Name: Author Spotlight: Exploring the Mechanisms of MicroRNA Loading into Extracellular Vesicles in Cancer Progression
Uploaded: 2023-10-06T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Exploring the Mechanisms of MicroRNA Loading into Extracellular Vesicles in Cancer Progression at JoVE.com

نحن نقدر الدعم والمشورة من الدكتورة جيل هاتشكروفت ، مديرة المرفق الأساسي لقياس التدفق الخلوي في جامعة بوردو. تم دعم هذا العمل من قبل R01CA226259 و R01CA205420 إلى A.L.K. ، وجائزة الابتكار من جمعية الرئة الأمريكية (ANALA2023) IA-1059916 إلى ALK ، ومنحة Purdue Shared Resources Facility P30CA023168 ، ومنحة فولبرايت للدكتوراه الرائدة التي منحتها وزارة الخارجية بالولايات المتحدة الأمريكية إلى H.H.H.

ملاحظة: كشرط مسبق لاستخدام هذه التقنية ، يلزم تحديد والتحقق من صحة miRNAs المصدرة بشكل انتقائي. نظرا لأن خطوط الخلايا المختلفة تختلف بناء على شحنة miRNA المصنفة في المركبات الكهربائية الخاصة بها ، فمن المستحسن تقييم خط الاهتمام الخلوي والمركبات الكهربائية المرتبطة به ل miRNAs قبل الاستخدام. بالإ?...

A Flow Cytometry Protocol for Understanding Export Mechanisms

<ol>
	<li>Kasinski, A. L., Slack, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+en+route+to+the+clinic:+Progress+in+validating+and+targeting+microRNAs+for+cancer+therapy.">MicroRNAs en route to the clinic: Progress in validating and targeting microRNAs for cancer therapy.</a> Nature Reviews Cancer. 11 (12), 849-864 (2011).</li><li>Treiber, T., Treiber, N., Meister, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+microRNA+biogenesis+and+its+crosstalk+with+other+cellular+pathways.">Regulation of microRNA biogenesis and its crosstalk with other cellular pathways.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (1), 5-20 (2019).</li><li>Lu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+expression+profiles+classify+human+cancers.">MicroRNA expression profiles classify human cancers.</a> Nature. 435 (7043), 834-838 (2005).</li><li>Orellana, E., Tenneti, S., Rangasamy, L., Lyle, L., Low, P., Kasinski, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FolamiRs:+Ligand-targeted,+vehicle-free+delivery+of+microRNAs+for+the+treatment+of+cancer.">FolamiRs: Ligand-targeted, vehicle-free delivery of microRNAs for the treatment of cancer.</a> Science Translational Medicine. 9 (401), eaam9327 (2017).</li><li>Orellana, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancing+microRNA+activity+through+increased+endosomal+release+mediated+by+nigericin.">Enhancing microRNA activity through increased endosomal release mediated by nigericin.</a> Molecular Therapy- Nucleic Acids. 16, 505-518 (2019).</li><li>Abdelaal, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+first-in-class+fully+modified+version+of+miR-34a+with+outstanding+stability,+activity,+and+anti-tumor+efficacy.">A first-in-class fully modified version of miR-34a with outstanding stability, activity, and anti-tumor efficacy.</a> Oncogene. , (2023).</li><li>Crescitelli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+RNA+profiles+in+subpopulations+of+extracellular+vesicles:+Apoptotic+bodies,+microvesicles+and+exosomes.">Distinct RNA profiles in subpopulations of extracellular vesicles: Apoptotic bodies, microvesicles and exosomes.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 2, (2013).</li><li>Hasan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+released+by+non-small+cell+lung+cancer+cells+drive+invasion+and+permeability+in+non-tumorigenic+lung+epithelial+cells.">Extracellular vesicles released by non-small cell lung cancer cells drive invasion and permeability in non-tumorigenic lung epithelial cells.</a> Scientific Reports. 12 (1), 972 (2022).</li><li>Costa-Silva, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+cancer+exosomes+initiate+pre-metastatic+niche+formation+in+the+liver.">Pancreatic cancer exosomes initiate pre-metastatic niche formation in the liver.</a> Nature Cell Biology. 17 (6), 816-826 (2015).</li><li>Villarroya-Beltri, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sumoylated+hnRNPA2B1+controls+the+sorting+of+miRNAs+into+exosomes+through+binding+to+specific+motifs.">Sumoylated hnRNPA2B1 controls the sorting of miRNAs into exosomes through binding to specific motifs.</a> Nature Communications. 4, 2980 (2013).</li><li>Cha, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KRAS-dependent+sorting+of+miRNA+to+exosomes.">KRAS-dependent sorting of miRNA to exosomes.</a> elife. 4, e07197 (2015).</li><li>Gandham, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Technologies+and+standardization+in+research+on+extracellular+vesicles.">Technologies and standardization in research on extracellular vesicles.</a> Trends in Biotechnology. 38 (10), 1066-1098 (2020).</li><li>Th&#233;ry, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+2018+(MISEV2018):+a+position+statement+of+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles+and+update+of+the+MISEV2014+guidelines.">Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).</li><li>Kowal, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+comparison+defines+novel+markers+to+characterize+heterogeneous+populations+of+extracellular+vesicle+subtypes.">Proteomic comparison defines novel markers to characterize heterogeneous populations of extracellular vesicle subtypes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (8), E968-E977 (2016).</li><li>Sork, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+and+interplay+of+the+extracellular+vesicle+small+RNA+transcriptome+and+proteome.">Heterogeneity and interplay of the extracellular vesicle small RNA transcriptome and proteome.</a> Scientific Reports. 8 (1), 10813 (2018).</li><li>Mittelbrunn, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unidirectional+transfer+of+microRNA-loaded+exosomes+from+T+cells+to+antigen-presenting+cells.">Unidirectional transfer of microRNA-loaded exosomes from T cells to antigen-presenting cells.</a> Nature Communications. 2, 282 (2011).</li><li>Chiou, N. T., Kageyama, R., Ansel, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+export+into+extracellular+vesicles+and+function+of+tRNA+fragments+during+T+cell+activation.">Selective export into extracellular vesicles and function of tRNA fragments during T cell activation.</a> Cell Reports. 25 (12), 3356-3370 (2018).</li><li>Guzewska, M. M., Witek, K. J., Karnas, E., Rawski, M., Zuba-Surma, E., Kaczmarek, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-125b-5p+impacts+extracellular+vesicle+biogenesis,+trafficking,+and+EV+subpopulation+release+in+the+porcine+trophoblast+by+regulating+ESCRT-dependent+pathway.">miR-125b-5p impacts extracellular vesicle biogenesis, trafficking, and EV subpopulation release in the porcine trophoblast by regulating ESCRT-dependent pathway.</a> The FASEB Journal. 37 (8), e23054 (2023).</li></ol>

يتيح البروتوكول الذي تم إنشاؤه حديثا التقاط حركية إطلاق miRNA في المركبات الكهربائية بعد نقل EV-miRNAs. يسمح هذا النهج بالتحليل المتزامن للعديد من EV-miRNAs و cell-miRNAs ، وفقا لقدرات مقياس الخلايا. علاوة على ذلك ، في حين أن تحليل قياس التدفق الخلوي يمكن أن يوفر رؤى قيمة في بيولوجيا EV miRNA ، إلا أنه لا يخلو ?...

تعد MicroRNAs (miRNAs) واحدة من أفضل المجموعات الفرعية المميزة للحمض النووي الريبي الصغير غير المشفر ، والمعروفة بدورها الحاسم في تنظيم الجينات بعد النسخ. يتبع التعبير والتكوين الحيوي لمعظم miRNAs سلسلة منسقة من الأحداث التي تبدأ بنسخ miRNAs الأولية (pri-miRNAs) في النواة. بعد المعالجة النووية بواسطة مجمع المعالجات الدقيقة إلى سلائف miRNAs (pre-miRNAs) ، يتم تصدير ما قبل miRNAs إلى السيتوبلازم ، حيث تخضع لمزيد من المعالجة بواسطة RNase III endonuclease ، dicer إلى 21-23 نيوكليوتيدات ناضجة miRNAدوبلكس 1. يرتبط أحد خيوط miRNA الناضجة المعالجة بالحمض النووي الريبي المرسال المستهدف (mRNAs) ، مما يؤدي إلى تدهور أو قمع متعدية للأهداف2. استنادا إلى الدور متعدد الخواص ل miRNAs في تنظيم العديد من mRNAs المستهدفة المتنوعة في وقت واحد ، فليس من المستغرب أن يتم تنظيم تعبير miRNA بإحكام3. في الواقع ، يساهم التعبير غير المناسب في حالات مرضية مختلفة ، خاصة في السرطان. لا يمثل التعبير الشاذ عن miRNAs توقيعا خاصا بالمرض فحسب ، بل ظهر أيضا كهدف للإمكانات النذير والعلاجية4،5،6. بالإضافة إلى أدوارها داخل الخلايا ، فإن miRNAs لها أيضا أدوار غير مستقلة. على سبيل المثال ، يمكن تعبئة miRNAs بشكل انتقائي في EVs بواسطة الخلايا المانحة وتصديرها إلى المواقع المتلقية حيث تثير استجابات مظهرية متنوعة في علم وظائف الأعضاء الطبيعي والمرض7،8،9.
على الرغم من الأدلة الواضحة على أن miRNAs المرتبطة ب EV هي جزيئات حيوية وظيفية ، إلا أنه ليس من المفهوم تماما كيف يتم تنظيم مجموعات فرعية معينة من miRNAs في حالات المرض مثل السرطان وكيف تختار الآلية الخلوية وفرز miRNAs إلى Evs10,11. بالنظر إلى الدور المحتمل ل EV-miRNAs في تعديل البيئة المكروية ، من الأهمية بمكان تحديد الآليات التي ينطوي عليها تصدير miRNAs المختارة لتوضيح دور المركبات الكهربائية بشكل كامل في الاتصال بين الخلايا والتسبب في المرض. إن فهم عملية إطلاق miRNA في المركبات الكهربائية لن يسلط الضوء على الوسطاء المهمين لتصدير miRNA فحسب ، بل يمكن أن يوفر أيضا رؤى حول العلاجات المحتملة. لتحقيق هذا المستوى من المعرفة ، يجب تكييف الأدوات لمعالجة هذه الأسئلة التجريبية الجديدة بأمانة. في الواقع ، تنمو الدراسات التي تقيم المركبات الكهربائية بشكل كبير بسبب إدخال تقنيات وضوابط جديدة12,13. فيما يتعلق بتقييم وفرة miRNAs المصدرة إلى EVs ، كان تسلسل الجيل التالي وتفاعل البوليميراز المتسلسل للنسخ العكسي الكمي (qRT-PCR) هي الأدوات القياسية الحالية. في حين أن هذه الأدوات مفيدة لتقييم وفرة miRNAs في المركبات الكهربائية ، إلا أن هناك قيودا على حساسيتها وخصوصيتها ، واستخدام هذه الأساليب الثابتة لتقييم الديناميكيات غير كاف. يتطلب تحديد ديناميكيات تصدير miRNA إلى المركبات الكهربائية مجموعة من الأدوات المتخصصة. هنا ، نقدم بروتوكولا شاملا باستخدام miRNAs المترافقة بالفلورسنت ، لتحليل ديناميكيات إطلاق miRNA من الخلايا المانحة ودمجها في EVs. نناقش أيضا مزايا وقيود الطريقة ونقدم توصيات للاستخدام الأمثل. ستكون الطريقة متعددة الاستخدامات المقدمة في هذه الورقة مفيدة للباحثين المهتمين بدراسة إطلاق miRNA في المركبات الكهربائية وأدوارها المحتملة في الاتصالات الخلوية والمرض.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Falcon tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well clear flat bottom surface treated tissue culture plates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB012927</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ApogeeMix 25 mL, (PS80/110/500 &#38; Si180/240/300/590/880/1300 nm)&#160;</td>
			<td>Apogee Flow Systems</td>
			<td>1527</td>
			<td>To set up gating and parameters for particle detection&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Attune Nxt Flow Cytometer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For fluorescence analysis in EVs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Fortessa Cell Analyzer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For fluorescence analysis in cells&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture incubator</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Maintaining temperature of 37&#160;&#176;C and 5% CO2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture medium</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>specific for the cell-line of interest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell line of interest&#160;</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Any cell line tested and evaluated for EV and cellular abundance of miRNAs on interest.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell-miRNA (miRIDIAN microRNA Mimic Red Transfection Control)</td>
			<td>Horizon discovery</td>
			<td>CP-004500-01-05</td>
			<td>miRNAs predetermined to be retained by the cell-line of interest and not selectively exported out into EVs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EV-miRNA (Fluorophore conjugated miRNAs)</td>
			<td>Integrated DNA Technologies (IDT)</td>
			<td></td>
			<td>miRNAs predetermined to be selectively sorted into EVs&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Opti-MEM Reduced Serum Medium</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>31-985-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hausser Scientific Hemocytometer</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>02-671-54</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyclone 1x PBS (for cell culture)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>SH30256FS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine RNAimax</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-778-150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRCURY LNA Reverse Transcriptase</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>339340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRCURY LNA SYBR Green PCR</td>
			<td>Qiagen&#160;</td>
			<td>339347</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mirVana RNA Isolation</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>AM1561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease free water</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>4387936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde, 4% in PBS</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AAJ61899AK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent reservoir nonsterile</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89094-684</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo ABI QuantiStudio DX Real-Time PCR</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin 0.25%</td>
			<td>Fisher&#160;</td>
			<td>SH3004201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tracking mirna release into extracellular vesicles using flow cytometry

الحويصلات خارج الخلية (EVs) هي وسطاء مهمون للاتصال الخلوي الذي تفرزه مجموعة متنوعة من الخلايا المختلفة. تنقل هذه المركبات الكهربائية الجزيئات النشطة بيولوجيا ، بما في ذلك البروتينات والدهون والأحماض النووية (الحمض النووي ، والحمض النووي الريبي المرسال ، والحمض النووي الريبي الدقيق ، وغيرها من الحمض النووي الريبي غير المشفر) ، من خلية إلى أخرى ، مما يؤدي إلى عواقب النمط الظاهري في الخلايا المتلقية. من بين جميع شحنات EV المختلفة ، حظيت microRNAs (miRNAs) بقدر كبير من الاهتمام لدورها في تشكيل البيئة المكروية وفي تثقيف الخلايا المتلقية بسبب عدم تنظيمها الواضح ووفرة في المركبات الكهربائية. تشير البيانات الإضافية إلى أن العديد من miRNAs يتم تحميلها بنشاط في المركبات الكهربائية. على الرغم من هذا الدليل الواضح ، فإن البحث عن ديناميكيات التصدير وآليات فرز miRNA محدود. هنا ، نقدم بروتوكولا باستخدام تحليل قياس التدفق الخلوي ل EV-miRNA والذي يمكن استخدامه لفهم ديناميكيات تحميل EV-miRNA وتحديد الآلات المشاركة في تصدير miRNA. في هذا البروتوكول ، يتم اقتران miRNAs المحددة مسبقا ليتم تخصيبها في EVs واستنفادها من الخلايا المانحة إلى فلوروفور ونقلها إلى الخلايا المانحة. ثم يتم التحقق من miRNAs الموسومة بالفلورسنت للتحميل في EVs والنضوب من الخلايا باستخدام qRT-PCR. كعنصر تحكم في النقل وأداة لبوابة السكان المنقولين من الخلايا ، يتم تضمين الحمض النووي الريبي الخلوي المسمى بالفلورسنت (الخلايا المحتفظ بها والمستنفدة EV). يتم تقييم الخلايا المنقولة مع كل من EV-miRNA والخلية المحتفظ بها miRNA لإشارات الفلورسنت على مدار 72 ساعة. تتضاءل شدة إشارة التألق الخاصة ب EV-miRNAs بسرعة مقارنة بالحمض النووي الريبي المرسال المحتفظ به بالخلية. باستخدام هذا البروتوكول المباشر ، يمكن للمرء الآن تقييم ديناميكيات تحميل miRNA وتحديد العوامل المختلفة المسؤولة عن تحميل miRNAs في المركبات الكهربائية.

MicroRNAs (miRNAs) are one of the best-characterized subsets of small noncoding RNAs, which are known for their critical role in post-transcriptional gene regulation. The expression and biogenesis of most miRNAs follow a coordinated series of events that begins with transcription of the primary miRNAs (pri-miRNAs) in the nucleus. Following nuclear processing by the microprocessor complex into precursor-miRNAs (pre-miRNAs), the pre-miRNAs are exported to the cytoplasm, where they undergo further processing by the RNase III endonuclease, dicer into 21-23 nucleotide mature miRNA duplexes1. One of the strands of the processed mature miRNA binds to target messenger RNAs (mRNAs), leading to degradation or translational repression of the targets2. Based on the pleiotropic role of miRNAs in simultaneously regulating multiple diverse target mRNAs, it is not surprising that miRNA expression is tightly regulated3. Indeed, inappropriate expression contributes to various disease states, especially in cancer. The aberrant expression of miRNAs not only represents a disease-specific signature but has also emerged as a target for prognostic and therapeutic potential4,5,6. In addition to their intracellular roles, miRNAs also have non-autonomous roles. For example, miRNAs can be selectively packaged into EVs by donor cells and exported to recipient sites where they elicit diverse phenotypic responses in normal and disease physiology7,8,9.
Despite clear evidence that EV-associated miRNAs are functional biomolecules, it is not completely understood how specific subsets of miRNAs are dysregulated in disease states such as cancer and how cellular machinery selects and sorts miRNAs into Evs10,11. Given the potential role of EV-miRNAs in modulating the microenvironment, it is critical to identify the mechanisms involved in the export of select miRNAs to fully elucidate the role of EVs in intercellular communication and disease pathogenesis. Understanding the process of miRNA release into EVs will not only highlight important mediators of miRNA export but can also provide insights into potential therapeutics. To achieve this level of knowledge, tools need to be adapted to faithfully address these new experimental questions. Indeed, studies that evaluate EVs are growing exponentially due to the introduction of new techniques and controls12,13. In relation to evaluating the abundance of exported miRNAs into EVs, next-generation sequencing and quantitative reverse transcription polymerase chain reaction (qRT-PCR) have been the current standard tools. While these tools are useful for evaluating the abundance of miRNAs in EVs, there are limitations to their sensitivity and specificity, and using these static approaches for evaluating dynamics is insufficient. Delineating the dynamics of miRNA export into EVs requires a combination of specialized tools. Here, we present a comprehensive protocol using fluorescently conjugated miRNAs, to analyze the dynamics of miRNA release from donor cells and incorporation into EVs. We also discuss the advantages and limitations of the method and provide recommendations for optimal use. The versatile method presented in this paper will be useful to researchers interested in studying miRNA release into EVs and their potential roles in cellular communication and disease.

Author Spotlight: Exploring the Mechanisms of MicroRNA Loading into Extracellular Vesicles in Cancer Progression 

تتبع إطلاق miRNA في الحويصلات خارج الخلية باستخدام قياس التدفق الخلوي

My lab works on studying microRNAs, and we have known for decades that microRNAs are depleted in cancer. However, the mechanism as to how these microRNAs are lost has not been actively understood. Our recent work on extracellular vesicles suggests that microRNA that are depleted in cancer are being actively loaded into these extracellular vesicles.Our goal now is to really get to the mechanism as to how these RNAs are actively loaded into these extracellular vesicles in the process of tumor genesis. The protocol helps understand and capture the dynamic process of microRNAs release into extracellular vesicles, which is one of the challenging areas in studying extracellular vesicle biology. Our findings provide a tool to advance the study of pathways that regulate depletion of microRNAs in cancer.We plan on identifying functional and phenotypic consequences of the loss of specific subsets of microRNA via extracellular vesicles in cancer. Once we identify the factors that are involved in loading these microRNAs into extracellular vesicles, our goal is to down-regulate these factors and evaluate the phenotypic consequence. Moreover, because we identified a motif that's contained in these small RNAs, we're curious to know whether this motif is both necessary and sufficient for loading these RNAs into the extracellular vesicles.

هنا ، نستخدم قياس التدفق الخلوي كأداة قوية للتحقيق في إطلاق miRNA من الخلايا إلى EVs. باستخدام هذا البروتوكول ، كشف تحليل قياس التدفق الخلوي للخلايا المنقولة باستخدام cell-miRNA و EV-miRNA عن انخفاض متسلسل في إشارة التألق المقابلة ل EV-miRNA ، بينما تم الاحتفاظ بالإشارة المقابلة ل cell-miRNA في الخلايا. للتأكد...

Watch this Scientific Journal Video about Exploring the Mechanisms of MicroRNA Loading into Extracellular Vesicles in Cancer Progression at JoVE.com

هنا ، نصف بروتوكولا مباشرا يتيح التقييم في المختبر لوفرة الحمض النووي الريبي الميكروي المسمى بالفلورسنت لدراسة ديناميكيات تغليف microRNA وتصديره إلى حويصلات خارج الخلية (EVs).

Extracellular vesicles (EVs) are important mediators of cellular communication that are secreted by a variety of different cells. These EVs shuttle ...

يعمل مختبري على دراسة الحمض النووي الريبي الميكروي ، وقد عرفنا منذ عقود أن الحمض النووي الريبي الميكروي مستنفد في السرطان. ومع ذلك ، فإن الآلية المتعلقة بكيفية فقدان هذه الحمض النووي الريبي الصغير لم يتم فهمها بنشاط. يشير عملنا الأخير على الحويصلات خارج الخلية إلى أن الحمض النووي الريبي الدقيق المستنفد في السرطان يتم تحميله بنشاط في هذه الحويصلات خارج الخلية.هدفنا الآن هو الوصول حقا إلى آلية كيفية تحميل هذه الحمض النووي الريبي بنشاط في هذه الحويصلات خارج الخلية في عملية نشأة الورم. يساعد البروتوكول على فهم والتقاط العملية الديناميكية لإطلاق الحمض النووي الريبي الدقيق في الحويصلات خارج الخلية ، والتي تعد واحدة من المجالات الصعبة في دراسة بيولوجيا الحويصلة خارج الخلية. توفر النتائج التي توصلنا إليها أداة لتطوير دراسة المسارات التي تنظم استنفاد الحمض النووي الريبي الصغير في السرطان.نحن نخطط لتحديد العواقب الوظيفية والظاهرية لفقدان مجموعات فرعية محددة من microRNA عبر الحويصلات خارج الخلية في السرطان. بمجرد تحديد العوامل التي تشارك في تحميل هذه الحمض النووي الريبوزي الدقيق في حويصلات خارج الخلية ، فإن هدفنا هو تقليل تنظيم هذه العوامل وتقييم نتيجة النمط الظاهري. علاوة على ذلك، نظرا لأننا حددنا فكرة موجودة في هذه الحمض النووي الريبوزي الصغير، فإننا نشعر بالفضول لمعرفة ما إذا كان هذا الشكل ضروريا وكافيا لتحميل هذه الحمض النووي الريبوزي (RNA) في الحويصلات خارج الخلية.