Name: लेखक स्पॉटलाइट: ड्रोसोफिला न्यूरोमस्कुलर जंक्शनों में सूक्ष्मनलिका नेटवर्क को समझना
Uploaded: 2023-10-20T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Understanding Microtubule Network in Drosophila Neuromuscular Junctions at JoVE.com

हम पांडुलिपि पर चर्चा और टिप्पणियों के लिए डॉ यिंग जियोंग को धन्यवाद देते हैं। यह काम चीन के राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन (एनएसएफसी) से सीएम (31500839) को अनुदान द्वारा समर्थित है।

1. लार्वा का विच्छेदन
नोट: विच्छेदन समाधान हेमोलिम्फ जैसी खारा (एचएल 3.1)18 और फिक्सिंग समाधान 4% पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए) 19,20 का उपयोग कमरे के तापमान पर किया जा?...

ड्रोसोफिला न्यूरोमस्कुलर जंक्शनों और मांसपेशियों की कोशिकाओं में सूक्ष्मनलिका नेटवर्क देखना

<ol>
	<li>Halpain, S., Dehmelt, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+MAP1+family+of+microtubule-associated+proteins.">The MAP1 family of microtubule-associated proteins.</a> Genome biology. 7 (6), 224 (2006).</li><li>S&#225;nchez, C., D&#237;az-Nido, J., Avila, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation+of+microtubule-associated+protein+2+(MAP2)+and+its+relevance+for+the+regulation+of+the+neuronal+cytoskeleton+function.">Phosphorylation of microtubule-associated protein 2 (MAP2) and its relevance for the regulation of the neuronal cytoskeleton function.</a> Progress in neurobiology. 61 (2), 133-168 (2000).</li><li>Dehmelt, L., Halpain, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+MAP2/Tau+family+of+microtubule-associated+proteins.">The MAP2/Tau family of microtubule-associated proteins.</a> Genome biology. 6 (1), 204 (2005).</li><li>Roll-Mecak, A., McNally, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule-severing+enzymes.">Microtubule-severing enzymes.</a> Current opinion in cell biology. 22 (1), 96-103 (2010).</li><li>Walczak, C. E., Gayek, S., Ohi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule-depolymerizing+kinesins.">Microtubule-depolymerizing kinesins.</a> Annual review of cell and developmental biology. 29, 417-441 (2013).</li><li>Bramblett, G. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abnormal+tau+phosphorylation+at+Ser396+in+Alzheimer's+disease+recapitulates+development+and+contributes+to+reduced+microtubule+binding.">Abnormal tau phosphorylation at Ser396 in Alzheimer's disease recapitulates development and contributes to reduced microtubule binding.</a> Neuron. 10 (6), 1089-1099 (1993).</li><li>Van Vactor, D., Sigrist, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presynaptic+morphogenesis,+active+zone+organization+and+structural+plasticity+in+Drosophila.">Presynaptic morphogenesis, active zone organization and structural plasticity in Drosophila.</a> Current opinion in neurobiology. 43, 119-129 (2017).</li><li>Hummel, T., Krukkert, K., Roos, J., Davis, G., Kl&#228;mbt, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+Futsch/22C10+is+a+MAP1B-like+protein+required+for+dendritic+and+axonal+development.">Drosophila Futsch/22C10 is a MAP1B-like protein required for dendritic and axonal development.</a> Neuron. 26 (2), 357-370 (2000).</li><li>Roos, J., Hummel, T., Ng, N., Kl&#228;mbt, C., Davis, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+Futsch+regulates+synaptic+microtubule+organization+and+is+necessary+for+synaptic+growth.">Drosophila Futsch regulates synaptic microtubule organization and is necessary for synaptic growth.</a> Neuron. 26 (2), 371-382 (2000).</li><li>Packard, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+Wnt,+wingless,+provides+an+essential+signal+for+pre-+and+postsynaptic+differentiation.">The Drosophila Wnt, wingless, provides an essential signal for pre- and postsynaptic differentiation.</a> Cell. 111 (3), 319-330 (2002).</li><li>Dent, E. W., Callaway, J. L., Szebenyi, G., Baas, P. W., Kalil, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reorganization+and+movement+of+microtubules+in+axonal+growth+cones+and+developing+interstitial+branches.">Reorganization and movement of microtubules in axonal growth cones and developing interstitial branches.</a> The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 19 (20), 8894-8908 (1999).</li><li>Tanaka, E. M., Kirschner, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+behavior+in+the+growth+cones+of+living+neurons+during+axon+elongation.">Microtubule behavior in the growth cones of living neurons during axon elongation.</a> The Journal of cell biology. 115 (2), 345-363 (1991).</li><li>Ahmad, F. J., Yu, W., McNally, F. J., Baas, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+essential+role+for+katanin+in+severing+microtubules+in+the+neuron.">An essential role for katanin in severing microtubules in the neuron.</a> The Journal of cell biology. 145 (2), 305-315 (1999).</li><li>Hu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fidgetin+regulates+cultured+astrocyte+migration+by+severing+tyrosinated+microtubules+at+the+leading+edge.">Fidgetin regulates cultured astrocyte migration by severing tyrosinated microtubules at the leading edge.</a> Molecular biology of the cell. 28 (4), 545-553 (2017).</li><li>Feizabadi, M. S., Castillon, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+Tau+and+taxol+on+polymerization+of+MCF7+microtubules+in+vitro.">The effect of Tau and taxol on polymerization of MCF7 microtubules in vitro.</a> International journal of molecular sciences. 23 (2), 677 (2022).</li><li>Velasco, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+depolymerization+contributes+to+spontaneous+neurotransmitter+release+in+vitro.">Microtubule depolymerization contributes to spontaneous neurotransmitter release in vitro.</a> Communications biology. 6 (1), 488 (2023).</li><li>H&#246;&#246;g, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+tomography+reveals+a+flared+morphology+on+growing+microtubule+ends.">Electron tomography reveals a flared morphology on growing microtubule ends.</a> Journal of cell science. 124, 693-698 (2011).</li><li>Feng, Y., Ueda, A., Wu, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modified+minimal+hemolymph-like+solution,+HL3.1,+for+physiological+recordings+at+the+neuromuscular+junctions+of+normal+and+mutant+Drosophila+larvae.">A modified minimal hemolymph-like solution, HL3.1, for physiological recordings at the neuromuscular junctions of normal and mutant Drosophila larvae.</a> Journal of neurogenetics. 18 (2), 377-402 (2004).</li><li>Broadie, K. S., Bate, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+embryonic+neuromuscular+synapse+of+Drosophila+melanogaster.">Development of the embryonic neuromuscular synapse of Drosophila melanogaster.</a> The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 13 (1), 144-166 (1993).</li><li>Xiong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HDAC6+mutations+rescue+human+tau-induced+microtubule+defects+in+Drosophila.">HDAC6 mutations rescue human tau-induced microtubule defects in Drosophila.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (12), 4604-4609 (2013).</li><li>Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. 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D., Lockwood, A. H., Hwo, S. Y., Kirschner, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protein+factor+essential+for+microtubule+assembly.">A protein factor essential for microtubule assembly.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 72 (5), 1858-1862 (1975).</li><li>Kadavath, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tau+stabilizes+microtubules+by+binding+at+the+interface+between+tubulin+heterodimers.">Tau stabilizes microtubules by binding at the interface between tubulin heterodimers.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (24), 7501-7506 (2015).</li><li>Trotta, N., Orso, G., Rossetto, M. G., Daga, A., Broadie, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hereditary+spastic+paraplegia+gene,+spastin,+regulates+microtubule+stability+to+modulate+synaptic+structure+and+function.">The hereditary spastic paraplegia gene, spastin, regulates microtubule stability to modulate synaptic structure and function.</a> Current biology: CB. 14 (13), 1135-1147 (2004).</li></ol>

यहां ड्रोसोफिला लार्वा न्यूरोमस्कुलर जंक्शनों और मांसपेशियों की कोशिकाओं के विच्छेदन और इम्यूनोस्टेनिंग के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है। विचार करने के लिए कई आवश्यक बिंदु हैं। सबसे पहल...

माइक्रोट्यूबुल्स (एमटी), साइटोस्केलेटन के संरचनात्मक घटकों में से एक के रूप में, कोशिका विभाजन, कोशिका विकास और गतिशीलता, इंट्रासेल्युलर परिवहन और सेल आकार के रखरखाव सहित विभिन्न जैविक प्रक्रियाओं में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। सूक्ष्मनलिका की गतिशीलता और कार्य को अन्य प्रोटीनों के साथ बातचीत द्वारा नियंत्रित किया जाता है, जैसे कि एमएपी 1, एमएपी 2, ताऊ, कैटानिन और काइन्सिन 1,2,3,4,5।
न्यूरॉन्स में, सूक्ष्मनलिकाएं अक्षतंतु और डेंड्राइट के विकास और रखरखाव के लिए आवश्यक हैं। सूक्ष्मनलिकाएं में असामान्यताएं शिथिलता और यहां तक कि न्यूरॉन्स की मृत्यु का कारण बनती हैं। उदाहरण के लिए, अल्जाइमर के रोगियों के मस्तिष्क में, ताऊ प्रोटीन हाइपरफॉस्फोराइलेशन सूक्ष्मनलिका नेटवर्क की स्थिरता को कम करता है, जिससे न्यूरोलॉजिकल अनियमितताएंहोती हैं। इस प्रकार, सूक्ष्मनलिका नेटवर्क की जांच न्यूरोडेवलपमेंट और न्यूरोलॉजिकल रोगों के रोगजनन की समझ में योगदान देगी।
न्यूरोमस्कुलर जंक्शन (एनएमजे) एक मोटर न्यूरॉन एक्सॉन टर्मिनल और एक मांसपेशी फाइबर के बीच गठित परिधीय सिनैप्स है, जो सिनैप्टिक संरचना और कार्योंका अध्ययन करने के लिए एक उत्कृष्ट और शक्तिशाली मॉडल प्रणाली है। फ्यूच ड्रोसोफिला में एक प्रोटीन है जो स्तनधारियों में पाए जाने वाले सूक्ष्मनलिका-बाध्यकारी प्रोटीन एमएपी 1 बी के समरूपहै। यह केवल न्यूरॉन्स में व्यक्त किया जाता है और एनएमजे के सिनैप्टिक बटन 8,9 के विकास में भूमिका निभाता है। जंगली-प्रकार में, एनएमजे प्रक्रियाओं के केंद्र के साथ चलने वाले फिलामेंटस बंडलों को एंटी-फुटश के साथ इम्यूनोस्टेनिंग द्वारा कल्पना की जाती है। एनएमजे के अंत तक पहुंचने पर, इस बंडल में या तो सूक्ष्मनलिकाएं युक्त एक लूप बनाने या इसकी फिलामेंटस संरचना को खोने की क्षमता होती है, जिसके परिणामस्वरूप एक फैलाव और तीक्ष्ण उपस्थिति10 होती है। माइक्रोट्यूबुल्स लूप रुके हुए विकास शंकु से जुड़े होते हैं, जिससे पता चलता है कि सूक्ष्मनलिका सरणी स्थिर है11. इसलिए, हम अप्रत्यक्ष रूप से फुटश स्टेनिंग द्वारा एनएमजे में स्थिर सूक्ष्मनलिका विकास निर्धारित कर सकते हैं। ड्रोसोफिला लार्वा में मांसपेशियों की कोशिकाओं का बड़ा आकार सूक्ष्मनलिका नेटवर्क के स्पष्ट विज़ुअलाइज़ेशन की अनुमति देता है। सूक्ष्मनलिकाएं नेटवर्क की स्थिरता को प्रभावित करने वाले कारक सूक्ष्मनलिकाएं के घनत्व और आकार का विश्लेषण करके पाए जा सकते हैं। इसके साथ ही, मांसपेशियों की कोशिकाओं की सूक्ष्मनलिका नेटवर्क की स्थिति को अधिक व्यापक निष्कर्ष प्राप्त करने के लिए एनएमजे के परिणाम के साथ क्रॉस-सत्यापित किया जा सकता है।
सूक्ष्मनलिकाएं के नेटवर्क और गतिशीलता की जांच के लिए कई प्रोटोकॉल नियोजित किए गए हैं। हालांकि, इन शोधों ने अक्सर इन विट्रो अध्ययनों 12,13,14,15,16 पर ध्यान केंद्रित किया है। वैकल्पिक रूप से, विवो प्रयोगों में कुछ ने साइटोस्केलेटन17 का पता लगाने के लिए इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी को नियोजित किया है। प्रोटीन या डीएनए के लिए फ्लोरोसेंटली लेबल एंटीबॉडी या रासायनिक रंगों के विशिष्ट बंधन के अनुसार, यहां प्रस्तुत विधियां विवो में व्यक्तिगत न्यूरॉन्स के स्तर पर एनएमजे में सूक्ष्मनलिका नेटवर्क का पता लगाने की अनुमति देती हैं, जिसके परिणाम मांसपेशियों की कोशिकाओं में टिप्पणियों द्वारा पुष्टि की जाती है। ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर में उपलब्ध शक्तिशाली आनुवंशिक उपकरणों के साथ संयुक्त होने पर यह प्रोटोकॉल सरल, स्थिर और दोहराने योग्य है, जो विवो में तंत्रिका तंत्र में सूक्ष्मनलिका नेटवर्क नियामक प्रोटीन की भूमिका के लिए फेनोटाइपिक परीक्षाओं और आनुवंशिक स्क्रीनिंग की एक विविध श्रृंखला को सक्षम करता है।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor Plus 405 phalloidin</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>A30104</td>
			<td>dilute 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enhanced Antifade Mounting Medium</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>P0128M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FV10-ASW confocal microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse antibody, Alexa Fluor 488 conjugated</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A-11001</td>
			<td>dilute 1:1,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser confocal microscope LSM 710</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Scissors</td>
			<td>66vision</td>
			<td>54138B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-Futsch antibody</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank&#160;&#160;</td>
			<td>22C10</td>
			<td>dilute 1:50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-&#945;-tubulin antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T5168</td>
			<td>dilute 1:1,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Wako</td>
			<td>168-20955</td>
			<td>Final concentration: 4% in PB Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless Steel Minutien Pins</td>
			<td>Entomoravia</td>
			<td></td>
			<td>0.1mm Diam</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope SMZ161</td>
			<td>Motic</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stereoscopic fluorescence microscope BX41</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Texas Red-conjugated goat anti-HRP</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td></td>
			<td>dilute 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TO-PRO(R) 3 iodide</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>T3605</td>
			<td>dilute 1:1,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer decoloring shaker TS-8</td>
			<td>Kylin-Bell lab instruments</td>
			<td>E0018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TritonX-100</td>
			<td>BioFroxx</td>
			<td>1139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers&#160;</td>
			<td>dumont</td>
			<td>500342</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using drosophila larval neuromuscular junction and muscle cells to visualize microtubule network

सूक्ष्मनलिका नेटवर्क तंत्रिका तंत्र का एक आवश्यक घटक है। कई सूक्ष्मनलिकाएं नियामक प्रोटीन में उत्परिवर्तन न्यूरोडेवलपमेंटल विकारों और न्यूरोलॉजिकल रोगों से जुड़े होते हैं, जैसे कि सूक्ष्मनलिका से जुड़े प्रोटीन ताऊ से न्यूरोडीजेनेरेटिव रोग, सूक्ष्मनलिका सेवरिंग प्रोटीन स्पास्टिन और कैटानिन 60 क्रमशः वंशानुगत स्पास्टिक पैरापलेजिया और न्यूरोडेवलपमेंटल असामान्यताएं पैदा करते हैं। न्यूरॉन्स में सूक्ष्मनलिका नेटवर्क का पता लगाना न्यूरोलॉजिकल विकारों के रोगजनन को स्पष्ट करने के लिए फायदेमंद है। हालांकि, न्यूरॉन्स का छोटा आकार और अक्षीय सूक्ष्मनलिका बंडलों की घनी व्यवस्था सूक्ष्मनलिका नेटवर्क को चुनौतीपूर्ण बनाती है। इस अध्ययन में, हम ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर में सूक्ष्मनलिका नेटवर्क की कल्पना करने के लिए लार्वा न्यूरोमस्कुलर जंक्शन और मांसपेशियों की कोशिकाओं के विच्छेदन के साथ-साथ α-ट्यूबुलिन और सूक्ष्मनलिका से जुड़े प्रोटीन फुटश के इम्यूनोस्टेनिंग के लिए एक विधि का वर्णन करते हैं। न्यूरोमस्कुलर जंक्शन हमें प्री-और पोस्ट-सिनैप्टिक सूक्ष्मनलिकाएं दोनों का निरीक्षण करने की अनुमति देता है, और ड्रोसोफिला लार्वा में मांसपेशियों की कोशिकाओं का बड़ा आकार सूक्ष्मनलिका नेटवर्क के स्पष्ट विज़ुअलाइज़ेशन की अनुमति देता है। यहां, ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर में कैटनिन 60 को उत्परिवर्तित और अतिरंजित करके, और फिर न्यूरोमस्कुलर जंक्शन और मांसपेशियों की कोशिकाओं में सूक्ष्मनलिका नेटवर्क की जांच करके, हम न्यूरोडेवलपमेंट में कैटनिन 60 की नियामक भूमिका को सटीक रूप से प्रकट करते हैं। इसलिए, ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर के शक्तिशाली आनुवंशिक उपकरणों के साथ संयुक्त, यह प्रोटोकॉल तंत्रिका तंत्र में सूक्ष्मनलिका नेटवर्क नियामक प्रोटीन की भूमिका के लिए आनुवंशिक स्क्रीनिंग और सूक्ष्मनलिका गतिशीलता विश्लेषण की सुविधा प्रदान करता है।

Microtubules (MTs), as one of the structural components of the cytoskeleton, play an important role in diverse biological processes, including cell division, cell growth and motility, intracellular transport, and the maintenance of cell shape. Microtubule dynamics and function are modulated by interactions with other proteins, such as MAP1, MAP2, Tau, Katanin, and Kinesin1,2,3,4,5.
In neurons, microtubules are essential for the development and maintenance of axons and dendrites. Abnormalities in microtubules lead to dysfunction and even the death of neurons. For instance, in the brain of Alzheimer&#39;s patients, Tau protein hyperphosphorylation reduces the stability of the microtubule network, causing neurological irregularities6. Thus, examining microtubule networks will contribute to a comprehension of neurodevelopment and the pathogenesis of neurological diseases.
The neuromuscular junction (NMJ) is the peripheral synapse formed between a motor neuron axon terminal and a muscle fiber, which is an excellent and powerful model system for studying synaptic structure and functions7. Futsch is a protein in Drosophila that is homologous to the microtubule-binding protein MAP1B found in mammals8. It is expressed only in neurons and plays a role in the development of the NMJ&#39;s synaptic buttons8,9. In wild-type, filamentous bundles that run along the center of NMJ processes are visualized by immunostaining with anti-Futsch. When reaching NMJ&#39;s end, this bundle has the ability to either form a loop consisting of microtubules or to lose its filamentous structure, resulting in a diffuse and punctate appearance10. Microtubule loops are associated with paused growth cones, which suggests the microtubule array is stable11. Therefore, we can indirectly determine the stable microtubule development in NMJ by Futsch staining. The large size of muscle cells in Drosophila larva allows for clear visualization of the microtubule network. The factors affecting the stability of the microtubule network can be found by analyzing the density and shape of microtubules. Simultaneously, the microtubule network status of muscle cells can be cross-verified with the result of NMJ to obtain more comprehensive conclusions.
Many protocols have been employed for investigating the network and dynamics of microtubules. However, these researches have often focused on in vitro studies12,13,14,15,16. Alternatively, some in vivo experiments have employed electron microscopy to detect the cytoskeleton17. According to the specific binding of fluorescently labeled antibodies or chemical dyes to proteins or DNA, the methods presented here allow the detection of microtubule networks in NMJ at the level of individual neurons in vivo, with results corroborated by observations in muscle cells. This protocol is simple, stable, and repeatable when combined with the powerful genetic tools available in Drosophila melanogaster, enabling a diverse range of phenotypic examinations and genetic screenings for the role of microtubule network regulatory proteins in the nervous system in vivo.

लेखक स्पॉटलाइट: ड्रोसोफिला न्यूरोमस्कुलर जंक्शनों में सूक्ष्मनलिका नेटवर्क को समझना 

माइक्रोट्यूबुल्स नेटवर्क की कल्पना करने के लिए ड्रोसोफिला लार्वा न्यूरोमस्कुलर जंक्शन और मांसपेशी कोशिकाओं का उपयोग करना

Currently, microtubule dynamics are observed indirectly through microtubule-binding proteins such as EB1. Since alphabeta tubulin heterodimers are abundant in the cytoplasm, fold directly, neighboring tubulin heterodimers are lacking the dynamics of microtubule networks in vivo. Our protocol visualizes microtubules in neuromuscular synapses and muscle cells.When combined with the powerful genetic tools available in Drosophila melanogaster, enabling a diverse range of phenotypic examinations and the genetic screening for the role of microtubule network regulatory proteins in the nervous system in vivo. Our research focuses on the relationship between the cytoskeleton and the neurodevelopment, as well as its implications for neurological diseases. We hope to discover the mechanism of neurodevelopment and the parthenogenesis for neurological diseases by highlighting the effect of cytoskeletal regulatory proteins on neurons.

हमने न्यूरोमस्कुलर जंक्शनों (एनएमजे) और मांसपेशी कोशिकाओं दोनों में सूक्ष्मनलिका नेटवर्क की कल्पना करने के लिए एक चरण-दर-चरण प्रक्रिया का प्रदर्शन किया। योजनाबद्ध आरेख (चित्रा 1 ए-ई) के अनुसार व?...

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यहां, हम न्यूरोमस्कुलर जंक्शनों और मांसपेशियों की कोशिकाओं में सूक्ष्मनलिका नेटवर्क की कल्पना करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर के शक्तिशाली आनुवंशिक उपकरणों के साथ संयुक्त, यह प्रोटोकॉल तंत्रिका तंत्र में सूक्ष्मनलिका नेटवर्क नियामक प्रोटीन की भूमिका के लिए आनुवंशिक स्क्रीनिंग और सूक्ष्मनलिका-गतिशीलता विश्लेषण की सुविधा प्रदान करता है।

The microtubule network is an essential component of the nervous system. Mutations in many microtubules regulatory proteins are associated with ...

वर्तमान में, सूक्ष्मनलिकाकी गतिशीलता अप्रत्यक्ष रूप से सूक्ष्मनलिका-बाध्यकारी प्रोटीन जैसे ईबी 1 के माध्यम से देखी जाती है। चूंकि अल्फाबेट ट्यूबुलिन हेटेरोडिमर साइटोप्लाज्म में प्रचुर मात्रा में होते हैं, सीधे फोल्ड करते हैं, पड़ोसी ट्यूबुलिन हेटेरोडीमर में विवो में सूक्ष्मनलिका नेटवर्क की गतिशीलता की कमी होती है। हमारा प्रोटोकॉल न्यूरोमस्कुलर सिनैप्स और मांसपेशियों की कोशिकाओं में सूक्ष्मनलिकाएं की कल्पना करता है।जब ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर में उपलब्ध शक्तिशाली आनुवंशिक उपकरणों के साथ जोड़ा जाता है, तो विवो में तंत्रिका तंत्र में सूक्ष्मनलिका नेटवर्क नियामक प्रोटीन की भूमिका के लिए फेनोटाइपिक परीक्षाओं और आनुवंशिक स्क्रीनिंग की एक विविध श्रृंखला को सक्षम करता है। हमारा शोध साइटोस्केलेटन और न्यूरोडेवलपमेंट के बीच संबंधों पर केंद्रित है, साथ ही न्यूरोलॉजिकल रोगों के लिए इसके निहितार्थ भी। हम न्यूरॉन्स पर साइटोस्केलेटल नियामक प्रोटीन के प्रभाव को उजागर करके न्यूरोलॉजिकल रोगों के लिए न्यूरोडेवलपमेंट और पार्थेनोजेनेसिस के तंत्र की खोज करने की उम्मीद करते हैं।

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Using Drosophila Larval Neuromuscular Junction and Muscle Cells to Visualize Microtubule Network

The microtubule network is an essential component of the nervous system. Mutations in many microtubules regulatory proteins are associated with neurodevelopmental disorders and neurological diseases, such as microtubule-associated protein Tau to neurodegenerative diseases, microtubule severing protein Spastin and Katanin 60 cause hereditary spastic paraplegia and neurodevelopmental abnormalities, respectively. Detection of microtubule networks in neurons is advantageous for elucidating the pathogenesis of neurological disorders. However, the small size of neurons and the dense arrangement of axonal microtubule bundles make visualizing the microtubule networks challenging. In this study, we describe a method for dissection of the larval neuromuscular junction and muscle cells, as well as immunostaining of &#945;-tubulin and microtubule-associated protein Futsch to visualize microtubule networks in Drosophila melanogaster. The neuromuscular junction permits us to observe both pre-and post-synaptic microtubules, and the large size of muscle cells in Drosophila larva allows for clear visualization of the microtubule network. Here, by mutating and overexpressing Katanin 60 in Drosophila melanogaster,&#160;and then examining the microtubule networks in the neuromuscular junction and muscle cells, we&#160;accurately reveal the regulatory role of Katanin 60 in neurodevelopment. Therefore, combined with the powerful genetic tools of Drosophila&#160;melanogaster, this protocol greatly facilitates genetic screening and microtubule dynamics analysis for the role of microtubule network regulatory proteins in the nervous system.

Here, we present a detailed protocol to visualize the microtubule networks in neuromuscular junctions and muscle cells. Combined with the powerful genetic tools of Drosophila melanogaster, this protocol greatly facilitates genetic screening and microtubule-dynamics analysis for the role of microtubule network regulatory proteins in the nervous system.

Drosophila Larval Dissection and Fixation for Microtubule Visualization

Begin by picking out a wandering Drosophila third instar larva using long blunt forceps. Wash the larva with hemolymph-like saline, then dry it with a wipe. Next, position the larva dorsally or ventrally on a dissection dish under the stereo microscope.Depending on the tissue to be observed, opt for dorsal or ventral dissection. Pin the larva's mouth hooks and tail to maintain extended positioning. Next, add a drop of the hemolymph-like saline to prevent the larva from drying.Using dissection scissors, make a small transverse incision close to the posterior end without severing it completely. Proceed to cut along the ventral midline, moving toward the anterior end. Now insert four insect pins each into the corners of the larva.Make necessary adjustments to the insect pins to maximize the stretching of the larva. Use forceps to gently remove the internal organs while avoiding harm to the muscles. To fix the larva, immerse the carcasses in 100 L of 4%paraformaldehyde, while still affixed to the dissecting dish.After this, dismount the pins. Then transfer the sample into a 2 mL microcentrifuge tube filled with 0.2%PBST. Place the tube on a shaker for 10 minutes at 15 RPM.

ड्रोसोफिला माइक्रोट्यूबुल्स विज़ुअलाइज़ेशन के लिए लार्वा विच्छेदन और निर्धारण

Immunohistochemistry of Drosophila Larva for Microtubule Visualization

Remove the PBST and immerse the paraformaldehyde-fixed drosophila larval carcasses in a blocking agent for 40 minutes at room temperature. Replace the blocking agent with 200 microliters of the primary antibody diluted with 0.2%PBST. Leave the larvae to incubate at four degrees Celsius overnight.The next day, wash the larvae with 0.2%PBST for 10 minutes. Next, remove the PBST from the tube and add 200 microliters of diluted secondary antibody. Incubate it at ambient temperature for 1.5 hours in the dark.Introduce a nuclear dye such as TO-PRO R 3 iodide into the incubating tube for 30 minutes while staining the microtubules in the dark. Finally, rinse off the secondary antibody and the nuclear dye with 0.2%PBST for 10 minutes.

माइक्रोट्यूबुल्स विज़ुअलाइज़ेशन के लिए ड्रोसोफिला लार्वा का इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री

Mounting and Image Acquisition of Drosophila Larval Microtubules

Begin by placing the antibody labeled drosophila larval carcasses in 0.2%PBST on a glass slide. Adjusted under the stereo microscope, ensuring that the inner surface of the larval carcass is facing up. Absorb the excess PBST solution using a wipe.Then delicately add a drop of Anti-Fade mounting medium. Next place a cover slip on the slide covering the dissected larvae slowly and gently, avoiding bubble formation. Secure the cover slip in place by applying fingernail polish around its edges.Store the slide in a dark location to minimize fluorescent attenuation. For image acquisition, use the laser scanning confocal microscope with the 63x Oil immersion objective. Then adjust the wavelength and laser power to fit the requirements of the experiment best.To identify the neuromuscular junctions and capture images of muscle four in segment A three, select a 488 nanometer laser to activate alpha tubulin or Futsch, and 546 nanometers to activate the HRP imaging track. Modify the parameters to achieve a frame size of 1, 024 by 1, 024 pixels, a digital zoom of 1.0, and an imaging interval of 0.8 micrometers. To visualize microtubules in the muscle, capture images of muscle two in the segments A three to A five as it has fewer tracheal branches.Choose a 488 nanometer laser for activating alpha tubulin and a 633 nanometer laser for activating the T3605 imaging track. Adjust the imaging parameters to a frame size of 1, 024 by 1, 024 pixels, a digital zoom of 2.0, and an imaging interval of 0.4 micrometers. Both pre-and post-synaptic microtubule organizations of the neuromuscular junction were labeled with anti-alpha tubulin.Futsch staining reflected the abundance of stable microtubules in the pre-synaptic neurons. Decreased signal intensity of anti-Futsch was observed when microtubules severing protein Katanin 60 was overexpressed in the presynaptic neurons. The staining intensity of the axon trunk was stronger than that of the branches.Katanin 60 mutations resulted in increased microtubule loops. Overexpression of Katanin 60 caused short microtubule fragments within the terminal buttons. Alpha tubulin staining demonstrated a clear network of microtubules around the nucleus.Muscle cells had a significantly increased perinuclear microtubular intensity and exhibited stronger bundles in the Katanin 60 mutant. Overexpression resulted in fragmentation of the microtubule fibers.