik kärnmarkör för nervceller. Fem biologiska replikat förvärvades och jämfördes för varje celltyp för både friska möss och EAE-möss. Respektive medel ± SEM anges. Förkortningar: Anti-ACSA-2 = astrocytcellyteantigen-2; CD11b = cyklinberoende kinas 11B; CD45 = tyrosinproteinfosfatas C, av receptortyp, CNS = centrala nervsystemet; EAE = experimentell autoimmun encefalomyelit; MACS = magnetiskt aktiverad cellsortering; NeuN = RNA-bindande protein fox-1 homolog 3; O4 = oligodendrocytmarkör O4, SEM = medelvärdets medelfel. Denna siffra har ändrats från49. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65735/65735fig03large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65735/65735fig04.jpg"> Figur 4: Regleringsstrategi för cellsortering av mikroglia efter isolering av CD11b+-celler. (A) Gating strategi hos naiva och (B) EAE-möss. Den övre raden i varje panel visar punktdiagram före sortering och den nedre raden efter sortering. Efter selektion av levande (SSC-A / FSC-A) och enstaka celler (FCS-H / FSC-W) sorterades populationen av CD45intCD11b+ -celler som mikrogliapopulation. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65735/65735fig04large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Studying Neuroinflammatory Pathways Through Simultaneous Isolation of All Main CNS-Resident Cell Types at JoVE.com

Studying Neuroinflammatory Pathways Through Simultaneous Isolation of All Main CNS-Resident Cell Types (Video) | JoVE

Hittills har det inte uppfyllts något behov av protokoll för samtidig isolering av alla celltyper som är bosatta i centrala nervsystemet från samma mus. Protokollet visar en procedur som är tillämplig på naiva och experimentella autoimmuna encefalomyelitmöss för att undersöka komplexa cellulära nätverk under neuroinflammation och samtidigt minska det nödvändiga antalet möss.

Samtidig isolering av huvudcelltyper som är bosatta i centrala nervsystemet från vuxna möss med autoimmun encefalomyelit

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is the most common murine model for multiple sclerosis (MS) and is frequently used to further elucidate ...

För att undersöka molekylära och cellulära mekanismer i autoimmuna sjukdomar som multipel skleros är genereringen av reproducerbara och sofistikerade cellisoleringsprotokoll ett otillfredsställt behov. De flesta av de nuvarande teknikerna för att isolera och analysera CNS-residenta celler visar allvarliga brister, som att fokusera på endast en celltyp eller endast postnatala möss. Det nuvarande protokollet för samtidig isolering av alla huvudcelltyper som är bosatta i CNS från ett CNS-replikat ger möjlighet att analysera komplexa neuronala nätverk och nya inflammatoriska vägar, ex vivo från en enda cellsuspension, som är tillämpliga på friska möss och de med experimentell autoimmun encefalomyelit.Dessutom minskar antalet möss Vårt protokoll för samtidig isolering av alla fyra stora CNS-residenta celltyper i friska och EAE-möss kan användas som ett användbart verktyg för forskargrupper som studerar nya inflammatoriska vägar, vilket möjliggör en mycket mer exakt analys av komplexa biomolekylära mekanismer och cellulära nätverk ex vivo. Nya vetenskapliga frågor som skulle kunna besvaras med hjälp av vårt protokoll är dynamiska undersökningar i EAE under olika stadier av sjukdomsförloppet, som neuroinflammation, neurodegeneration och remission. Cell-cellinteraktioner och biokemiska signalvägar kan också studeras på individnivå.På samma sätt kan funktionella analyser utföras med odlade celler. Vi har för avsikt att fokusera på dynamiska studier av EAE-kursen för multi-omisk analys från ett individuellt CNS-homogenat per EAE-tidpunkt.