Name: Autor im Rampenlicht: Förderung der Forschung in der mikrobiellen Autoaggregation mit bildgebender Durchflusszytometrie
Uploaded: 2023-09-29T14:00:00
Description: Read this Scientific Article Protocol about Author Spotlight: Advancing Research in Microbial Auto Aggregation Using Imaging Flow Cytometry at JoVE.com

Diese Arbeit wurde von der Israeli Science Foundation (Grant 119/16) und IMoh Grant (3-15656) an die IKG unterstützt. R.S. unterstützt durch das Kreitman-Stipendium.

Die .ast-Datei mit der Vorlage für Lacticaseibacillus rhamnosus GG (LGG) als Beispiel wird in der Supplementary Coding File 1 bereitgestellt.
1. Vorbereitung der Medien
<ol><li>Bereiten Sie Laktobazillen-MRS-Brühe gemäß den Anweisungen des Herstellers (55 g in 1 l entionisiertem Wasser) und Laktobazillen-MRS-Agarplatten mit 1,5 % (w/v) Agar zu (siehe Materialtabelle). Nach der Sterilisation im Autoklaven ist das Medium direkt ge...

Quantitative Analyse der mikrobiellen Autoaggregation mittels bildgebender Durchflusszytometrie

<ol>
	<li>Trunk, T., Khalil, H. S., Leo, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+autoaggregation.">Bacterial autoaggregation.</a> AIMS Microbiology. 4 (1), 140-164 (2018).</li><li>Ishikawa, M., Nakatani, H., Hori, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AtaA,+a+new+member+of+the+trimeric+autotransporter+adhesins+from+Acinetobacter+sp.+Tol+5+mediating+high+adhesiveness+to+various+abiotic+surfaces.">AtaA, a new member of the trimeric autotransporter adhesins from Acinetobacter sp. Tol 5 mediating high adhesiveness to various abiotic surfaces.</a> PLoS One. 7, e48830 (2012).</li><li>Inoue, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+characterization+of+low-molecular-weight+component+protein,+Flp,+in+Actinobacillus+actinomycetemcomitans+fimbriae.">Molecular characterization of low-molecular-weight component protein, Flp, in Actinobacillus actinomycetemcomitans fimbriae.</a> Medical Microbiology and Immunology. 42 (4), 253-258 (1998).</li><li>Boddey, J. A., Flegg, C. P., Day, C. J., Beacham, I. R., Peak, I. 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L., Kim, J., Shear, J. B., Bard, A. J., Whiteley, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+monitoring+of+quorum+sensing+in+3D-printed+bacterial+aggregates+using+scanning+electrochemical+microscopy.">Real-time monitoring of quorum sensing in 3D-printed bacterial aggregates using scanning electrochemical microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (51), 18255-18260 (2014).</li><li>Misawa, N., Blaser, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+characterization+of+autoagglutination+activity+by+Campylobacter+jejuni.">Detection and characterization of autoagglutination activity by Campylobacter jejuni.</a> Infection and Immunity. 68 (11), 6168-6175 (2000).</li><li>Sherlock, O., Schembri, M. A., Reisner, A., Klemm, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+roles+for+the+AIDA+adhesin+from+diarrheagenic+Escherichia+coli:+cell+aggregation+and+biofilm+formation.">Novel roles for the AIDA adhesin from diarrheagenic Escherichia coli: cell aggregation and biofilm formation.</a> Journal of Bacteriology. 186 (23), 8058-8065 (2004).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+flow+cytometry.">Imaging flow cytometry.</a> Nature Reviews Methods Primers. 2, 87 (2022).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolism+characteristics+of+lactic+acid+bacteria+and+the+expanding+applications+in+food+industry.">Metabolism characteristics of lactic acid bacteria and the expanding applications in food industry.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 9, 612285 (2021).</li><li>Turroni, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+dialogue+between+the+human+gut+microbiota+and+the+host:+a+Lactobacillus+and+Bifidobacterium+perspective.">Molecular dialogue between the human gut microbiota and the host: a Lactobacillus and Bifidobacterium perspective.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 71, 183-203 (2014).</li><li>Zuba-Surma, E. K., Kucia, M., Abdel-Latif, A., Lillard, J. W., Ratajczak, M. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ImageStream+System:+a+key+step+to+a+new+era+in+imaging.">The ImageStream System: a key step to a new era in imaging.</a> Folia Histochemica et Cytobiologica. 45, 279-290 (2007).</li><li>Dashkova, V., Malashenkov, D., Poulton, N., Vorobjev, I., Barteneva, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+flow+cytometry+for+phytoplankton+analysis.">Imaging flow cytometry for phytoplankton analysis.</a> Methods. 112, 188-200 (2017).</li><li>Maan, H., Gilhar, O., Porat, Z., Kolodkin-Gal, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacillus+subtilis+colonization+of+arabidopsis+thaliana+roots+induces+multiple+biosynthetic+clusters+for+antibiotic+production.">Bacillus subtilis colonization of arabidopsis thaliana roots induces multiple biosynthetic clusters for antibiotic production.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, 722778 (2021).</li><li>Maan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+flow+cytometry+reveals+a+dual+role+for+exopolysaccharides+in+biofilms:+To+promote+self-adhesion+while+repelling+non-self-community+members.">Imaging flow cytometry reveals a dual role for exopolysaccharides in biofilms: To promote self-adhesion while repelling non-self-community members.</a> Computational and Structural Biotechnology Journal. 20, 15-25 (2022).</li><li>Konieczny, M., Rhein, P., Czaczyk, K., Bialas, W., Juzwa, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+flow+cytometry+to+study+biofilm-associated+microbial+aggregates.">Imaging flow cytometry to study biofilm-associated microbial aggregates.</a> Molecules. 26 (23), 7096 (2021).</li><li>Niederdorfer, R., Peter, H., Battin, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Attached+biofilms+and+suspended+aggregates+are+distinct+microbial+lifestyles+emanating+from+differing+hydraulics.">Attached biofilms and suspended aggregates are distinct microbial lifestyles emanating from differing hydraulics.</a> Nature Microbiology. 1, 16178 (2016).</li></ol>

Die Durchflusszytometrie ist eine weit verbreitete Methode zur Quantifizierung der Fluoreszenzintensität in eukaryotischen Zellen, liefert jedoch aufgrund ihrer größeren Größe oder kleinen Aggregate möglicherweise keine genauen Messungen für Bakterienzellen. Diese Faktoren können die genaue Quantifizierung der Autoaggregation und das basale Niveau der Aggregatbildung unter verschiedenen Bedingungen erheblich beeinflussen. Um dies zu beheben, wurde die bildgebende Durchflusszytometrie (IFC) eingesetzt, um eine bes...

Die bakterielle Autoaggregation gilt als ein primärer Schritt bei der Bildung von Biofilmen. Bei diesem Prozess (manchmal auch Autoagglutination oder Flockung genannt) bilden Bakterien des gleichen Typs mehrzellige Klumpen, die sich schließlich am Boden von Kulturröhrchen absetzen oder sich an ihr Zielgewebe oder ihre Oberfläche anheften1.
Autoaggregation ist ein weit verbreitetes Phänomen und wurde bisher bei gramnegativen Erregern wie dem opportunistischen Erreger Acinetobacter baumannii2, dem Zahnpathogen Aggregobacter actinomycetemcomitans3 und dem neu auftretenden Erreger Burkholderia pseudomallei4 gezeigt. Die Autoaggregation wurde auch bei mehreren probiotischen grampositiven Stämmen beschrieben 5,6,7,8. In Lactobacillus (L.) acidophilus wurde die Autoaggregation teilweise durch S-Schicht-Proteine vermittelt und mit einer Adhäsion an Xylan7 korreliert. In ähnlicher Weise fanden wir eine Korrelation zwischen der glukoseabhängigen Autoaggregation und der Induktion der adhäsiven Eigenschaften (beurteilt durch Adhäsion an Mucin) der probiotischen Spezies Lacticaseibacillus rhamnosus GG, Lacticaseibacillus casei, L. acidophilus, Lacticaseibacillus paracasei und Lactiplantibacillus plantarum5. Die erhöhte Autoaggregation spiegelte höchstwahrscheinlich Veränderungen in der Expression von zellulären Adhäsinen als Reaktion auf Glukose und ihre Katabolitewider 9. Während die molekularen Mechanismen der Autoaggregation noch nicht geklärt sind, konnte gezeigt werden, dass dieser Prozess den Phänotyp der aggregierten Bakterien verändert und ihnen eine erhöhte Toleranz gegenüber Umweltstressoren1 sowie eine erhöhte Empfindlichkeit gegenüber Quorum-Sensing-Molekülen10 verleiht.
Zur Messung der Autoaggregation wurden mehrere Ansätze verwendet. Ein experimenteller Ansatz besteht darin, Kulturen für eine bestimmte Zeit statisch in engen Kulturröhren stehen zu lassen. Kontrollkulturen bleiben trüb, während sich Autoaggregationskulturen am Boden des Röhrchens absetzen. Ein quantitativer Ansatz misst die Autoaggregation durch Sedimentations- oder Absetzassay11.
Auch die Durchflusszytometrie wird in den letzten Jahren zunehmend eingesetzt, um die bakterielle Autoaggregation zu untersuchen. Diese Methode eignet sich für die Analyse von Partikeln mit einer Größe von ca. 0,5 bis 1000 μm. Das einzelne Bakterium oder die gebildeten Aggregate werden in einer Flüssigkeit suspendiert, in einen Strom eingespeist und können einzeln nachgewiesen werden11. Die Aufzeichnung von vorwärts gestreutem Licht ermöglicht die Messung der relativen Größe der Zelle oder des Aggregats. Es ist relativ schnell und unkompliziert, kann aber mehrere Parameter, wie z. B. die Aggregatgröße oder die durchschnittliche Anzahl der Zellen in Aggregaten, nicht erkennen. Daher kann dieser Ansatz mikroskopisch ergänzt werden, so dass mehr Parameter überprüft werden können12. Die traditionelle Mikroskopie ist jedoch zeitaufwändig und schränkt dadurch die Anzahl der untersuchten Proben und die statistische Aussagekraft der Analyse ein. Im Allgemeinen bietet die bildgebende Durchflusszytometrie im Vergleich zur herkömmlichen Durchflusszytometrie mehrere Funktionen, wie z. B. die gleichzeitige Analyse der Zellmorphologie und des Phänotyps, die Durchführung bildbasierter Analysen, die Erkennung seltener Ereignisse und die Validierung von Durchflusszytometriedaten13. Diese Vorteile erweitern die Möglichkeiten der Durchflusszytometrie und ermöglichen eine detailliertere Untersuchung von Zellpopulationen.
Diese Studie bietet ein wertvolles Protokoll für die Bildgebung der Durchflusszytometrie zur Überwachung der Autoaggregation in Milchsäurebakterien (LAB). Diese grampositiven Stäbchen sind fakultative Anaerobier und gehören zur LAB-Gruppe. Diese effizienten Glukosefermenter erzeugen Milchsäure als Hauptendprodukt des Kohlenhydratstoffwechsels14. Diese Bakterien sind nützliche Kernmitglieder des Mikrobioms und kommen natürlicherweise im Magen-Darm-Trakt (GIT) von Mensch und Tier sowie im Urogenitaltrakt von Frauenvor 15. Daher ist die genaue Charakterisierung ihrer Autoaggregationseigenschaften von hohem biotechnologischem und klinischem Interesse.
Unsere bisherigen Befunde deuteten darauf hin, dass sich das basale Niveau der Autoaggregation zwischen verschiedenen probiotischen Stämmen unterscheidet. Diese Heterogenität wird durch die verschiedenen Kohlenhydrate beeinflusst, die als Kohlenstoffquelle verwendet werden5. Um diese grundlegende Eigenschaft probiotischer Bakterien zu überwinden, wurden die Auswirkungen von Kohlenhydraten aus der Nahrung auf Autoaggregation auf Einzelzellebene mit IFC überwacht. Dieser IFC-basierte Ansatz kombiniert die Leistung und Geschwindigkeit herkömmlicher Durchflusszytometer mit der Auflösung des Mikroskops. Daher ermöglicht es komplexe morphometrische Messungen mit hoher Rate in einer phänotypisch definierten Weise16,17. Dieser Ansatz kann auf andere probiotische und pathogene Bakterien ausgeweitet werden, kombiniert mit fluoreszierenden Reportern zur Überwachung der Genexpression und fluoreszenzmarkierten Stämmen zur Überwachung des Vorhandenseins und der Häufigkeit bestimmter Bakterienspezies in heterogenen Aggregaten.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>14 mL culture tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL centrifuge tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Agar</td>
			<td>Baeton,Dickinson and Company</td>
			<td>214010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Typtic Soy Broth</td>
			<td>Baeton,Dickinson and Company</td>
			<td>211825</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7021-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Raffinose pentahydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>83400-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Difco Lactobacilli MRS broth</td>
			<td>Baeton,Dickinson and Company</td>
			<td>288130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EASY-LOCK MICROPR. 1.5 mL (Eppendorf)</td>
			<td>FL medical</td>
			<td>23053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IDEAS Software</td>
			<td>Amnis/EMD Millipore</td>
			<td>N/A</td>
			<td>&#160;Details available at: https://www.merckmillipore.com/INTL/en/20150212_144049?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F&#38;bd=1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageStream X Mark II</td>
			<td>Amnis/EMD Millipore</td>
			<td>N/A</td>
			<td>&#160;Details available at: https://www.merckmillipore.com/INTL/en/20150121_205948?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS, 3-(N-morpholino)propanesulfonic acid</td>
			<td>Fisher bioreagents</td>
			<td>BP308-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate dibasic</td>
			<td>Fisher Scientific, 174.18 g/mol</td>
			<td>BP363-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma, 136.09 g/mol</td>
			<td>P0662-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging flow cytometry to study microbial autoaggregation

Nützliche und probiotische Bakterien spielen eine wesentliche Rolle in ihren Wirten und bieten verschiedene gesundheitliche Vorteile, einschließlich der Immunität gegen Infektionskrankheiten. Die Familie der Lactobacillaceae besteht aus grampositiven Bakterien mit bestätigten probiotischen Eigenschaften. In dieser Studie werden Lactobacillaceae-Spezies als Modell verwendet, um die Wirksamkeit der Einzelzell-Hochdurchsatzanalyse bei der Untersuchung der zellulären Aggregation zu demonstrieren. Der Schwerpunkt liegt auf der Analyse der Reaktion dieser nützlichen Spezies auf einfache Kohlenhydrate aus der Nahrung.
Die Studie zeigt, wie die bildgebende Durchflusszytometrie (IFC) die grundlegenden Unterschiede in der Assemblierung probiotischer Bakterien in Gegenwart und Abwesenheit von Kohlenhydraten überwinden kann. IFC kombiniert die Leistungsfähigkeit und Geschwindigkeit der konventionellen Durchflusszytometrie mit der räumlichen Auflösung der Mikroskopie und ermöglicht komplexe morphometrische Messungen mit hoher Rate in einer phänotypisch definierten Weise über eine Bibliothek nützlicher Bakterienstämme und -bedingungen. Dieses Protokoll bietet Einblicke in die Autoaggregation von Lactobacillaceae-Arten und beleuchtet ihre Reaktion auf Kohlenhydrate in der Nahrung, was zum Verständnis der Mechanismen hinter den positiven Wirkungen dieser probiotischen Bakterien beiträgt.

Bacterial autoaggregation is considered a primary step in biofilm formation. In this process (sometimes also called autoagglutination or flocculation), bacteria of the same type form multicellular clumps that eventually settle at the bottom of culture tubes or attach to their target tissue or surface1.
Autoaggregation is a widely observed phenomenon and has been shown so far in Gram-negative pathogens such as the opportunistic pathogen Acinetobacter baumannii2, the dental pathogen Aggregobacter actinomycetemcomitans3, and the emerging pathogen Burkholderia pseudomallei4. Autoaggregation has also been described in several probiotic Gram-positive strains5,6,7,8. In Lactobacillus (L.) acidophilus, autoaggregation was partially mediated by S-layer proteins and correlated with an adhesion to xylan7. Similarly, we found a correlation between glucose-dependent autoaggregation and induction of the adhesive properties (as judged by adhesion to mucin) of the probiotic species Lacticaseibacillus rhamnosus GG, Lacticaseibacillus casei, L. acidophilus, Lacticaseibacillus paracasei, and Lactiplantibacillus plantarum5. The increased autoaggregation most likely reflected changes in the expression of cellular adhesins in response to glucose and its catabolites9. While the molecular mechanisms of autoaggregation remain to be determined, it has been shown that this process alters the phenotype of the aggregated bacteria and grants them enhanced tolerance to environmental stressors1, as well as increased sensitivity to quorum sensing molecules10.
Several approaches have been used to measure autoaggregation; one experimental approach is to let cultures stand statically in narrow culture tubes for a given time. Control cultures remain turbid, whereas autoaggregation cultures will settle at the bottom of the tube. A more quantitative approach measures autoaggregation by sedimentation or settling assay11.
Flow cytometry has also been increasingly employed in recent years to investigate bacterial autoaggregation. This method is appropriate for analyzing particles between approximately 0.5 and 1000 &#181;m in size. The single bacterium or formed aggregates are suspended in fluid, fed into a stream, and can be detected one by one11. Recording forward scattered light allows measuring the relative size of the cell or aggregate. It is relatively fast and straightforward but cannot detect several parameters, such as aggregate size or the average number of cells in aggregates. Therefore, this approach can be complemented microscopically, allowing more parameters to be checked12. However, traditional microscopy is time-consuming and thereby limits the number of tested samples and the statistical power of the analysis. In general, imaging flow cytometry provides several features compared to traditional flow cytometry, such as simultaneous analysis of cell morphology and phenotype, conducting image-based analysis, detecting rare events, and validating flow cytometry data13. These advantages enhance the capabilities of flow cytometry and facilitate a more detailed examination of cell populations.
This study provides a valuable protocol for imaging flow cytometry to monitor autoaggregation in lactic acid bacteria (LAB). These Gram-positive rods are facultative anaerobes and belong to the LAB group. These efficient glucose fermenters generate lactic acid as their main end-product of carbohydrate metabolism14. These bacteria are beneficial core members of the microbiome and are naturally found in the gastrointestinal tract (GIT) of humans and animals, as well as in the urogenital tract of females15. Therefore, the exact characterization of their autoaggregation properties is of high biotechnological and clinical interest.
Our previous findings indicated that the basal level of autoaggregation differs between different probiotic strains. This heterogeneity is affected by the different carbohydrates used as a carbon source5. To overcome this fundamental property of probiotic bacteria, the effects of carbohydrates from the diet were monitored on autoaggregation on the single-cell level using IFC. This IFC-based approach combines the power and speed of traditional flow cytometers with the microscope&#39;s resolution. Therefore, it allows high-rate complex morphometric measurements in a phenotypically defined way16,17. This approach can be extended to other probiotic and pathogenic bacteria, combined with fluorescent reporters to monitor gene expression, and fluorescently labeled strains to monitor the presence and abundance of specific bacterial species in heterogeneous aggregates.

Autor im Rampenlicht: Förderung der Forschung in der mikrobiellen Autoaggregation mit bildgebender Durchflusszytometrie

Bildgebende Durchflusszytometrie zur Untersuchung der mikrobiellen Autoaggregation

This study utilized Lactobacillus species as a model to demonstrate the effectiveness of imaging flow cytometry analysis in studying microbial autoaggregation. The focus is on analyzing the response of autoaggregation of Lactobacillus species to simple carbohydrates from the diet. The most used methods for measuring autoaggregation are spectral photometry, which measures microbial suspensions, turbidity, or optical density, and traditional microscopy techniques, such as bright field, phase contrast, and fluorescent microscopy.When talking about hight-throughput imaging, one major experimental challenge is single event segmentation. In this protocol, it is a single aggregate. Imaging flow cytometry addresses this challenge elegantly and give researchers a powerful tool for studying autoaggregation.

Die Ergebnisse zeigen, dass diese Methode die Unterschiede in der Autoaggregation als Reaktion auf Nahrungszucker in LAB-Bakterien leicht messen kann. Durch die Trennung von Individuen und Aggregaten ermöglicht die Methode die Berechnung des prozentualen Anteils der Grundgesamtheit an den Aggregationsereignissen an allen Ereignissen als Reaktion auf fermentierbare oder nicht fermentierbare Zucker aus der Nahrung. Darüber hinaus war es möglich zu messen, ob es Unterschiede in der durchschnittlichen Größe der Gesamtpo...

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Dieses Protokoll beschreibt einen quantitativen Ansatz zur Messung der mikrobiellen Autoaggregation mittels bildgebender Durchflusszytometrie.

Beneficial and probiotic bacteria play essential roles in their hosts, providing various health benefits, including immunity to infectious diseases. The ...

In dieser Studie wurden Lactobacillus-Spezies als Modell verwendet, um die Wirksamkeit der bildgebenden Durchflusszytometrie-Analyse bei der Untersuchung der mikrobiellen Autoaggregation zu demonstrieren. Der Schwerpunkt liegt auf der Analyse der Reaktion der Autoaggregation von Lactobacillus-Spezies auf einfache Kohlenhydrate aus der Nahrung. Die am häufigsten verwendeten Methoden zur Messung der Autoaggregation sind die spektrale Photometrie, die mikrobielle Suspensionen, Trübung oder optische Dichte misst, und traditionelle Mikroskopietechniken wie Hellfeld-, Phasenkontrast- und Fluoreszenzmikroskopie.Wenn es um Hight-Throughput-Imaging geht, ist eine große experimentelle Herausforderung die Segmentierung einzelner Ereignisse. In diesem Protokoll handelt es sich um ein einzelnes Aggregat. Die bildgebende Durchflusszytometrie geht diese Herausforderung elegant an die Hand und gibt Forschern ein leistungsstarkes Werkzeug für die Untersuchung der Autoaggregation an die Hand.

imaging-flow-cytometry-to-study-microbial-autoaggregation

Research

JoVE Journal

Biology

Imaging Flow Cytometry to Study Microbial Autoaggregation

Beneficial and probiotic bacteria play essential roles in their hosts, providing various health benefits, including immunity to infectious diseases. The Lactobacillaceae family consists of Gram-positive bacteria with confirmed probiotic properties. This study utilizes Lactobacillaceae species as a model to demonstrate the effectiveness of single-cell high throughput analysis in studying cellular aggregation. The focus is on analyzing the response of these beneficial species to simple carbohydrates from the diet.
The study showcases how Imaging Flow Cytometry (IFC) can overcome the fundamental differences in the assembly of probiotic bacteria in the presence and absence of carbohydrates. IFC combines the power and speed of conventional flow cytometry with the spatial resolution of microscopy, enabling high-rate complex morphometric measurements in a phenotypically defined manner across a library of beneficial bacterial strains and conditions. This protocol provides insights into the autoaggregation of Lactobacillaceae species and sheds light on their response to dietary carbohydrates, contributing to understanding the mechanisms behind the beneficial effects of these probiotic bacteria.

This protocol describes a quantitative approach to measure microbial autoaggregation using imaging flow cytometry.

Forschung

Biologie

Lactobacillaceae Sample Preparation for Flow Cytometric Analysis

Start by inoculating five milliliters of lactobacilli MRS broth with a single colony of the lactobacilli strain, incubated at 37 degrees Celsius under static conditions overnight. Dilute the cell culture in a one-to-100 ratio in three milliliters of 50%supplemented tryptic soy broth, vortex the culture, and incubate it. Then invert the tube to mix the cells in the medium before transferring 200 to 300 microliters of the sample into a 1.5 milliliter micro centrifuge tube.

Lactobacillaceae Probenvorbereitung für die durchflusszytometrische Analyse

Flow Cytometric Data Acquisition of Microbial Aggregates

To begin the flow cytometric analysis, first set the 785-nanometer laser to a power of five milliwatts for dark field measurements. Use a 60X lens with a numerical aperture of 0.9. Then select the high-sensitivity setting and set the speed to low.To ensure calibration bead stability, press the Play button in the fluidics box and examine the bead images, which should appear sharp and clear. Generate a new scatterplot in the workspace box by selecting New Scatterplot. Then select the area in the Brightfield channel that corresponds to the SSC channel intensity and exclude the calibration beads that are running concurrently within the sample.Next, press the Load button and position a tube containing the Lactobacilli sample in the holder. In the Acquisition Settings box, enter the sample name and specify the location for data storage. Set the number of events to be collected, typically within the range of 10, 000 to 20, 000 events.Now, begin the acquisition process by clicking the Record button located in the Acquisition box. The process will halt after reaching the specified volume of events. Press the Return button to unload the tube and remove it from the holder as prompted in the popup window.After repeating the process for all samples, save the template to maintain data acquisition uniformity. For data analysis, to load the raw file into the analysis software, click on File and open the rif file. In the opened window, select Use Acquisition Analysis and then click OK.Next, to create a histogram of the gradient root mean square, click the New Histogram button and choose the population from the acquisition to analyze.Under the X Axis feature, select Gradient RMS of the Brightfield channel. Next, place a gate to exclude non-focused events by clicking the Create Line Region button in the analysis area. Create a scatterplot of the area versus the aspect ratio by clicking the New Scatterplot button in the analysis area.Select the focused population in the New Scatterplot window. Then select the area of the Brightfield channel for the X-Axis feature. Choose the aspect ratio for the Y-Axis feature.Draw a gate on the scatterplot using the Create Rectangle button based on the area value for the aggregate events population. Similarly, draw another gate for the singles and small aggregates population. Save your data analysis as a template by clicking the File tab, choosing Save As Template ast, and then open the next sample file under the same template to create the data analysis file.To measure the aggregate size distribution, start by plotting a histogram of the area of the aggregation events population. Save the data analysis by clicking on the file and selecting the Save As Template option. After saving, open the next sample file under the same template for the data analysis file.Single cells, small aggregates, large aggregates, and chains were observed in LGG and L.paracasei but it was not possible to distinguish between chains and larger aggregates. Significant variations in the aggregation characteristics of different LAB strains were observed in response to fermentable or non-fermentable sugars.